Трубочка упражнение: трубочка, дудочка, заборчик. Как играть? — yarik42.ru

Содержание

Логопедия для чайников | УЧЕБНЫЙ ЦЕНТР ЛОГОПЕД МАСТЕР

Артикуляционная гимнастика

Перед началом артикуляционной гимнастики желательно провести самомассаж лица.

Регулярное выполнение артикуляционной гимнастики поможет:
• Улучить кровоснабжение артикуляторных органов,
• Укрепить мышечную систему языка, губ, щек
• Научить ребенка удерживать определенную артикулятрную позу, увеличить амплитуду движений, уменьшить спастичность (напряженность) органов артикуляции.

Артикуляционную гимнастику лучше выполнять сидя перед зеркалом, чтобы визуально контролировать выполнение упражнений. Здесь мы приводим комплекс универсальных упражнений для губ и языка, которые выполняются при нарушении основных групп звуков. Гимнастика в структуре логопедического занятия не должна занимать много времени. На этапе подготовки к постановке звуков – это может быть и половина занятия. В случаях, когда у ребенка дизартрия или ринолалия, обязательно проводите логопедический массаж и дыхательные упражнения.

1. «Улыбка» («заборчик»)

Улыбнуться без напряжения, чтобы были видны передние верхние и нижниу зубы. Удерживать 5-10 секунд. Следить, чтобы при улыбке губы не подворачивались внутрь.

2. «Трубочка» («хоботок»)

Вытянуть сомкнутые губы вперед. Удерживать их в таком положении под счет от 1 до 5-10. Если ребенок не может самостоятельно произвольно вытянуть губы, можно предложить ему дотянуться губками до конфеты. Можно пропеть вместе с ребенком звук У. В дальнейшем можно чередовать упражнения 1 и 2

3. «Домик открывается»(«бегемотик)

Слегка улыбнуться, медленно открыть рот, подержать рот открытым 5-10 секунд, медленно закрыть. Язык лежит спокойно за зубами или на на нижней губе.4. «Любопытный язычок»

Улыбнуться, слегка приоткрыть рот и производить движения языком вперед-назад. Широкий язык положить на нижнюю губу – убрать. Рот остается все время открытым. Упражнение сделать 8-10 раз

4. «Язык здоровается с подбородком»

Улыбнуться, приоткрыть рот и широким языком потянуться вниз к подбородку. Проделать упражнение 5-10 раз

5. «Язык здоровается с верхней губой»

Слегка улыбнуться, приоткрыть рот, положить широкий край языка на верхнюю губу (при укороченной уздечке во время выполнения этого упражнения следует проглаживать язычок шпателем по направлению от уздечки к кончику по нижней стороне языка)
0.$SITE_ROOT.$desktop_siteRoot.$PAGES_CONTAINER.1.1.$SITE_PAGES.$fvsw6.1.$comp-ihw2ulzx.0.$dataItem-ihw1k9zc.1.0.1.1″/> В дальнейшем можно чередовать упражнения 5-6: «качели».

6. «Обезьянка»

Чуть приоткрыть рот и поместить язык между нижней губой и нижними зубами. Губы при этом сближены. Удерживать в таком положении в течение 5 секунд

7. «Бульдог»

Из положения «обезьянка» перевести язык в положение между верхней губой и верхними зубами. Губы сближены. Удерживать 5 секунд

8. «Хомяк»

Рот закрыт. Язык поочередно упирается в правую и левую щеки, оставаясь в каждом положении по 3-5 секунд.

9. «Кружок»

Рот закрыт. Язык движется с внутренней стороны , плавно очерчивая кончиком языка круг («бульдог» -правая щека – «обезьянка «– левая щека и т. д., потом в обратную сторону). Выполнять по 5-6 кругов в каждую сторону.

10. «Накажем непослушный язычок»

Улыбнуться, приоткрыть рот, спокойно положить язык на нижнюю губу, пошлепывая его губами, произносить: Пя-пя-пя-пя..» . Легче всего пошлепать кончик, потом шлепайте серединку языка. Медленно двигайте язык вперед – назад. Упражнение хорошо снимает излишнее напряжение языка.

11.

«Чистим зубы снаружи»

Улыбнуться, приоткрыть рот, показать зубы и широким языком провести с наружной стороны верхних зубов, имитируя чистящие движения зубной щетки. Также «чистим и нижние зубы. Выполнять каждое упражнение по 3-5 раз

12. «Покусаем язычок»

Улыбнуться, приоткрыть рот, покусать кончик языка. Можно усложнить упражнение одновременно покусывая язык и продвигая его вперед-назад. Это упражнение хорошо снимает излишнее напряжение языка.

13. «Лопаточка»

Улыбнуться, приоткрыть рот, положить широкий передний край языка на нижнюю губу. Удерживать в таком положении под счет от 1 до 5-10.

1.1.$SITE_PAGES.$fvsw6.1.$comp-ihw2ulzx.0.$dataItem-ihw2czzx.1.0.0″>14. «Дуем на лопаточку»

Вывести язык в положение «Лопаточка» и подуть в небольшую бутылочку, на вертушку или кусочек ваты. Модно «порисовать» зондом для постановки свистящих звуков желобок по центру языка. Упражнение хорошо готовит язык к постановке свистящих звуков. Его следует выполнять после того, как получилась «лопаточка»

15. «Горка» («мостик»)

16. «Ветерок дует с горки»

Поставить язычок в положение «горка» , а потом спокойно иплавно подуть по середине языка. Воздух должен быть холодным. Если, не меняя положение языка, прикрыть рот, оставив между зубами небольшую щелку и подуть, то у ребенка может получиться звук С. (не показывайте образец!)

$fvsw6.1.$comp-ihw2ulzx.0.$dataItem-ihw3eds9.1.0.0″>17. «Чистим нижние зубки» (с внутренней стороны)

Улыбнуться, показать зубы, прикрыть рот и кончиком языка «почистить» нижние зубы с внутренней стороны. Двигая язычком из стороны в сторону, следите, чтобы он находился у десен. Упражнение полезно при межзубном сигматизме. При этом полезно использовать вестибулярную пластинку с заслонкой

18. «Катушка»

Улыбнуться, открыть рот. Кончик языка упирается в нижние зубы с внутренней стороны («горка»). Широкий язык «выкатывать» вперед и убирать вглубь рта (качать горку). Упражнение повторить 8-10 раз в спокойном темпе. Рекомендуют при подготовке языка к постановке свистящих звуков.

19. «Жуем блинчик»

Улыбнуться, открыть рот. Кончик языка упирается в нижние зубы с внутренней стороны («горка»). Выдвинуть язычок в положение «катушка» и покусать свернутый язык. Выполнять 10-15 раз. Полезно для подготовки языка к постановке С.

20. «Чашечка»

Улыбнуться, открыть рот и установить язык наверху в форме чашки. Если «чашка» не получается, то надо продолжать делать упражнение 10 «Накажем непослушный язычок». Во время выполнения этого упражнения рекомендуется помогать ребенку поднимать язык при помощи шпателя или пальца. Удерживать в положении «чашечка» в течение 5-10 секунд. Рекомендуется в период подготовки языка к постановке шипящих и соноров

21. «Вкусное варенье»

Улыбнуться, открыть рот и языком в форме «чашечки» облизать верхнюю губу. Движения направлены сверху вниз. Можно продолжить движение и убрать язык в рот, не разрушая «чашечки». Нужно следить за тем, чтобы нижняя челюсть во время этого упражнения была неподвижна. Упражнение помогает в подготовке к постановке шипящих и соноров.

22. «Ступеньки»

(чередование: «чашечка» на верхней губе, «чашечка» на верхних зубах, «чашечка» внутри рта за зубами. В каждой позе держим язык по 3-5 секунд.

23. «Фокус»

Поднять язык в положение «чашечка» и плавно подуть на кончик носа. Можно на кончик носа положить кусочек ваты. Во время дутья он улетит точно вверх. Упражнение отлично помогает научиться говорить шипящие и соноры.

$desktop_siteRoot.$PAGES_CONTAINER.1.1.$SITE_PAGES.$fvsw6.1.$comp-ihw2ulzx.0.$dataItem-ihw3kf541.1.0.0″>24. «Не разбей чашечку»

Придать языку форму «чашечки» и двигать его вперед и назад, сохраняя форму «чашечки» Удерживать в каждой фазе язык по 3-5 секунд.

25. «Чистим верхние зубы» (с внутренней стороны)

Улыбнуться, открыть рот и широким языком «почистить» верхние зубы с внутренней стороны, делая движение из стороны в сторону. Кончик языка двигается у верхних альвеол. Упражнение хорошо вырабатывает подъем языка вверх для шипящих и соноров

26. «Маляр»

Улыбнуться, открыть рот и «покрасить» кончиком языка твердое небо («потолок») делая движения языком вперед- назад, поглаживая небо

0.$SITE_ROOT.$desktop_siteRoot.$PAGES_CONTAINER.1.1.$SITE_PAGES.$fvsw6.1.$comp-ihw2ulzx.0.$dataItem-ihw3ytu2.1.0.0″>27. «Барабанщик»

Улыбнуться, открыть рот, поставить язычок за верхние зубы, звонко, отчетливо, многократно повторять : «Д-Д-Д…». Темп постепенно убыстрять, зубы не сближать. Потом добавить движение ватной палочкой, шариковым зондом или пальчиком поперек языка – получим звук, отдаленно напоминающий Р

28. «Лошадка»

Улыбнуться, широко открыть рот пощелкать кончиком языка наверху. Ускоряем темп. Следить за тем, чтобы нижняя челюсть не двигалась.

29. «Грибок»

Улыбнуться, присосать язык к небу, чтобы подъязычная связка натянулась («ножка гриба»). Удерживать в таком положении язык в течение 5-10 минут. Если так сделать не удается, то вернитесь к упражнению «лошадка». Упражнение направлено на растягивание подъязычной уздечки.

30. «Гармошка»

Выполнять это упражнение можно после того, как удается удержать язык в положении «грибок» . В положении «грибок» открывать и закрывать рот (как растягиваются меха гармошки). Упражнение хорошо растягивает подъязычную связку.

31. «Кучер»

Сомкнуть губы и сильно подуть через них. Губы вибрируют и слышится характерный звук «тпру». Вариант: положить между губ широкий край языка и подуть. Язык будет вибрировать вместе с губами. Наденьте маску. Ребенок здорово плюется во время выполнения этого, подготовительного к звуку Р, упражнения.

0.$SITE_ROOT.$desktop_siteRoot.$PAGES_CONTAINER.1.1.$SITE_PAGES.$fvsw6.1.$comp-ihw2ulzx.0.$dataItem-ihw94mtk.1.0.0″>32. «Иголочка»

Открыть рот, язык высунуть как можно дальше, напрячь его, сделать узким и удерживать в таком положении под счет до 10

33. «Маятник»

Язык выдвинуть изо рта в положение «иголочка» и подвигать им из стороны в сторону с большой амплитудой. Проделать 10-15 раз. Нижняя челюсть не двигается вместе с языком! Язык не касается нижней губы

34. «Индюк» («болтушка»)

Улыбнуться, показать зубы, приоткрыть рот, положить широкий язык на верхнюю губу и производить быстрые движения кончиком языка по верхней губе вперед – назад, стараясь не отрывать язык от верхней губы. Потом включить голос. Получится смешная «болтушка» (звук похожий на «бл-бл…»

35. «Качели»

Улыбнуться, показать зубы, приоткрыть рот, положить широкий язык за нижние зубы (с внутренней стороны) и удерживать в таком положении 3-5 секунд. Потом поднять широкий язык за верхние зубы (с внутренней стороны) и удерживать 3- секунд. Так поочередно меняем положение языка 5-6 раз «качаем язычок» . Упражнение полезно делать при работе над шипящими и свистящими звуками

36. «Пароход»

Улыбнуться, поставить язык между зубами, закусить его и петь: « ЫЫЫЫ». Получится звук, очень похожий на Л. Не показывайте образец! Это упражнение является базовым для постановки звука Л.

Артикуляционная гимнастика

Многих родителей волнует проблема правильного произношения звуков речи ребенка. Для того, чтобы детская речь была внятной, четкой и понятной другим людям, необходимо работать над развитием мышц артикуляционного аппарата. Существуют специальные упражнения для развития подвижности, ловкости языка, губ, щек, подъязычной уздечки, которые называются артикуляционной гимнастикой.

Ниже представлен общий комплекс артикуляционной гимнастики.

При выполнении упражнений артикуляционной гимнастики следует помнить:

1.Необходимо соблюдать определенную последовательность – от простых упражнений к более сложным.

2.На начальном этапе упражнения выполняются в медленном темпе и перед зеркалом.

3. Количество повторов каждого упражнения от 2 до 15 раз. Главное, чтобы упражнение выполнялось правильно.

4.Зеркало можно убрать, когда ребенок научится правильно выполнять движения.

5.Выполняйте рекомендованный логопедом комплекс артикуляционной гимнастики каждый день.

6.Если для ребенка утомительно выполнять все упражнения подряд, можно разбить гимнастику на блоки и выполнять их в течение дня.

7.Можно использовать механическую помощь, если у ребенка не получится какое-либо движение. Ручкой чайной ложки или чистым пальцем можно помочь ребенку принять нужное положение языка.

8.Занятия дадут наилучший результат, если они проводятся в игровой форме.

9. По окончанию гимнастики обязательно похвалите ребёнка.

Основной комплекс артикуляционной гимнастики

1. УЛЫБКА Выполнение. Улыбнуться, с напряжением обнажив сомкнутые зубы. Удерживать данное положение под счёт до 5. Выполнять 6 – 8 раз. Методические указания. Прикус должен быть естественным. 2. Нижняя челюсть не должна выдвигаться вперёд.
2. ТРУБОЧКА Выполнение. Зубы сомкнуты. Губы с напряжением вытянуть вперёд трубочкой. Удерживать данное положение под счёт до 5. Выполнять 6 – 8 раз. Методические указания: следить, чтобы ребёнок удерживал губы в заданном положении, не расслабляя их раньше времени.
3. УЛЫБОЧКА – ТРУБОЧКА Выполнение. Поочерёдное выполнение упражнений «Улыбочка» и «Трубочка» (8 — 10 раз). По указанию взрослого («Улыбочка» — «Трубочка» — «Улыбочка» — «Трубочка» и т. д.) ребёнок выполняет соответствующее упражнение.
4. ЛОПАТОЧКА Выполнение. Слегка улыбнуться, приоткрыть рот. Широкий спокойный язык положить на нижнюю губу. Удерживать в таком положении под счёт до 5-10. Выполнять 6 – 8 раз. Методические указания. 1. Язык должен быть расслабленным, широким, его края должны касаться углов рта. 2. Нижняя губа не должна подворачиваться или натягиваться на нижние зубы. 3. Не высовывать язык далеко, он должен только прикрывать нижнюю губу.
5. ИГОЛОЧКА Выполнение. Приоткрыть рот, слегка высунуть язык изо рта. Сделать его узким («как иголочка»), удерживать в таком положении под счёт до 5-10. Методические указания. 1. Следить, чтобы язык был узким; его края не должны касаться углов рта. 2. Стараться удерживать язык в спокойном состоянии.
6. ЛОПАТОЧКА – ИГОЛОЧКА Выполнение. Поочерёдное выполнение упражнений «Лопаточка» и «Иголочка» (8 – 10 раз). По указанию взрослого («Лопаточка» — «Иголочка» — «Лопаточка» — «Иголочка» — … и т.д.) ребёнок выполняет соответствующее упражнение.
7. ЧАСИКИ Выполнение. Улыбнуться, приоткрыть рот, высунуть язык. На счёт «раз – два» переводить язык из одного угла рта в другой. Методические указания. 1. Нижняя челюсть должна оставаться неподвижной. 2. Темп выполнения не должен быть быстрым.
8. КАЧЕЛИ Выполнение. Приоткрыть рот, высунуть широкий язык. По указанию взрослого («вверх» — «вниз» — «вверх» — «вниз» — … и т.д.) ребёнок должен поочерёдно поднимать язык вверх и опускать вниз, тянуться то к носу, то к подбородку. Методические указания. 1. Нижняя челюсть должна оставаться неподвижной. 2. Следить, чтобы при подъёме языка рот был приоткрыт, нижняя губа не подталкивала язык вверх.
9. ПОЧИСТИ ЗУБКИ Выполнение. Улыбнуться, приоткрыть рот. Кончиком языка «почистить» сначала нижние, затем верхние зубы с внутренней стороны, делая движения языком вправо – влево. Выполнять 5 – 6 раз. Методические указания. 1. Язык находится с внутренней стороны зубов, не высовывается из ротовой полости. 2. Нижняя челюсть неподвижна. 3. Темп выполнения не должен быть быстрым.
10. МАЛЯР Выполнение. Улыбнуться, открыть рот. Широким кончиком языка погладить нёбо от зубов к горлу. Выполнять 8 – 10 раз. Методические указания. 1. Следить. Чтобы язык был широким. 2. Нижняя челюсть неподвижна. 3. Нижняя губа не должна натягиваться на нижнюю челюсть.
11. КИСКА СЕРДИТСЯ Выполнение. Улыбнуться, открыть рот. Кончиком языка упереться в нижние зубы (с внутренней стороны). На счёт «раз» — выгнуть язык горкой («как киска выгибает спинку, когда сердится»), упираясь в нижние зубы. На счёт «два» — вернуться в исходное положение. Выполнять 6 – 8 раз. Методические указания. 1. Кончик языка не отрывается от нижних зубов. 2. Рот не должен закрываться.
12. ЛОШАДКА Выполнение. Приоткрыть рот и пощёлкать кончиком языка («как лошадка цокает копытами»). Упражнение выполняется сначала медленно, затем темп выполнения постепенно увеличивается. Выполнять 10 – 20 раз. Методические указания. Нижняя челюсть неподвижна, работает только язык. 2. Кончик языка не должен быть вытянут и заострён. 3. Следить, чтобы кончик языка не подворачивался внутрь, т.е. чтобы ребёнок щёлкал языком, а не чмокал.
13. ГРИБОК Выполнение. Улыбнуться, открыть рот. Присосать широкий язык к нёбу (это шляпка грибка, а подъязычная уздечка – ножка). Держать под счёт до 3-10 (время выполнения увеличивать постепенно), выполнять 3 – 4 раза. Методические указания. 1. Губы должны быть в улыбке. 2. Кончик языка не должен подворачиваться. 3. Если ребёнку не удаётся присосать язык, то можно пощёлкать языком, как в упражнении «Лошадка».
14. ГАРМОШКА Выполнение. Улыбнуться, открыть рот, присосать язык к нёбу (как в упражнении «Грибок»). Не отрывая языка, закрывать и открывать рот. Выполнять под счёт до 3 – 10 (время выполнения увеличивать постепенно). Со временем стараться открывать рот всё шире и всё дольше удерживать язык вверху. Методические указания. 1. Губы должны быть в положении улыбки. 2. Когда открывается рот, следить, чтобы губы были неподвижны.
15. ДЯТЕЛ Выполнение. Улыбнуться, открыть рот. Кончик языка поставить на бугорки за верхними зубами. Ударять кончиком языка по бугоркам («как дятел стучит по дереву»), при этом будет слышатся звук, близкий к звуку «д». Сначала упражнение выполнять медленно, постепенно убыстряя темп. Методические указания. 1.Рот должен быть всё время приоткрыт, губы в улыбке, нижняя челюсть неподвижна; работает только язык. 2. Ударять языком надо именно по бугоркам, а не по верхним зубам. 3. Следить, чтобы звук «д» носил характер чёткого удара, а не хлюпал. 4. Кончик языка не должен подворачиваться.

Сафонова Е.Г., учитель-логопед

Алтайского краевого центра ППМС-помощи

Использованная литература:

Краузе Е. Н. Логопедический массаж и артикуляционная гимнастика. Практическое пособие. Корона-Принт, 2014 г.

Артикуляционная гимнастика. ПРАКТИКА ежедневных занятий для дислексика.

Внятная разборчивая речь —
залог успешной КОММУНИКАЦИИ.

В основе грамотного письма лежит твоя способность к проговариванию слов и предложений. Для чёткого проговаривания звуков, из которых состоит слово, необходимо, чтобы твой артикуляционный аппарат был достаточно подвижен и мог быстро принимать определенное положение — артикуляционную позу.

Для развития и совершенствования работы
артикуляционного аппарата необходимо
ежедневно заниматься артикуляционной гимнастикой.

Выполняется артикуляционная гимнастика, сидя или стоя перед зеркалом. Темп выполнения и количество упражнений постепенно увеличивается.

Базовые упражнения для эффективного развития мышц артикуляционного аппарата: «Трубочка», «Улыбка», «Ворота», «Лопатка», «Иголочка», «Часики», «Качели».

Упражнения для губ

Улыбка. Улыбнись без напряжения, так чтобы обнажились передние верхние и нижние зубы, про себя произнеси звук «И». Удерживай артикуляционную позу на счет от 1 до 5. Усложнить упражнение — продлить счет до десяти.

Трубочка. Сомкнутые губы тебе надо вытянуть вперед трубочкой, про себя произнеси звук «У». Удерживай артикуляционную позу на счет от 1 до 5. Усложнить упражнение — продлить счет до десяти.

Чередование поз Улыбка — Трубочка. Данное упражнение позволит тебе разбудить свой артикуляционный аппарат!

Упражнения для нижней челюсти

Ворота. 1. Улыбнись без напряжения, так чтобы обнажились передние верхние и нижние зубы, про себя произнеси звук «И». 2. Опусти нижнюю челюсть и держи рот раскрытым на счет от 1 до 5. Усложнить упражнение — продлить счет до десяти.

Заборчик. Верхняя челюсть стоит на нижней, губы растянуты в улыбке. Удерживай артикуляционную позу на счет от 1 до 5. Усложнить упражнение — продлить счет до десяти.

Упражнения для языка

Рот раскрыт, губы растянуты в улыбке, нижняя челюсть НЕПОДВИЖНА.
Часики: движения языком вправо — влево.

Качели: движения языком вверх — вниз.

Болтушка: движения языком вперед — назад.

Лопатка: широкий расслабленный язык лежит на нижней губе.

Иголочка: язык узкий, напряженный вытянут вперед.

Чередование поз Лопатка — Иголочка. Данное упражнение позволит тебе разбудить твой язык!

Постоянная тренировка мышц артикуляционного аппарата сделает твою речь чёткой, быстрой, красивой и приятной для окружающих.

Артикуляционная гимнастика: как научиться говорить четко?

В основе красивой, правильной речи лежит отчетливое и уверенное произношение звуков. А за него, в свою очередь, отвечают артикуляционные органы: гортань, голосовые связки, язык, нёбо, губы.

Когда у ребенка или у взрослого возникают сложности с произношением тех или иных звуков, на помощь приходит артикуляционная гимнастика. Мышцы речевого аппарата укрепляются, и дефекты уходят.

Чаще всего такую гимнастику прописывают детям, которым необходимо развить артикуляционный аппарат. Но многие упражнения полезны и для взрослых. Если вы хотите обучиться ораторскому искусству, уверенно выступать на публике или просто развить красноречие, возьмите артикуляционную гимнастику на заметку!

Упражнений для красивой речи очень много, мы предлагаем начать с некоторых базовых. Для достижения хорошего результата выполняйте этот комплекс хотя бы 1 раз в день, а лучше 2-3 раза. На начальном этапе рекомендуется использовать зеркало.

Упражнение 1. «Окошко»

Улыбнитесь и широко откройте рот, чтобы были видны верхние и нижние зубы. Расслабленный язык придвиньте вплотную к нижним зубам. Удерживайте позицию, обращая внимание на ровное положение языка.

Цель: активизировать круговую мышцу рта и подвижность верхней губы. Научиться опускать корень языка.

Упражнение 2. «Забор»

Максимально широко улыбнитесь, показав верхние и нижние зубы. Челюсти должны быть сомкнуты и находиться ровно друг напротив друга. Задержите положение.

Цель: подготовить артикуляцию для свистящих звуков.

Упражнение 3. «Трубочка»

Вытяните губы вперед, максимально плотно сомкнув. Задержите положение. Следите, чтобы не опускалась нижняя челюсть. После этого упражнения чередуйте «Трубочку» и «Забор» несколько раз.

Цель: выработать подвижность губ.

Упражнение 4. «Лопатка»

Улыбнитесь и откройте рот, положите широкий расслабленный кончик языка на нижнюю губу. Следите, чтобы язык лежал ровно. Чтобы «сделать» язык широким, можно слегка пошлепать его губами.

Цель: умение удерживать язык в распластанном положении.

Упражнение 5. «Иголочка»

Улыбнитесь и откройте рот. Напрягите язык и удерживайте его в узком положении между верхней и нижней челюстями. Постарайтесь не касаться языком зубов и не отклонять его в сторону. После статического упражнения чередуйте «Иголочку» и «Лопатку» несколько раз.

Цель: умение удерживать язык узким.

Упражнение 6. «Качели»

Из положения «Забор» откройте рот. Зафиксируйте нижнюю челюсть. Поочередно упирайтесь «широким» языком то в верхние резцы, то в нижние.

Цель: укрепление мышц языка, быстрая смена его положения, правильное произношение звуков: р, л, ш.

Статические упражнения выполняйте 10-15 секунд. Упражнения на повторения ребенку можно делать 5-7 раз, а взрослому побольше. Важна правильная техника!

При наличии серьезных дефектов речи рекомендуем обратиться к логопеду, чтобы подобрать индивидуальный комплекс упражнений.

Дыхательная гимнастика

С детьми проводят дыхательную гимнастику, используя игровые приёмы.

«Кораблики» Ребёнку предлагается широкая ёмкость с водой, а в ней бумажные «кораблики», которыми могут быть просто кусочки бумаги. Ребёнок, медленно вдыхая, направляет воздушную струю на «кораблик», подгоняя его другому «берегу».
«Снег и ветер» Из маленьких кусочков ваты скатываются небольшие шарики—«снег»— и выкладываются на столе. Ребёнку предлагают дуть на «снег», как холодный зимний ветер. При этом «комья снега» должны медленно передвигаться к противоположному краю стола.
«Кто спрятался?» На предметную картинку размером с четверть альбомного листа наклеиваем с одного края гофрированную бумагу, изрезанную бахромкой. Получается, что картинка находится под тоненькими полосочками гофрированной бумаги. Ребёнку предлагается дуть на бумажную бахромку, пока она не поднимется, и не станет видно картинку.
«Пузырьки» Это игра, которую почти все родители считают баловством, и не разрешают детям в неё играть. На самом деле, она является дыхательным упражнением и очень проста в использовании. Нужна лишь трубочка-соломинка и стакан воды. Обращаем внимание ребёнка на то, чтобы выдох был длительным, то есть пузырьки должны быть долго.
«Дудочка» Используем всевозможные свистки, детские музыкальные инструменты, колпачки от ручек. Дуем в них.
«Фокус» Это упражнение с кусочком ваты, которое подготавливает к произнесению звука [р]. Вата кладётся на кончик носа. Ребёнку предлагается вытянуть язык, загнуть его кончик вверх и подуть на ватку, чтобы сдуть её с носа.
«Свеча» Ребёнку предлагается дуть на огонёк горящей свечи так, чтобы не задуть её, а лишь немного отклонить пламя. Дуть нужно долго, аккуратно, потихоньку.
«Деревья» Упражнение аналогично упражнению «Кто спрятался?» Наглядный материал в виде деревьев изготавливается из гофрированной бумаги (крона дерева), на которую предлагается дуть.
«Греем руки» Ребёнку предлагается контролировать выдох ладошками – дуем на ладошки. Это же упражнение используем при постановке свистящих и шипящих звуков. Ребёнок ладошкой контролирует правильность своего произношения. Если «ветерок» холодный, «зимний», значит звук [с] произносится правильно. При произнесении звука [ш] «ветерок» тёплый, «летний», ладошки греются.

Упражнением для развития подвижности нижней челюсти, а также для устранения саливации (излишнего слюноотделения), являются жевательные движения. Чтобы побудить ребёнка совершать их, можно предложить ему игру «Корова» (жуём траву, как корова). Нижняя челюсть также задействуется в «Весёлой зарядке» С. и Е.Железновых, когда детям под песенку предлагается стучать зубами:

Головами покиваем,
Носиками помотаем,
И зубами постучим,
И немножко помолчим.
Плечиками мы покрутим,
И про ручки не забудем,
Пальчиками потрясём
И сначала всё начнём.

Игровая дыхательная гимнастика

Дыхательная гимнастика с использованием игровых приёмов

Футбол

Постройте для этой игры ворота (их можно соорудить самим из любого конструктора или другого материала, а можно купить набор для игры в футбол, например в этом магазине http://www.igrocity.ru/gift.php?kod_groop=logoped&kod=166842).

Также для игры понадобится легкий пластмассовый шарик, например для пинг-понга. Предложите ребенку сыграть в футбол. Ребенок сидит за столом. Взрослый кладет перед ним на стол шарик. Ребенок должен дуть на шарик, стараясь загнать его в ворота. Покажите ребенку, как можно с силой подуть на шарик, чтобы он попал в ворота, затем предложите ребенку подуть на шарик самостоятельно: — Подуй на шарик, попади в ворота. Забей гол!

Бульки

Подготовьте для игры стакан с водой (наполнен наполовину) и коктейльные трубочки — разного диаметра. Взрослый опускает в стакан с водой трубочку и дует в нее — пузыри с громким бульканьем будут подниматься на поверхность. Затем взрослый дает трубочку ребенку и предлагает подуть:

— Давай сделаем веселые бульки! Возьми трубочку и подуй в стакан воды. Если дуть слабо — получаются маленькие бульки. А если подуть сильно, то получается целая буря! Давай устроим бурю!

По «буре» в воде можно легко оценить силу выдоха и его длительность. В начале занятий диаметр трубочки должен составлять 5–6 мм, в дальнейшем можно использовать более узкие трубочки.

Внимание! Обратите внимание на сложности, которые могут возникнуть в ходе этой игры!

Многие дети, которые привыкли пить сок из пакетиков через трубочку, не сразу понимают, что от них требуется, могут начать пить воду (поэтому на всякий случай лучше использовать питьевую воду). В этом случае сначала предложите подуть через трубочку на кусочек ватки на столе или на ладошку, чтобы почувствовать выходящий из трубочки воздух. Другая из возможных проблем — ребенок начинает грызть мягкую трубочку или перегибает ее пополам. В этом случае можно использовать не коктейльную трубочку, а корпус гелевой ручки — прозрачную трубочку из твердой пластмассы. Если ребенок, держа трубочку в губах, выдыхет воздух через нос, следует аккуратно зажать нос малыша пальцами и предложить подуть снова.

Расти пена!

Для игры подготовьте стакан с водой, коктейльные трубочки разного диаметра, жидкость для мытья посуды.

Внимание! Эту игру можно предложить ребенку после того, как он научатся хорошо дуть через трубочку в стакан с водой (не пьет воду, не перегибает трубочку).

Взрослый добавляет в воду немного жидкости для мытья посуды, затем берет коктейльную трубочку и дует в воду — с громким бульканьем на глазах у ребенка вырастет облако переливающихся пузырей:

— Сейчас я устрою фокус-покус! Беру жидкость для посуды и капаю в воду… Теперь помешаю. .. Беру трубочку и дую. Смотри, что получилось! Это пена из маленьких и больших пузырьков! Теперь ты попробуй подуть.

Затем взрослый предлагает подуть ребенку. Когда пены станет много, можно подуть на нее.

Задуй свечу!

Для этой игры нужна свеча с устойчивым основанием или установленная на надежном подсвечнике. Перед началом игры объясните ребенку, что придвигаться к свече слишком близко не следует, свечу нельзя трогать и тем более опрокидывать, внимательно следите за выполнением этих правил в течение всей игры.

Вначале ставьте свечу на столе на расстоянии около 30 см от ребенка, сидящего за столом (постепенно расстояние от ребенка до свечи можно увеличивать до 40–50 см). Чтобы было интереснее, свечу можно зажечь в полутемной комнате. Предложите малышу сначала полюбоваться на пламя, а затем задуть свечу.

Обратите внимание: часто малыш, делая правильный выдох, не может верно направить струю выдыхаемого воздуха — она проходит мимо пламени свечи. В этом случае полезно для наглядности предложить подуть на свечу через трубу, сделанную из листа плотной бумаги (диаметр 3–4 см), т.к. с помощью трубы можно зрительно контролировать направление выдыхаемого воздуха.

Дудочка

Для игры понадобится дудочка. Дайте малышу дудочку и предложите поиграть на ней (Лучше если вы продемонстрируете, как это делать):

— Давай поиграем на дудочке. У нас получился настоящий концерт!

Если у малыша не получается извлечь из дудочки звук, проследите, правильно ли он дует: выдох через рот должен быть сильным и попадать точно в раструб трубы, для чего его необходимо плотно зажать губами, воздух не должен выходить через нос.

Если же у малыша пока не получается извлечь из дудочки звуки, не настаивайте, вернитесь к этому заданию позже, когда ребенок немного подрастет.

Как восстановить легкие после перенесенного коронавируса

Даже те, кто болел коронавирусной инфекцией нетяжело и избежал попадания в стационар, говорят, что заболевание не проходит бесследно: долго держится одышка, а кто-то жалуется, что при дыхании слышатся хрипы, похожие на хруст скомканной бумаги. Как восстановиться быстрее, как избежать осложнений? Советы читателям «РГ» дала пульмонолог Пироговского центра (КДЦ «Арбатский») Ольга Богуш.

— COVID-19 протекает по-разному. У пациентов, которые болели в легкой или бессимптомной форме, последствий чаще всего не возникает. Если же больному ставился диагноз двусторонней пневмонии, вызванной коронавирусом, если было поражено более 25% легких, есть риск возникновения фиброза. Фиброз — это замещение нормальной легочной ткани соединительной. В легком возникают рубцы, формируются нерастяжимые участки, уменьшается дыхательная поверхность. Если возникает 2-3 таких участка и они невелики, пациент этого может и не заметить. Но если фиброз большой, начинаются проблемы с дыханием. Самый частый признак — одышка. Фиброз возникает не только под влиянием вирусной инфекции. Хронической обструктивной болезнью легких, например, страдают многие курильщики со стажем. В тяжелых случаях это приводит к дыхательной недостаточности. Бороться за возвращение здоровья легких можно и нужно. В основе лежит физическая реабилитация. К сожалению, у нас нет специальных медикаментов, каких-то особых технологий, помогающих легким работать так же, как до болезни. Например, популярный сейчас витамин D от COVID-19 и его последствий не защищает. Легочная ткань должна восстанавливаться сама, а наша задача — ей помочь. Основное, что может сделать человек дома, — заниматься своим физическим восстановлением.

Прежде всего это дыхательная гимнастика. Нужно выполнять упражнения, направленные на восстановление дыхательной мускулатуры, развивать мышцы, которые отвечают за вдох и выдох. Таких практик много. Своим пациентам я рекомендую гимнастику Александры Стрельниковой, она хорошо работает при любых хронических заболеваниях легких. В рекомендациях минздрава по реабилитации указано, что можно практиковать йоговское дыхание. Интересно, что эти дыхательные практики очень отличаются, но на состоянии легких хорошо сказываются и та, и другая. Ну и, конечно, ограничиваться только дыхательными упражнениями можно, пока сохраняется сильная слабость. Гимнастику Стрельниковой, кстати, можно выполнять сначала и сидя и даже лежа — она все равно работает. Когда сохраняется сильная слабость, можно даже лежа делать совсем простые вещи: например, надувать шарики или медленно выдыхать через тонкую трубочку, конец которой опущен в воду. Есть специальные тренажеры, которые тренируют вдох-выдох — они красивые, полезные. Хотя и довольно дорогие. Думаю, вполне можно обойтись и без них — просто использовать подручные средства и не лениться. Но постепенно, окрепнув, нужно обязательно добавить физической активности.

Обычная гимнастика — это уже хорошо. Если дома есть тренажер — степпер, шаговая дорожка, велосипед, — это замечательно. Но даже просто обычная ходьба, махи руками, наклоны туловища и другие элементарные упражнения помогут восстановиться быстрее.

Когда закончится карантинный режим и можно будет гулять, нужно добавить любую физическую активность на свежем воздухе. Поначалу я бы рекомендовала аэробные нагрузки — неинтенсивные, но продолжительностью не менее получаса-часа. Самое простое и безопасное — ходьба в бодром темпе, можно велосипед. Подключить силовые упражнения можно будет позже, когда организм восстановится после болезни. Хорошо также выполнять вибрационный массаж: попросите кого-нибудь легко похлопать ладошками по спине несколько минут.

Инфографика «РГ» / Леонид Кулешов / Ирина Невинная

Ремоделирование поперечных канальцев усиливает Orai1-зависимое поступление Ca2 + в скелетные мышцы

[Примечание редакции: далее следует план авторов по внесению исправлений.]

Все три рецензента считали рукопись важным продолжением вашей предыдущей работы над единицами входа мышечного кальция (CEU), которые образуются после тренировки. Динамика изменений в контактах SR-TT, SOCE, переходных процессах Ca ²⁺ и выработке силы после упражнений обеспечивает некоторую дополнительную поддержку идеи о том, что CEU участвуют в зависимых от упражнений эффектах на сократимость мышц.Однако, чтобы представить значительный прогресс по сравнению с предыдущей работой, все обозреватели согласились с тем, что необходимы дополнительные количественные экспериментальные данные, чтобы установить механистическую связь между увеличением SOCE и измененной функцией мышц.
Критический вопрос заключается в том, как увеличение SOCE приводит к усилению пиковых переходных процессов и силы Ca ²⁺. Увеличение SOCE не может напрямую объяснить это, потому что поток на порядки меньше, чем поток выброса СИ.

Мы благодарим редактора-рецензента и трех рецензентов за признание важности текущей работы в поддержку вывода о том, что единицы ввода кальция (CEU) участвуют в зависимом от упражнений влиянии на мышечную сократимость.Мы также ценим вопрос, поднятый относительно того, как увеличение SOCE после упражнений увеличивает пиковые переходные процессы Ca ²⁺ и силу во время повторяющейся стимуляции. Прежде чем описывать наш план решения этой проблемы, мы хотели бы повторить предысторию, мотивацию и цели текущего исследования. В нашем первоначальном отчете, описывающем формирование CEU в мышцах в результате упражнений (Boncompagni et al., 2017), сделан вывод, что CEU, сформированные после упражнений, усиливают SOCE, оптимизируя высвобождение Ca ²⁺ для производства мышечной силы во время повторяющейся стимуляции. Однако влияние CEU на высвобождение SOCE и Ca ²⁺ было основано на косвенных доказательствах (исследования ICC и иммуно-gold EM, показывающие, что упражнения увеличивают локализацию STIM1-Orai1 в CEU и выработку силы во время повторяющейся стимуляции). Прямых доказательств в поддержку роли CEU в продвижении Orai1-зависимого SOCE и высвобождения Ca ²⁺ не хватало. Таким образом, основной целью настоящего исследования было количественное определение Orai1-зависимого SOCE и переходных процессов миоплазматического кальция во время повторяющейся стимуляции в условиях, которые приводят к образованию и разборке CEU.EM-исследования (как в EDL, так и в FDB-мышцах) показали, что CEU формируются менее чем через 1 час после тренировки и что TT отводятся от CEU раньше, чем собираются SR-стопки. Мы воспользовались этим временным курсом для оценки изменений SOCE (гашение Mn), кальция (mag-fluo4) и силы (сократимость ex vivo EDL) в разное время во время сборки / разборки составных частей CEU. Наши результаты являются первым прямым доказательством того, что Orai1-зависимый SOCE и высвобождение Ca ²⁺ во время повторяющейся стимуляции увеличиваются, когда TT связаны со стеками SR.Неожиданно мы обнаружили, что острые упражнения также приводят к существенному конститутивному Orai1-зависимому SOCE (с величиной, аналогичной максимальной SOCE в контроле после полного истощения запасов). Эти данные предоставляют критически важные доказательства, подтверждающие утверждение о том, что острые упражнения способствуют формированию CEU для увеличения Orai1-зависимого SOCE, чтобы оптимизировать высвобождение Ca ²⁺ и сократимость мышц во время повторяющейся стимуляции.

Мы согласны с редактором и рецензентами в том, что следующий важный вопрос, который необходимо решить, — это объяснить, как увеличение SOCE после тренировки оптимизирует миоплазматический переходный процесс Ca ²⁺ во время повторяющейся стимуляции.Поскольку у нас не было прямых доказательств конкретного механизма, мы воздержались от размышлений об этом в разделе «Обсуждение» рукописи. Если бы была предоставлена возможность представить исправленную версию рукописи, мы были бы рады рассмотреть эти потенциальные механизмы и их значение в разделе «Обсуждение». Мы также инициировали новые эксперименты (описанные ниже) в надежде предоставить хотя бы некоторые доказательства в поддержку / исключение этих возможностей. В случае успеха мы готовы включить результаты этих исследований в исправленную версию рукописи.Однако, учитывая важность и масштаб результатов / вклада исследования, описанного выше (ни один из которых не был подвергнут сомнению в редакционном резюме комментариев рецензентов), мы надеемся, что публикация нашего исследования не будет неразрывно связана с предоставлением нами убедительных доказательств. за ответ на этот вопрос.

Мы планируем пересмотреть раздел «Обсуждение» рукописи, чтобы дать исчерпывающее описание потенциальных причин того, как усиление функции SOCE после интенсивной нагрузки может привести к усилению переходных процессов пика Ca ²⁺ во время повторяющейся стимуляции. Наше обсуждение будет включать каждый из трех вопросов, поднятых ниже редактором и рецензентами. При наличии достаточного времени мы также проводим серию экспериментов, описанных ниже, чтобы предоставить подтверждающие доказательства для одного или нескольких из этих объяснений.

Однако несколько неисключительных механизмов могут внести свой вклад:
1) Увеличение содержания SR Ca ²⁺, ведущее к увеличению потока высвобождения Ca ²⁺, может быть причиной, но несовместимо с сообщенным 25% снижением содержания.Метод, используемый для измерения общего содержания SR (коктейль высвобождения Ca ²⁺, содержащий иономицин), не является достаточно количественным и может также высвобождать Ca ²⁺ из других компартментов (например, митохондрий). Чтобы решить эту проблему, логометрический индикатор Ca ²⁺ должен быть нацелен на SR для прямого измерения содержания запаса во время стимуляции, а поток высвобождения Ca ²⁺ можно оценить по цитозольным переходным процессам, предполагая общепринятые параметры цитозольной буферизации.

Чтобы уточнить, наши измерения ~ 25% снижения общего содержания запаса Ca ²⁺ после острой нагрузки были проведены на не стимулированных волокнах в покое, тогда как увеличение высвобождения Ca ²⁺ во время повторяющейся высокочастотной стимуляции было наблюдается только после 8-10 последовательных сеансов стимуляции. Кроме того, увеличение пиковой амплитуды переходного процесса Ca ²⁺ в волокнах от тренированных мышей развивалось в течение времени каждого 500 мс стимула (т.е.е. пик был аналогичен в начале поезда, но больше к концу поезда — см. синюю кривую на Рисунке 5A, в середине). Таким образом, эволюция увеличения вызванного высвобождения Ca ²⁺ является динамичной, что делает измерения содержимого хранилища в устойчивом состоянии покоя несущественными. . Таким образом, одна из возможностей состоит в том, что в волокнах от тренированных мышей увеличенное SOCE во время каждой серии стимулов увеличивает запас Ca ²⁺, так что нагрузка Ca ²⁺ увеличивается до уровня, достаточного для увеличения потока Ca ²⁺ в течение 10 ^-й и последующие поезда. Мы планируем эксперименты, в которых мы будем измерять либо общий C Ca ²⁺ в магазине (с использованием иономицина / CPA / EGTA или ICE, как и раньше), либо просто RYR1-высвобождаемого содержимого магазина (с использованием 4-хлор-м-крезола) после доставки. 10 поездов стимулов. Поскольку продольные соединения SR (с SERCA) и CEU (с STIM1-Orai1) лежат вне триады и не имеют каналов высвобождения RYR1, мы ожидаем, что анализ ICE обеспечит более точную оценку влияния SOCE на общее количество Ca ^2+. магазин контента.Однако будет интересно посмотреть, увеличивается ли пул высвобождаемого RYR1 Ca ²⁺ после 10 столбняков в волокнах от тренированных мышей. Учитывая степень SR и количество SR Ca ²⁺ связывающих белков в скелетных мышцах, пиковая реакция ICE в экспериментах определяется Ca ²⁺ в компартменте SR. В соответствии с этим мы ранее использовали зависимые от Ca ²⁺ УФ-спектры поглощения BAPTA, чтобы показать, что подавляющее большинство (~ 80%) общего Ca ²⁺ в мышцах EDL находится в SR (Lambolay, et al. , J. Gen Physiol, 2015; прокомментировано Манно и Риосом, J Gen Physiol, 2015). Кроме того, пиковый ICE-ответ в FDB-волокнах, нагруженных фура-2ff, заметно снижен (~ 90%) в волокнах от мышей CASQ1 KO (см. Изображение ответа автора 1 ниже). Таким образом, Ca ²⁺ в митохондриях и других компартментах вносит вклад в <10% ICE-ответа в этих экспериментах. Тем не менее, мы планируем повторить эксперименты по хранению запасов в волокнах FDB, экспрессирующих зонд Ca ²⁺ с низким сродством, нацеленный на SR (D1ER, Reggiani et al., 2010; RCepia1-ER, Suzuki et al., 2014), введенный посредством электропорации.

Влияние нокаута кальсеквестрина типа 1 (CASQ1-null) на общее высвобождаемое содержимое магазина Ca

²⁺.

A) Репрезентативные следы соотношения фура-FF общего содержания запаса Ca ²⁺, выявленного во время применения ICE в волокнах FDB от мышей дикого типа (WT) и мышей с нулевым CASQ1. Б) Пиковое изменение соотношения фура-FF во время применения ICE. n = количество проанализированных волокон FDB; * р <0,05. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего.

2) SOCE может повысить содержание Ca ²⁺ в цитозоле до уровня, достаточного для уменьшения быстрой буферизации и, тем самым, усиления эффекта высвобождения Ca ²⁺. Это можно оценить путем более подробного измерения цитозольного Ca ²⁺ между переходными процессами и оценки влияния этого повышенного Ca ²⁺ на буферную мощность.

Согласны. В соответствии с нашим наблюдением значительного конститутивного SOCE после тренировки, уровни Ca ²⁺ в состоянии покоя были увеличены в волокнах FDB у тренированных мышей (рис. 5E). Таким образом, увеличенный SOCE во время повторяющейся стимуляции может еще больше поднять уровни Ca ²⁺ в миоплазме до уровня, достаточного для снижения быстрой буферизации Ca ²⁺ (например, парвальбумина) во время последующих стимулов. Фактически, это может частично объяснить зависящее от времени увеличение, наблюдаемое в пике переходного процесса Ca ²⁺ во время данной серии стимулов в волокнах от тренированных мышей (см. Синюю кривую на рисунке 5A, в середине).Чтобы далее проверить эту идею, мы планируем количественно определить уровни Ca ²⁺ в состоянии покоя в волокнах контрольных и тренированных мышей сразу после 10 последовательных последовательностей высокочастотных стимулов.

3) Наконец, SERCA может подавляться после тренировки из-за истощения запасов гликогена. Снижение активности SERCA может увеличивать амплитуду переходного процесса, а также способствовать частичному истощению SR и тонического SOCE, которое наблюдалось. Активность SERCA следует измерять по скоростям переходного распада Ca ²⁺ в разное время после тренировки.Важно отметить, что такие измерения могут выявить зависящее от времени изменение в обращении с Ca ²⁺ после тренировки, которое не имеет прямого отношения к сборке и разборке CEU.

Это интересное предложение, которое мы ранее не рассматривали. Чтобы получить оценку активности SERCA в интактных волокнах контрольных и тренированных мышей до и после повторяющейся стимуляции, мы подберем фазу затухания электрически вызванных переходных процессов подергивания Ca ²⁺, измеренных с использованием низкоаффинного красителя Ca ²⁺ маг-флюо-4.Распад переходного процесса Ca ²⁺ хорошо описывается двойной экспоненциальной аппроксимацией, в которой быстрый компонент в первую очередь отражает связывание Ca ²⁺ с быстрым буфером Ca ²⁺ (например, краситель, парвальбумин, тропонин C; Carroll et al., 1997; Baylor and Hollingsworth, 2003; Capote et al., 2005), в то время как медленный компонент отражает обратный захват Ca ²⁺, опосредованный SERCA. Относительный вклад медленной (A _{медленный}) и быстрой (A _{быстрый}) амплитуд будет рассчитан путем деления абсолютного значения каждого компонента на сумму двух компонентов (A _{медленный} / A _всего и A _быстро / A _всего). Этот кинетический анализ будет завершен на переходных процессах подергивания Ca ²⁺, измеренных в волокнах FDB от контрольных и тренированных мышей, как непосредственно до, так и после доставки 10 последовательных последовательностей высокочастотной стимуляции. Сравнение быстрой и медленной амплитуд (абсолютной и относительной) и постоянных времени двух кинетических компонентов обеспечит индекс влияния упражнений и повторяющейся стимуляции на быструю буферизацию Ca ²⁺ и активность SERCA.

[Примечания редакции: ниже следует ответ авторов после официального приглашения подать отредактированный материал.]

Существенные изменения:
Все три рецензента считали рукопись важным продолжением вашей предыдущей работы над единицами входа мышечного кальция (CEU), образовавшимися после упражнений. Динамика изменений в контактах SR-TT, SOCE, переходных процессах Ca ²⁺ и выработке силы после упражнений косвенно подтверждает идею о том, что CEU вовлечены в зависимые от упражнений эффекты на сократимость мышц. Однако было также твердое согласие с тем, что необходимы более количественные экспериментальные данные, чтобы показать, как наблюдаемые изменения в SOCE приводят к изменению функции мышц во время упражнений.Это могло произойти из-за нескольких неисключительных механизмов, которые необходимо протестировать:
1) Это может быть связано с увеличением содержания Са ²⁺ в SR, ведущим к увеличению потока высвобождения Са ²⁺. Свободный Ca ²⁺ в SR необходимо измерять во время последовательности стимулов, чтобы определить, повышен ли он. Метод коктейля высвобождения Ca ²⁺ покажет общее хранимое Ca ²⁺, а не свободное Ca ²⁺. Вместо этого логометрический индикатор Ca ²⁺, такой как D1ER, должен быть нацелен на SR для прямого измерения свободного просвета Ca ²⁺ во время стимуляции.

Чтобы уточнить, наши измерения ~ 25% снижения общего содержания запаса Ca ²⁺ после резких упражнений проводились на не стимулированных волокнах в покое, тогда как увеличение высвобождения Ca ²⁺ во время повторяющейся высокочастотной стимуляции было только наблюдается после седьмой стимуляции. Кроме того, увеличение переходной амплитуды пика Ca ²⁺ в волокнах мышей <1 часа после тренировки прогрессивно развивалось с течением времени во время сеансов стимуляции (т.е.е. пик Ca ²⁺ амплитуда переходного процесса не увеличивалась значительно до седьмой последовательности стимулов — см. исходный рисунок 5B). Таким образом, эволюция увеличения вызванного высвобождения Ca ²⁺ является динамичной во время повторяющейся стимуляции, что делает измерения содержания хранилища Ca ²⁺ в состоянии покоя несущественными в отношении SR Ca ²⁺, доступного для высвобождения во время повторяющейся стимуляции. .

Таким образом, одна из возможностей состоит в том, что в волокнах мышей <1 часа после тренировки увеличение SOCE во время каждой последовательности стимулов постепенно увеличивает общий запас Ca ²⁺, так что общая высвобождаемая нагрузка Ca ²⁺ увеличивается до уровня, достаточного для увеличения потока Ca ²⁺ во время седьмой и последующих последовательностей стимулов. Чтобы проверить эту идею, мы провели новые эксперименты с волокнами, нагруженными фура-FF, для оценки общего количества высвобождаемого запаса Ca ²⁺ (с использованием иономицина / CPA / EGTA или ICE, как и раньше) после доставки 10 последовательностей стимулов (500 мс, 50 Гц, каждые 2,5 секунды). Результаты этих экспериментов весьма информативны, так как как миоплазматический покой, так и общее количество высвобождаемых запасов Ca ²⁺ были значительно увеличены после 10 последовательностей стимулов в волокнах мышей, подвергшихся острой физической нагрузке, по сравнению с наблюдаемыми для волокон как у сидячих мышей, так и <1 часа после тренировки в отсутствие стимуляции (см. изображение ответа автора 2).Эти результаты согласуются с увеличением переходной амплитуды Ca ²⁺ после седьмой серии стимуляции, что, по крайней мере частично, является результатом увеличения активности SOCE в волокнах мышей <1 часа после тренировки, что приводит к увеличению общего содержания SR Ca ²⁺, например что высвобождаемая нагрузка Ca ²⁺ увеличивается до уровня, достаточного для увеличения потока Ca ²⁺. Эти новые данные включены в пересмотренные рисунки 5D и E (исходные панели рисунков 5D и E теперь представлены как рисунок 5 — приложение к рисунку 1).

Влияние повторяющейся высокочастотной стимуляции на общее количество высвобождаемых запасов Ca

²⁺ и концентрацию Ca ²⁺ в миоплазме в покое в волокнах FDB от контрольных мышей и <1 часа после тренировки.

A) Количественный анализ общего содержания накопителя Ca ²⁺, выявленного во время применения ICE (10 мкМ иономицина, 30 мкМ CPA и 100 мкМ EGTA) в волокнах FDB, нагруженных фура-FF, в отсутствие (сплошные столбцы) и после (заштрихованные столбцы) доставка 10 последовательностей стимулов (500 мс, 50 Гц, каждые 2.5 секунд). E) Количественный анализ концентрации Ca ²⁺ в миоплазме в состоянии покоя, зарегистрированной в FDB-волокнах, нагруженных фура-2, в отсутствие (сплошные столбцы) и после (заштрихованные столбцы) подачи 10 последовательностей стимулов (500 мс, 50 Гц, каждые 2,5 секунды. ). n = количество проанализированных волокон FDB; * р <0,05. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего.

Учитывая степень SR и уровень SR Ca ²⁺ связывающих белков в скелетных мышцах, в пиковом ответе на применение свободного раствора Ca ²⁺, содержащего иономицин / циклопиазоновую кислоту / EGTA (ICE), преобладает Ca ^{2 +} в отсеке SR.В соответствии с этим мы ранее использовали зависимые от Ca ²⁺ УФ-спектры поглощения BAPTA, чтобы показать, что подавляющее большинство (~ 80%) общего Ca ²⁺ в мышцах EDL находится в SR (Lambolay et al., 2015; комментарии Манно и Риос, 2015). Важно отметить, что пик ICE-ответа в волокнах, нагруженных фура-FF, заметно снижен (~ 90%) в волокнах FDB от мышей с нокаутом кальсеквестрина-1 (CASQ1-null), как и ожидалось, поскольку CASQ1 является первичным SR Ca ²⁺, связывающимся белок в мышцах (см. изображение ответа автора 1). Эти данные предполагают, что Ca ²⁺ в митохондриях и других компартментах вносит вклад в <10% ответа ICE в этих экспериментах.

Тем не менее, мы провели эксперименты с использованием зонда Ca ²⁺ (D1ER), нацеленного на SR. Тем не менее, важно заранее указать, что зонд D1ER сообщает о «концентрации свободного Ca ²⁺» в просвете SR / ER, а не об общем высвобождаемом содержании Ca ²⁺, оцененном в наших исследованиях fura-FF. Для этих экспериментов зонд D1ER экспрессировали в волокнах FDB посредством электропорации (Rudolf et al., 2006; Canato et al., 2010). Как сообщалось ранее, зонд D1ER хорошо локализуется как в соединениях триад, так и в продольных продолжениях SR, которых много в пределах I диапазона саркомера (Рисунок 5 — приложение к рисунку 2A). При идентичном усилении возбуждения и эмиссии соотношение D1ER YFP / CFP существенно не отличалось в волокнах контрольных мышей и мышей <1 часа после тренировки как в условиях покоя с полным запасом SR Ca ²⁺, так и после истощения SR Ca ^{. 2+} с ICE (Рисунок 5 — дополнение к рисунку 2B и C).Таким образом, пространственно усредненная концентрация Ca ²⁺ в просвете SR не изменяется существенно при острой нагрузке (хотя возможны области локального истощения). Эти результаты согласуются с сильной буферной способностью SR в скелетных мышцах и предыдущими наблюдениями (например, Sztretye et al., 2011; Manno et al., 2013), согласно которым концентрация свободного Ca ²⁺ в просвете SR (~ 500 мкМ) остается в основном неизменным, несмотря на заметные изменения в общем содержании SR Ca ²⁺.Эти результаты включены в переработанную рукопись (Рисунок 5 — приложение к рисунку 2).

2) SOCE может повысить содержание Ca ²⁺ в цитозоле до уровня, достаточного для уменьшения быстрой буферизации и, тем самым, усиления эффекта высвобождения Ca ²⁺. Влияние на буферизацию можно было оценить путем более детального измерения цитозольного Ca ²⁺ между отдельными переходными процессами и после последовательностей стимулов у контрольных и тренированных мышей.

Как показано выше, уровни Ca ²⁺ в миоплазме в состоянии покоя были значительно повышены в волокнах FDB, выделенных от мышей, менее чем через 1 час после физической нагрузки.Важно отметить, что теперь мы показываем (см. Панель B на изображении ответа автора 2), что это увеличение в покое Ca ²⁺ в волокнах FDB после острой нагрузки (где активность SOCE увеличивается) было даже больше сразу после подачи 10 последовательностей стимулов (500 мс, 50 Гц, каждые 2,5 секунды). Таким образом, повышение уровня Ca ²⁺ в состоянии покоя после острой нагрузки, вероятно, могло бы уменьшить быструю буферизацию, достаточную для усиления эффекта высвобождения Ca ²⁺. Однако подробный количественный анализ кинетики кратковременного затухания Ca ²⁺ до и после 10 последовательностей стимулов не подтверждает значительного изменения либо быстрой буферизации Ca ²⁺, либо опосредованного SERCA обратного захвата Ca ²⁺ (см. — приложение к рисунку 3).Мы обновили раздел «Обсуждение» исправленной рукописи, чтобы включить их рассмотрение.

3) Наконец, SERCA может подавляться после тренировки из-за истощения запасов гликогена. Снижение активности SERCA может увеличивать амплитуду переходного процесса, а также способствовать частичному истощению SR и тонической SOCE, которое наблюдалось в мышцах в состоянии покоя после тренировки. Кинетический анализ цитозольных переходных процессов подергивания Ca ²⁺ (быстрые и медленные компоненты) можно использовать для оценки изменений активности SERCA и буферизации Ca ²⁺ у контрольных и тренированных мышей до и после 10 последовательностей стимулов.Важно отметить, что такие измерения могут выявить зависящее от времени изменение в обращении с Ca ²⁺ после тренировки, которое не имеет прямого отношения к сборке и разборке CEU.

Мы благодарим рецензента за это прекрасное предложение. Мы завершили предложенные эксперименты по количественной оценке кинетики электрически вызванного кратковременного распада Ca ²⁺ с использованием низкоаффинного красителя Ca ²⁺ (mag-fluo-4) до и после доставки 10 последовательных последовательностей стимулов (500 мсек). , 50 Гц, каждые 2.5 секунд) в волокнах FDB как у мышей, ведущих сидячий образ жизни, так и у мышей <через 1 час после тренировки. Используя этот подход, фаза затухания электрически вызванного переходного процесса подергивания mag-fluo-4 хорошо описывается двойной экспоненциальной аппроксимацией, в которой быстрый компонент в первую очередь отражает связывание Ca ²⁺ с быстрыми буферами Ca ²⁺, в то время как в медленном компоненте преобладает SERCA-опосредованный обратный захват SR Ca ²⁺ (Carroll et al., 1997; Baylor and Hollingsworth, 2003; Capote et al., 2005). Для этих экспериментов мы сначала зарегистрировали 10 электрически вызванных переходных процессов подергивания (0.5 Гц) в волокнах FDB либо от мышей, ведущих сидячий образ жизни, либо от мышей менее чем через 1 час после тренировки до подачи 10 последовательностей стимулов (500 мс, 50 Гц, каждые 2,5 секунды). После 10 последовательностей стимулов регистрировали второй набор из 10 электрически вызванных переходных процессов подергивания (0,5 Гц). Несмотря на значительное увеличение амплитуды переходного процесса пика Ca ²⁺ во время 10 ^{-й серии стимулов} (1,51 ± 0,07) по сравнению с первой цепочкой стимулов (1,32 ± 0,09) только в волокнах мышей <1 часа после нагрузки, нет наблюдались значительные изменения в кинетике переходного распада Ca ²⁺ по сравнению с таковыми, полученными для волокон, выделенных от сидячих мышей.Эти результаты включены в исправленную рукопись (Рисунок 5 — приложение к рисунку 3).

4) Идея о том, что CEU отвечают за конститутивный SOCE после тренировки, не поддерживается. В разделе «Обсуждение» авторы предполагают, что новые CEU могут объяснить увеличение тонического SOCE после тренировки. Подтверждающим аргументом является то, что тушение «без истощения» после тренировки (1200 сП) + тушение ТГ / СРА перед тренировкой (1700 сП) = скорость тушения ТГ / СРА после тренировки (2800 сП).Однако подавление после тренировки вызвано только частичным истощением SR, поэтому TG / CPA должны добавить более 1200. Этот аргумент не имеет для меня количественного смысла. Если это не может быть лучше обосновано, его следует удалить.

Как и предполагалось, мы удалили это предположение из раздела «Обсуждение» исправленной рукописи.

5) Связанный с этим вопрос касается идеи о том, что CEU несут исключительную ответственность за SOCE, который увеличивает мышечную функцию после тренировки.Пики потери содержания SR Ca ²⁺ совпадают (<1 часа) с переходными процессами высвобождения Ca ²⁺ и выработкой силы во время поездов «без истощения» SOCE. Это все усложняет. Из-за тонического истощения, возможно, что уже существующие комплексы STIM и Orai (активируемые истощением тонических запасов), отличные от новых CEU, активируются и вносят свой вклад в усиленную функцию. Эту возможность необходимо четко признать, а выводы относительно функций CEU смягчить.

Мы благодарим рецензента за указание на эту возможность, которая теперь явно указана в разделе «Обсуждение» исправленной рукописи.

[Примечание редакции: до принятия были запрошены дополнительные исправления, как описано ниже.]

Рукопись была улучшена, и новые данные позволили решить несколько проблем, поднятых в первоначальном обзоре. Однако есть некоторые нерешенные вопросы, которые необходимо решить до принятия, как указано ниже:
1) (Подраздел «Общее количество высвобождаемого Ca ²⁺ в хранилище уменьшается <через 1 час после тренировки, но увеличивается после повторяющейся высокочастотной стимуляции» и раздел «Обсуждение»).После тренировки конститутивный SOCE значительно увеличивается, но новые измерения D1ER показывают, что свободный Ca ²⁺ в SR не изменяется. Поскольку STIM1 и SOCE контролируются свободным Ca ²⁺ в ER / SR, а не общим содержанием Ca ²⁺, как можно увеличить активность Orai без снижения свободного SR Ca ²⁺? Наблюдаемое уменьшение общего SR Ca ²⁺ не может объяснить появление конститутивного SOCE. Эту загадку необходимо четко сформулировать и дать возможные объяснения.Хотя погрешность измерения D1ER может маскировать небольшое истощение свободного Ca ²⁺, это вряд ли полное объяснение, поскольку амплитуда SOCE была настолько большой (то есть примерно такой же, как максимальное SOCE от полного истощения SR до тренировки). .

Мы благодарим рецензента за то, что он поднял этот важный вопрос.

Измерения D1ER действительно показывают, что «пространственно-усредненная» концентрация свободного Ca ²⁺ в SR, измеренная с помощью этого зонда, существенно не изменяется после тренировки (хотя возможны области локального истощения).Однако важно отметить, что наши результаты локализации D1ER показывают, что большая часть сигнала D1ER находится в соединении триады (Рисунок 5 — приложение к рисунку 1A). Таким образом, данные D1ER в первую очередь отражают концентрацию свободного Ca ²⁺ внутри соединения триады, которая не меняется после тренировки. Эти результаты предполагают, что конститутивный SOCE, наблюдаемый после тренировки, не происходит из каналов Orai1 в соединении триад. Скорее, конститутивное проникновение Ca ²⁺, более вероятно, возникает из каналов Orai1, локализованных в удлиненном TT в области I полосы саркомера, который соединяется с мембранами SR-стека, образующими CEU, которые плохо отражаются в пространственно-усредненных Сигнал D1ER.Эти наблюдения подтверждают идею о том, что CEU представляют собой место конститутивного входа Ca ²⁺ после тренировки. Альтернативное объяснение состоит в том, что упражнения могут производить сигнал, который напрямую активирует Orai1 независимо от истощения запасов (даже в рамках триады).

Хотя, по общему признанию, слишком поверхностно, мы попытались решить эту проблему в следующем предложении из раздела «Обсуждение» предыдущей версии исправленной рукописи:

«Таким образом, конститутивное поступление Ca ²⁺ могло быть связано либо с частичным истощением части запаса SR (Рисунок 5 — добавление к рисунку 1), либо с генерацией прямого активатора каналов Orai1 после тренировки. «

Под «частично истощенной частью SR» мы косвенно подразумевали CEU, сформированные после учений. Мы также оставили открытой возможность того, что упражнения могут производить прямой активатор Orai1, который не требует снижения концентрации SR Ca ²⁺. Тем не менее, мы ценим точку зрения рецензентов и понимаем, что наша попытка краткости упустила несколько важных моментов (обсужденных выше). Поэтому мы дополнительно изменили эту часть раздела «Обсуждение», чтобы более подробно рассмотреть эти вопросы.

2) Новые анализы сокращений убедительны, но никому, кроме опытного мышечного физиолога, непонятно, как они были использованы для заключения о связывании Ca ²⁺ и активности SERCA. В подразделе «Общее количество выделяемого Ca ²⁺ в хранилище уменьшается <через 1 час после тренировки, но увеличивается после повторяющейся высокочастотной стимуляции», необходимо указать, что кинетика кратковременного распада Ca ²⁺ не меняется. объяснил; почему был проведен этот эксперимент и какова интерпретация? В разделе «Обсуждение» было бы полезно обсудить возможности, которые были затронуты в обзоре, включая насыщение буферов и истощение гликогена и влияние на SERCA, а также то, как новые результаты опровергают эти альтернативные объяснения.Пример переходного процесса должен быть показан вместе с анализом на рисунке 5 — рисунок в приложении 3, чтобы проиллюстрировать быстрые и медленные компоненты и то, как они были установлены.

Мы приносим свои извинения за то, что не предоставили четкого обоснования в разделе «Результаты», почему была проанализирована кинетика переходного распада twitch Ca ²⁺ (обоснование было представлено в разделе «Методы»). Мы отредактировали рукопись, чтобы включить это обоснование в раздел «Результаты», непосредственно перед тем, как эти данные будут представлены (подраздел «Общее количество допустимых выбросов Ca ²⁺ в хранилище уменьшено»).Как было предложено, мы также теперь включаем пример кривых twitch Ca ²⁺ с наложенными двухэкспоненциальными подгонками на рис. 5 — приложение к рисунку 3. Теперь мы также обсуждаем потенциальные эффекты насыщения буферов Ca ²⁺, истощение гликогена и SERCA. активность в разделе «Обсуждение» отредактированной рукописи.

https://doi.org/10.7554/eLife.47576.020

Дисферлин опосредует мембранные канальцы и связывает биогенез Т-канальцев с мышечной дистрофией

ВВЕДЕНИЕ

Система Т-канальцев представляет собой обширную сеть, образованную инвагинациями плазматической мембраны и составляющую около 80% поверхности плазматической мембраны поперечно-полосатой мышцы ( Аль-Кусаири и Ляпорт, 2011 г.).Он действует в связи возбуждения-сокращения (ЕС), распространяя потенциал действия от плазматической мембраны в мышечное волокно, что в конечном итоге приводит к высвобождению Ca ²⁺ из саркоплазматического ретикулума (SR) и сокращению мышц. Система Т-канальцев участвует в регуляции мышечной усталости, дифференцировки мышц, внутриклеточного движения и восстановления плазматической мембраны (Al-Qusairi and Laporte, 2011; Engel and Franzini-Armstrong, 2004; Kerr et al. , 2014; Klinge et al. ., 2007; Кроленко, Люси, 2002; Lee et al., 2002). Однако молекулярные механизмы, необходимые для биогенеза, поддержания и функционирования этой клеточной органеллы, понятны лишь частично (Al-Qusairi and Laporte, 2011; Engel and Franzini-Armstrong, 2004). К настоящему времени идентифицированы два белка, непосредственно участвующих в биогенезе системы Т-канальцев. Кавеолин-3 имеет решающее значение для образования бусин на плазматической мембране (Franzini-Armstrong, 1991), а мышечная изоформа Bin1 (также известная как амфифизин 2) напрямую влияет на формирование гладких трубчатых профилей Т-канальца система (Ли и др., 2002; Posey et al., 2014). Мутации в генах, кодирующих Bin1 и кавеолин-3, каждый вызывает разные мышечные заболевания (Bohm et al., 2014) с изменениями гомеостаза Ca ²⁺, возникающими из-за дефицита Bin1 (Tjondrokoesoemo et al., 2011). Косвенные наблюдения указывают на функцию дисферлина в биогенезе Т-канальцев (Al-Qusairi and Laporte, 2011; Demonbreun et al. , 2013; Kerr et al., 2014, 2013; Klinge et al., 2010b, 2007). Мутации в гене DYSF приводят к пояснично-мышечной дистрофии типа 2B (LGMD2B) или миопатии Миёси (MM), характеризующейся прогрессирующей мышечной слабостью и истощением, которые обычно начинаются во втором десятилетии жизни.Интересно, что около половины пациентов с дефицитом дисферлина демонстрируют необычный и неоднозначный фенотип заболевания, демонстрируя повышенный уровень физической подготовки до появления симптомов. Это резко контрастирует с пациентами с любой другой формой мышечной дистрофии (Biondi et al., 2013; Klinge et al., 2010a). Пока не существует лечения причины этих заболеваний, но недавние подходы к переносу генов способны восстановить надлежащую локализацию полноразмерного белка дисферлина (Escobar et al., 2016; Прядкина и др., 2015; Sondergaard et al., 2015).

Дисферлин вместе с отоферлином, миоферлином и от Fer1L4 до Fer1L6 принадлежит к семейству ферлинов, группе слитых белков везикул. Дисферлин представляет собой трансмембранный белок 230 кДа типа II, содержащий семь доменов C2. Белки C2-домена часто способствуют Ca ²⁺-зависимому мембранному взаимодействию и слиянию (Lemmon, 2008), а домен C2A дисферлина связывается с фосфатидилинозитол-4-фосфатом и фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфатом [PI (4,5) P ₂] (Davis et al., 2002; Fuson et al., 2014; Therrien et al., 2009), который является важным регулятором клеточного транспорта, ионных каналов и гомеостаза Ca ²⁺ (Balla, 2013; Hilgemann et al., 2001). Первый домен C2, C2A, необходим для накопления фосфатидилсерина в сайте репарации мембраны (Middel et al., 2016). Дисферлин локализуется на плазматической мембране и на мембране Т-канальца в поперечно-полосатых мышцах (Ampong et al., 2005; Anderson et al., 1999; Klinge et al., 2008) и проникает в поздние эндосомы, подобно миоферлину (Redpath и другие., 2016). Дисферлин действует на внутриклеточные мембраны (Bansal et al., 2003; Marty et al., 2013), и изменение этого процесса считается ответственным за нарушение восстановления мембраны (Bansal et al. , 2003; Cooper and Head, 2014) во время регенерации мышц (Chiu et al., 2009), а также для изменений морфологии Т-канальцев и функции мышц с дефицитом дисферлина (Klinge et al., 2010b; Roostalu and Strähle, 2012). Однако неизвестно, как белок дисферлин механистически участвует в этих функциях (Al-Qusairi and Laporte, 2011; Kerr et al., 2014).

Здесь мы анализируем клеточную и молекулярную функцию дисферлина в отношении его мембранных связывающих и мембрано-деформирующих свойств. Далее мы анализируем влияние мутаций, связанных с заболеванием, на эти функции и разрабатываем модель морфогенетической роли дисферлина в биогенезе Т-канальцев.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Дисферлин опосредует мембранные канальцы

in vivo и in vitro

Для изучения функции и внутриклеточной локализации дисферлина мы экспрессировали полноразмерную конструкцию дисферлина с EGFP-меткой в немышечных клетках, которые не являются эндогенными. экспрессируют этот белок.Используя клетки HeLa и COS-7, мы обнаружили, что дисферлин локализуется в высокодинамичных трубчатых и везикулярных структурах (рис. 1А; фильм 1). Истощение холестерина разрушает эти структуры и подтверждает, что места локализации дисферлина являются мембранами (рис. 1B). Обработка нокодазолом приводила к разрушению этих мембранных канальцев, что свидетельствует об их ассоциации с микротрубочками (рис. 1В). Это согласуется с взаимодействием белка дисферлина с α-тубулином (Azakir et al., 2010). Чтобы проверить, доступны ли канальцы дисферлина для внешнего добавленного красителя, мы экспрессировали EGFP-дисферлин в клетках HeLa и окрашивали клетки непроницаемым для мембран флуоресцентным красителем FM4-64 в течение 40 с.Совместная локализация этого красителя с индуцированными дисферлином мембранными канальцами наблюдалась при визуализации в реальном времени сразу после удаления красителя (рис. 1E). Количественная оценка внутриклеточной флуоресценции FM4-64 показала значительно более высокую интенсивность в клетках, трансфицированных дисферлином, по сравнению с клетками, трансфицированными EGFP (фиг. 1D). Таким образом, в немышечных клетках канальцы дисферлина доступны извне либо через непрерывность мембраны с плазматической мембраной, либо через эндоцитоз. Эти результаты показывают, что индуцированные дисферлином структуры морфологически сходны с Т-канальцами в скелетных и сердечных мышцах.Кроме того, мы хотели знать, были ли внутриклеточные мембранные структуры, в которых, как было обнаружено, локализуется дисферлин, уже существовавшими клеточными органеллами, или дисферлин был способен индуцировать эти структуры de novo путем привлечения внутриклеточных мембран. Мы коэкспрессировали дисферлин-Myc с GFP-Rab7, кроме того, мы затем экспрессировали EGFP-дисферлин и пометили белок ER PDI, белок Гольджи 58K (также известный как FTCD), белок пероксисомальной мембраны Pex14 и белок лизосомальной мембраны Lamp1. Кроме того, мы визуализировали митохондрии с помощью MitoTracker и цитоскелет, окрашивая тубулин и F-актин.Мы обнаружили, что канальцы, индуцированные дисферлином, не колокализуются с маркерами органелл или цитоскелетом (рис. S1A, B).

Рис. 1.

Дисферлин образует Т-трубчатые мембраны в клеточных системах. (A) EGFP-дисферлин индуцирует удлиненные цитоплазматические канальцы в клетках COS-7 и HeLa. (B) Обработка β-MCD и нокодазолом (NOC) клеток COS-7, экспрессирующих EGFP-дисферлин, приводит к потере канальцев, как указано в C. На вставках в A и B показаны увеличенные области. * P <0,001 vs.контроль (дикий тип; WT) (тест Стьюдента t ), N (контроль) = 9 партий по 100 клеток; N (βMCD и NOC) = 6 партий по 100 клеток. (D, E) Клетки HeLa, трансфицированные EGFP- или EGFP-дисферлином, окрашивали FM4-64 и визуализировали сразу в течение 3 мин. Канальцы, индуцированные дисферлином, показывают совместную локализацию с мембранным красителем. Клетки, трансфицированные EGFP, не проявляли внутриклеточного окрашивания FM4-64. Количественная оценка внутриклеточной интенсивности FM4-64 (D) показывает быстрый эндоцитоз красителя вместе с дисферлином. N = 3 партии по 30 клеток, * P <0.05 (Студенческий т -тест). Совместная локализация FM4-64 и EGFP-дисферлина (E) демонстрирует, что индуцированные дисферлином мембранные канальцы доступны для внешнего добавленного красителя. (F) Дисферлин, паралоги, отоферлин и миоферлин, локализуются в эндоплазматическом ретикулуме в клетках COS-7. На вставках показаны увеличенные области. (G) Патологические мутации, усечения и минидисферлины (MD, природный минидисферлин и MD3) не могут индуцировать тубулярные структуры при гетерологичной экспрессии. Слитые EGFP экспрессировали в клетках COS-7 и определяли количество канальцев.* P <0,001 по сравнению с WT (тест Стьюдента t ), N = 3–9 × 100 клеток (см. Материалы и методы). C2FG TM, содержит два последних домена C2 и трансмембранный домен (TM) дисферлина; C2FG содержит два последних домена C2, но не содержит TM дисферлина. (H) Структура домена дисферлина и мутации, использованные в этом исследовании. Клетки анализировали с помощью широкопольной (A, B, F) или конфокальной флуоресцентной микроскопии (E). Голубые ядра, окрашенные DAPI. Графики прямоугольников и усов: линии представляют среднее значение; прямоугольники представляют 25-й процентиль, а усы — минимальные и максимальные значения. дисф, дисферлин. Масштабные линейки: 10 мкм.

Затем мы проверили, разделяются ли эти свойства индуцирования канальцев другими членами семейства ферлинов. Примечательно, что дисферлин-паралоги отоферлин и миоферлин не индуцируют внутриклеточные мембраны в немышечных клетках при сверхэкспрессии в тех же условиях (рис. 1F). В отличие от дисферлина, миоферлин и отоферлин колокализованы с маркером ER PDI (рис. 1F).

Чтобы изучить физиологическую значимость этих результатов, мы проанализировали пять известных мутаций дисферлина пациентов (V67D в C2A, G299W в C2B, R959W в C2D, R1331L, расположенный между C2D и C2E, L1341P в C2E) и укороченные конструкции дисферлина, включая так так называемые минидисферлины (Azakir et al., 2012; Krahn et al., 2010). Все минидисферлины, усеченные формы и точечные мутации в доменах C2 не могут индуцировать мембранные канальцы в немышечных клетках. Примечательно, что мутант дисферлина R1331L, несущий аминокислотную замену в домене, соединяющем C2D и C2E, частично сохранил мембранные канальцы (рис. 1G, H). Эти находки предполагают, что изменение дисферлин-зависимых мембранных канальцев имеет отношение к дисферлин-ассоциированной мышечной патологии и что домены C2 играют разные роли в контексте белка.

Для более непосредственной оценки свойств связывания с мембраной дисферлина и in vitro мы проанализировали полноразмерный дисферлин и мутанты в эксперименте по флотации с использованием липосом, полученных из липидной фракции Фолча. Белок и липосомы загружали на дно ступенчатого градиента сахарозы, и липосомы всплывали центрифугированием и анализировали на наличие связанного белка вестерн-блоттингом. Мы обнаружили, что дикого типа, но ни патогенный дисферлин ^{, V67D}, ни минидисферлин-3 (MD3) не связывался с мембранами (рис.2А). Это открытие указывает на то, что для прикрепления к мембране требуется целостность полноразмерного белка, поскольку мутация в домене C2A препятствует связыванию, но домены C2A, C2F и C2G дикого типа (MD3) недостаточны для выполнения этой функции. Вместе взятые, дисферлин тубулирует клеточные мембраны и индуцирует структуры в немышечных клетках, которые напоминают систему Т-канальцев. Эта функция зависит от полноразмерного дисферлина и очень чувствительна к патогенным мутациям.

Рис.2.

Дисферлин образует мембраны, подобные Т-трубочкам in vitro и in vivo . (A) Анализ флотации: полноразмерный дисферлин, но не минидисферлин-3 (MD3), ни дисферлин ^{, V67D} связываются с синтетическими липосомами. «Т», верхняя фракция; «B», нижняя фракция. Образцы анализировали с помощью вестерн-блоттинга с использованием антител против дисферлина. (B) Электронные микрофотографии: рекомбинантный полноразмерный дисферлин, но не дисферлин ^{, V67D} и MD3, индуцирует тубуляцию липосом in vitro .GST-Bin1, который также тубулирует липосомы in vitro , использовали в качестве положительного контроля. Масштабная шкала: 200 нм. (C) Окрашивание Т-канальцев с использованием DiIC ₁₆ (3) человеческих миобластов дикого типа и с дефицитом дисферлина после дифференциации в культуре показывает компактные тубулярные агрегаты в миобластах с дефицитом дисферлина, которые не наблюдались в контрольных волокнах. Масштабная линейка: 10 мкм. (D) Количественная оценка эксперимента, описанного в C: дикий тип (WT): N = 6 партий по 10-16 клеток, LGMD2B: N = 3 партии по 20-25 клеток.* P <0,001 по сравнению с WT (тест Стьюдента t ). Средние значения показаны над полосами. (E) Вакуоли Т-канальца в мышце с удаленным геном DYSF после регенерации мышцы (стрелки). Эти вакуоли не появляются в модели мышечной регенерации мыши mdx . Масштабная шкала: 100 нм.

Чтобы более точно визуализировать влияние дисферлина на мембраны, мы инкубировали липосомы с рекомбинантным полноразмерным дисферлином и проанализировали эти образцы с помощью отрицательного окрашивания и электронной микроскопии.Рекомбинантный Bin1 использовали в качестве положительного контроля (фиг. 2B). Дисферлин экструдировал липосомы в мембранные канальцы, демонстрируя мощную активность дисферлина в мембранных канальцах in vitro (рис. 2В). Опять же, эта активность была предотвращена посредством точечной мутации dysferlin ^V67D (фиг. 2B) и усечения MD3 (фиг. 2B). Эти данные подтверждают гипотезу о том, что дефект канальцев является решающим фактором развития мышечной патологии с дефицитом дисферлина.

Чтобы получить дальнейшее представление о функциональной значимости дисферлин-зависимых мембранных канальцев, мы изучили модель биогенеза Т-канальцев.Миобласты человека с дефицитом дисферлина были дифференцированы в культуре в многоядерные волокна, и их система Т-канальцев была окрашена липофильным красителем DiIC ₁₆ (3). Сильно компактные трубчатые агрегаты наблюдались в 36% дисферлин-дефицитных волокон, но не в любом из контрольных волокон (рис. 2C, D; рис. S1C). Это подчеркивает гипотезу о том, что дисферлин имеет решающее значение для образования системы Т-канальцев в скелетных мышцах.

Важность функции дисферлина в биогенезе Т-канальцев была дополнительно подтверждена на модели in vivo регенерации мышц мышей.Нотексин змеиного яда вызывает разрушение скелетных мышц с последующей быстрой регенерацией, обеспечивая модель ускоренного биогенеза мышц и Т-канальцев in vivo . Систему Т-канальцев визуализировали с использованием ранее описанного метода ферроцианида Ca ²⁺ -K ⁺ и электронной микроскопии (Franzini-Armstrong, 1991). Во время индуцированной нотексином регенерации мышц внутри Т-канальцев мышцы мыши с удаленным геном DYSF (рис. 2Е) появились большие вакуоли, что усугубило фенотип аномальной морфологии Т-канальцев в не регенерирующих мышцах (Klinge et al., 2010b). Изменения Т-канальцев не наблюдались у дисферлин-компетентных контролей и модели мыши mdx (содержащей мутацию в гене дистрофина; контрольный образец заболевания) (рис. 2E), что указывает на наблюдаемый эффект дисферлина на мембранные канальцы in vitro является релевантным in vivo .

Функциональное взаимодействие дисферлина с белками, участвующими в биогенезе Т-канальцев

Bin1, один из белков, участвующих в биогенезе Т-канальцев, также способен индуцировать мембранные канальцы в немышечных клетках (Lee et al. , 2002). Оба белка, дисферлин и Bin1, индуцировали тубуляцию примерно в 50% трансфицированных клеток (рис. 3А). Мы гетерологично коэкспрессировали Bin1 и дисферлин в клетках COS-7 и обнаружили частичную совместную локализацию (коэффициент колокализации Пирсона = 0,16 ± 0,03, N = 10 клеток) в мембранных канальцах (рис. 3B). Коэкспрессия Bin1 не влияла на способность дисферлина к канальцам (рис. 3С). Чтобы проанализировать Bin1 и индуцированные дисферлином канальцы более подробно, мы «скелетонировали» изображения канальцев и обнаружили, что количество и длина ветвей канальцев были одинаковыми для обоих белков, но количество конечных точек было значительно увеличено в клетках, трансфицированных дисферлином. тогда как количество стыков увеличивалось в клетках, трансфицированных Bin1 (рис.3D, E). Это открытие демонстрирует, что канальцы, индуцированные дисферлином, короче и менее разветвлены по сравнению с канальцами Bin1. Трехмерные (3D) реконструкции Bin1 и дисферлина в клетках COS-7 и мышечных клетках C2C12 показали частичную совместную локализацию в одних и тех же структурах (рис. 3F).

Рис. 3.

Функциональное взаимодействие дисферлина с динамином2 и Bin1. (A) Около 50% клеток, трансфицированных дисферлином (Dysf) и Bin1, демонстрируют тубулярные (тубулярные) мембранные структуры в клетках COS-7. N = 3 партии по 100 клеток на группу.(B) Частичная совместная локализация GFP-Bin1 и дисферлина-Myc в мембранных канальцах в клетках COS-7. (C) Котрансфекция Bin1 не изменяла количество канальцев, индуцированных дисферлином. Количественное определение N = 3 партии по 100 клеток. Мок, преобразованный с RFP. (D, E) Анализ топологического скелета мембранных канальцев, индуцированных дисферлином и Bin1, в клетках COS-7. (D) Конфокальные изображения дисферлин-Myc и GFP-Bin1 были скелетонизированы и проанализированы с помощью плагина AnalyzeSkeleton (ImageJ), чтобы получить количество и длину ветвей (оранжевый), количество соединений ветвей (пурпурный) и количество конечных точек (зеленый ).Масштабная линейка: 5 мкм. (E) Количественная оценка: * P <0,05 по сравнению с дисферлином (тест Стьюдента t ), N = 6 клеток на группу. «(N)» по оси и , номер. (F) 3D-анализ клеток C2C12, окрашенных антителами против дисферлина и анти-Bin1, и клеток COS-7, трансфицированных EGFP-дисферлином и RFP-Bin1. (G, H) Dynamin2 рекрутируется на мембраны канальцев, индуцированных дисферлином и Bin1, но не в канальцы, индуцируемые только дисферлином. (G) Клетки COS-7 были либо индивидуально трансфицированы GFP-Bin1 или дисферлином-Myc, либо котрансфицированы обеими конструкциями.Клетки окрашивали антителом против динамина2. На вставках показаны увеличенные области. (H) Анализ совместной локализации GFP-Bin1 и / или дисферлина-Myc с эндогенным динамином2. * P <0,001, N = 10 (тест Стьюдента t ). Клетки анализировали с помощью широкопольной (B) или конфокальной флуоресцентной микроскопии (D, F, G). Масштабные линейки: 10 мкм.

Bin1-индуцированные мембранные канальцы, как известно, привлекают динамин2 (Lee et al., 2002). Интересно, однако, что эндогенный динамин-2 не колокализовался с теми мембранными канальцами, которые были индуцированы одним дисферлином (рис. 3G, H). Когда дисферлин и Bin1 экспрессировались совместно, совместная локализация между дисферлином и динамином2 была значительно увеличена по сравнению с таковой при однократной трансфекции дисферлина (фиг. 3G). Однако сигнал Dynamin2 значительно больше перекрывается с сигналом GFP-Bin1, чем с сигналом dysferlin-Myc. Эти находки показывают, что Bin1 и дисферлин обладают перекрывающимися, но различимыми функциями.

Помимо Bin1, кавеолин-3 также участвует в биогенезе Т-канальцев. Кроме того, известно, что этот белок регулирует внутриклеточный трафик дисферлина (Hernandez-Deviez et al., 2008). Поэтому мы проанализировали влияние кавеолина-3 на дисферлин-индуцированные канальцы. Мы гетерологично экспрессировали дисферлин вместе с кавеолином-3 в клетках HeLa и COS-7 и обнаружили уменьшение опосредованных дисферлином мембранных канальцев (рис. 4A-C). Это говорит о негативном регулирующем влиянии кавеолина-3 на функцию дисферлина.

Рис. 4.

Совместная экспрессия кавеолина-3 ингибирует дисферлиновые мембранные трубочки. Гетерологическая коэкспрессия кавеолин-3-Myc (Cav3-myc) и EGFP-дисферлин снижает мембранные тубуляцию дисферлина, что количественно определено в клетках COS-7 (A, C) и HeLa (B, C).(C) Количественная оценка: COS-7, * P <0,001 ( t -тест Стьюдента по сравнению с образцом только EFGP-dysf COS-7), N = 3 партии по 200 клеток на группу. HeLa, * P <0,001 ( t -тест Стьюдента по сравнению с образцом, содержащим только EFGP-dysf HeLa), N = 5 партий по 100 клеток на группу. Клетки анализировали с помощью широкопольной флуоресцентной микроскопии. Синий, ядра окрашены DAPI. Масштабные линейки: 10 мкм.

Липидная специфичность дисферлина

Т-канальцы поперечно-полосатой мышцы обогащены PI (4,5) P ₂, и этот фосфолипид также маркирует участки активности Bin1 (Lee et al., 2002; Милтинг и др., 1994; Ву и Баумгарт, 2014). Кроме того, известно, что отдельные C2-домены дисферлина связываются с фосфолипидами (Davis et al. , 2002; Therrien et al., 2009).

Мы хотели изучить липидную мембранную специфичность дисферлина в клеточной системе и, следовательно, коэкспрессировать GFP-меченный домен гомологии плекстрина (PH) фосфолипазы C δ1 (PLCδ1) в качестве сенсора для PI (4,5) P ₂ с дисферлином, меченным Myc, в миобластах C2C12. Сенсор PI (4,5) P ₂ совместно локализовался с дисферлином на плазматической мембране и показал замечательную совместную локализацию в системе Т-канальцев (рис.5А). Чтобы проверить, обладают ли индуцированные дисферлином мембранные канальцы в немышечных клетках этим свойством, мы коэкспрессировали PH-PLCδ-GFP и дисферлин в клетках COS-7. Экспрессия дисферлина приводила к массивному образованию PI (4,5) P ₂-содержащих канальцев в цитоплазме (рис. 5B). Распределение сенсора PI (4,5) P ₂ было смещено от плазматической мембраны к внутриклеточному положению (фиг. 5B, H) по сравнению с клетками без сверхэкспрессии дисферлина. Это может указывать на то, что дисферлин привлекает PI (4,5) P ₂ от плазматической мембраны к канальцам внутриклеточной мембраны. Кроме того, канальцы дисферлина совместно локализовались с YFP-меченным PH доменом Akt, биосенсором для PI (3,4,5) P ₃ (фиг. S2A). Для дальнейшего изучения сродства дисферлина к этим фосфоинозитидам мы создали вакуоли, обогащенные PI (4,5) P ₂, посредством экспрессии конститутивно активного мутанта Arf6, Arf6 ^Q67L или фосфатидилинозитол-4-фосфат. 5-киназа (киназа PI4P5) (Donaldson et al., 2003; Krauss et al., 2003) (рис. S2B, C). Специфическое привлечение дисферлина к этим вакуолям подтвердило сродство белка к PI (4,5) P ₂ (фиг. 5C, D). Ассоциация PI (4,5) P ₂ — дисферлин показала интригующую чувствительность к патогенным мутациям, поскольку дисферлин ^V67D и другие делеции и усечения не были задействованы в PI (4,5) P ₂ вакуоли (рис. 5E, I; рис. S2D, E). Важно отметить, что экспрессия PI (4,5) P ₂-деградирующей фосфатазы, происходящей из синаптоянина-1, блокирует образование канальцев в немышечных клетках и изменяет систему Т-канальцев в миотрубках C2C12 (рис.5G). Эти результаты показывают, что индуцированные дисферлином канальцы зависят от PI (4,5) P ₂ и, кроме того, что PI (4,5) P ₂ важен для биогенеза Т-канальцев.

Рис. 5.

Потребность в PI (4,5) P ₂ для дисферлин-зависимого биогенеза Т-канальцев. Прямая флуоресцентная микроскопия и иммунофлуоресценция с использованием антител против Myc трансфицированных клеток COS-7 (B-F) и миотрубок C2C12 (A, G). (A) Совместная локализация дисферлина-Myc (Dysf-myc) и PH-PLCδ-GFP [датчик PI (4,5) P ₂] в клетках C2C12 в системе Т-канальцев.Синий, ядра окрашены DAPI. (B) Котрансфекция дисферлин-Myc и PH-PLCδ-GFP демонстрирует частичную совместную локализацию в клетках COS-7. (CE) Привлечение дисферлина к PI (4,5) P ₂-содержащих вакуолей: клетки COS-7 котрансфицировали EGFP-дисферлином и (C) Arf6 ^Q67L -HA или (D) RFP –PI4P5-киназа. Патогенный дисферлин ^V67D не рекрутируется в PI (4,5) P ₂ вакуолей (E). (F) Разрушение PI (4,5) P ₂ синаптоянином блокирует образование канальцев.(G) Распад PI (4,5) P ₂ препятствует образованию Т-канальцев в миотрубках C2C12. (H) Количественная оценка сигналов флуоресценции трансфицированных клеток COS-7 (B) показывает, что дисферлин способен рекрутировать PI (4,5) P ₂ во внутриклеточные мембранные канальцы. * P <0,01 (тест Стьюдента t -тест), N = 17. ПМ, плазматическая мембрана. (I) Совместная локализация EGFP-дисферлина (мутанты, см. Рис. S2) с RFP-PI4P5-киназой. * P <0.01 против образца дисферлина (дисферлина) дикого типа (тест Стьюдента t ), N = 8 (WT и каждая мутация). Клетки анализировали с помощью широкопольной флуоресцентной микроскопии. Масштабные линейки: 10 мкм.

В совокупности дисферлин связывается с PI (4,5) P ₂ и специфически рекрутирует этот фосфолипид в индуцированные дисферлином канальцы. Более того, образование этих канальцев зависит от PI (4,5) P ₂. Следовательно, индуцированные дисферлином мембранные канальцы в немышечных клетках имеют общие биохимические характеристики системы Т-канальцев.Обнаружение того, что известные связанные с заболеванием мутации DYSF мешают этим свойствам, предполагает, что дефекты связывания липидов и образования канальцев имеют отношение к патогенезу мышечной дистрофии с дефицитом дисферлина.

Дефицит дисферлина увеличивает высвобождение SR Ca

²⁺ и способность к физической нагрузке

Поскольку наши данные указывают на неожиданно непосредственную роль дисферлина в Т-тубулогенезе, и поскольку система Т-канальцев играет решающую роль в связывании ЭК, мы проанализировали внутриклеточный гомеостаз Ca ²⁺ у мышей дикого типа и мышей с нокаутом DYSF . У мутантных мышей последние три экзона гена DYSF (12 т.п.н.) были удалены, как описано ранее (Bansal et al., 2003). Мы выделили отдельные волокна из мышцы короткого сгибателя пальцев (FDB), волокна, нагруженные Fura-2-AM, и проанализировали переходные процессы Ca ²⁺ с помощью эпифлуоресцентной микроскопии. Амплитуда переходного процесса Ca ²⁺ в мышце с удаленным геном DYSF была значительно увеличена по сравнению с таковой в волокнах дикого типа (фиг. 6A, B). Однако измерения также показали, что функция SR Ca ²⁺ -АТФазы SERCA, которая регулирует перенос Ca ²⁺ обратно в SR, не изменилась (рис.S3A). Кроме того, связывание канала Ca ²⁺ L-типа (также известного как дигидропиридиновый рецептор; DHPR) и рианодинового рецептора (RyR), по-видимому, не изменилось, поскольку не было различий во времени до пика переходных процессов Ca ²⁺. наблюдается (рис. S3A). Кроме того, не было обнаружено никаких различий в исходной флуоресценции, что указывает на аналогичные уровни Ca ²⁺ в цитоплазме покоя в волокнах дикого типа и в волокнах с делецией гена DYSF (фиг. S3A). Мы посчитали, что повышенное высвобождение Ca ²⁺ произошло либо из-за повышенного содержания SR Ca ²⁺, либо из-за увеличения поступления Ca ²⁺ из магазина (SOCE), и проверили эти гипотезы по очереди.Кофеин использовали для открытия RyR и индукции высвобождения SR Ca ²⁺. Эти транзиенты Ca ²⁺ не различались по мышечным волокнам дикого типа и по удаленному гену DYSF , что позволяет предположить, что содержание SR Ca ²⁺ не изменилось (фиг. S3B, C). Мы измерили SOCE после истощения SR Ca ²⁺ с помощью тапсигаргина. Было обнаружено, что вход Ca ²⁺ после истощения запасов аналогичен в волокнах с удаленным геном DYSF и волокнах дикого типа (фиг. S3D). Волокна модели мыши mdx служили контролем (Boittin et al., 2006) и показали увеличение SOCE (рис. S3D). Чтобы проверить, приводит ли дефицит дисферлина к изменениям экспрессии белков, необходимых для связывания EC, которые затем могут быть ответственны за измененное высвобождение Ca ²⁺, мы провели вестерн-блоттинг и количественный (q) ПЦР-анализ в организме дикого типа. и мышца с удаленным геном DYSF . DHPR, RyR1, RyR1-стабилизирующий белок кальстабин1 (также известный как FKBP1A), Bin1, SERCA (кодируемый ATP2A2 ), два SOCE-компонента Orai1 и Stim1, Ca ²⁺-связывающий белок кальсеквестрин и белки триады junctophilin -1 и мицугумин-29 (также известный как SYPL2).Уровни белка и мРНК белков, участвующих в связывании EC, существенно не различались между мышцами дикого типа и мышцами с удаленным геном DYSF (фиг. S4A-C). Это согласуется с нашей гипотезой о том, что белок дисферлин выполняет свою функцию непосредственно в системе Т-канальцев. Иммунофлуоресцентное окрашивание двух основных белков, участвующих в процессе связывания EC, RyR1 и DHPR, не показало измененной локализации в мышечных волокнах дикого типа по сравнению с DYSF, гены (рис.S4D).

Рис. 6.

Измененный гомеостаз Ca ²⁺ в мышцах мышей с нокаутом DYSF коррелирует с амбивалентными фенотипами пациентов. (A, B) Повышенное стабильное высвобождение Ca ²⁺ в мышце с удаленным геном DYSF : переходные амплитуды Ca ²⁺, измеренные в мышечных волокнах FDB, нагруженных Fura-2, молодых мышей при стимуляции 1 Гц . * P <0,05 по сравнению с образцом DYSF ^{+ / +} (тест Стьюдента t ), N = 4 мыши и 36–67 волокон на группу. mdx : мыши с дефицитом дистрофина. (B) Репрезентативные записи, количественная оценка которых показана в A. (C, D) Произвольный бег колеса мышей дикого типа и мышей с дефицитом дисферлина. Молодые мыши с дефицитом дисферлина демонстрируют повышенную устойчивость к утомлению in vivo . (C) Средняя скорость за 24 часа. (D) Общее расстояние за 24 часа. * P <0,05 (двусторонний дисперсионный анализ), N = от 9 до 23 мышей на группу (см. «Материалы и методы»).

Наконец, мы спросили, отражают ли мыши с дефицитом дисферлина замечательный фенотип многих пациентов с дисферлином, которые демонстрируют повышенную мышечную силу до начала заболевания. Мы проанализировали расстояние и скорость произвольного бега колесом у мышей, лишенных дисферлина, в продольном эксперименте с использованием молодых (4 недели), подростков (12, 20, 40 недель) и старых мышей (75, 90 недель). Ежедневное произвольное беговое поведение мышей, содержащихся в индивидуальном помещении, регистрировали с помощью обычного бегового колеса, которое было подключено к компьютеру. В соответствии с транзиентами с повышенным содержанием Ca ²⁺ молодые и подростковые мыши, лишенные дисферлина, обладали большей способностью к физической нагрузке, чем мыши дикого типа (фиг. 6C, D). Поскольку не было сдвига в весе животных и спектрах типов волокон, а также не было гипертрофии волокон (рис.S5E-G), повышенное миоплазматическое высвобождение Ca ²⁺ могло быть причиной повышенной переносимости физической нагрузки. После возраста 12 недель наблюдалось снижение мышечной функции из-за прогрессирующего мышечного заболевания (рис. 6C, D), что согласуется со снижением мышечной силы после этого возраста (Grose et al. , 2012).

ОБСУЖДЕНИЕ

Дисферлин участвует в восстановлении мембраны скелетных мышц и биогенезе Т-канальцев, но механизм его действия остается неясным (Ampong et al., 2005; Bansal et al., 2003; Купер и Хед, 2014; Demonbreun et al., 2013; Kerr et al., 2013; Klinge et al., 2010b, 2007). Мы рассмотрели биохимическую и клеточную функцию дисферлина в нескольких экспериментальных системах: во-первых, дисферлин экспрессировался в немышечных клетках. Эта система выявляет фенотип экспрессии дисферлина в отсутствие эндогенного дисферлина и других известных белков Т-канальцев, таких как Bin1 или кавеолин-3. Мембранно-тубулирующая функция дисферлина в этой системе является убедительным показателем его роли как морфогенетического фактора мембраны.Эта модель подтверждается открытием, что канальцы дисферлина доступны через плазматическую мембрану; Канальцы дисферлина контактируют с плазматической мембраной либо напрямую, либо посредством быстрого эндоцитоза (Oulhen et al., 2013). Экспрессию дисферлина в немышечных клетках далее использовали для изучения липид-связывающей специфичности дисферлина, и мы показали, что дисферлин рекрутирует фосфолипид PI (4,5) P ₂. Эти данные подтверждаются анализом и экспрессией дисферлина в клетках C2C12.Клетки C2C12 представляют собой миобластные клетки мыши, которые при дифференцировке демонстрируют морфологические и функциональные особенности мышечных клеток. В этих клетках дисферлин локализован в системе Т-канальцев, которая сильно зависит от PI (4,5) P ₂. Кроме того, экспрессия дисферлина in vitro подтверждает результаты других экспериментальных систем в отношении мембранных канальцев и липидной специфичности. В этих системах человеческие миобласты с дефицитом дисферлина демонстрировали высокоагрегированные Т-канальцы, а регенерация после мышечного повреждения in vivo выявила аномальную морфологию Т-канальцев в мышцах мыши с удаленным геном DYSF , что подчеркивает роль дисферлина в мембранных канальцах.Наконец, анализ модели мышей с дефицитом дисферлина указал на аномальный гомеостаз Ca ²⁺, объясняя необычное беговое поведение, которое мы наблюдали в нашем продольном эксперименте, и неоднозначный фенотип заболевания у пациентов с дефицитом дисферлина. Важно отметить, что все функции были подтверждены использованием мутаций, полученных от пациентов (в клеточных системах и в системах in vitro, ).

Трубочки дисферлина мембраны

in vitro и в клеточных системах

Мембранные канальцы, образованные дисферлином в немышечных клетках, обладают морфологическими и биохимическими характеристиками, аналогичными характеристикам системы Т-канальцев скелетных мышц, что указывает на специфический эффект дисферлина. в формировании Т-канальца.Мы предполагаем, что способность формировать систему Т-канальцев является основной молекулярной и клеточной функцией белка дисферлина.

Функция дисферлина по формированию кривизны мембран согласуется с данными, указывающими на модифицирующую мембрану функцию C2 доменов дисферлина (Marty et al., 2013). Было высказано предположение, что C2 домены в мульти-C2 доменном белке действуют синергетически, создавая кривизну мембраны, которая ведет к канальцеванию (McMahon et al., 2010). Три или более домена C2 присутствуют в членах семейства ферлинов, «белков множественных доменов C2 и трансмембранных областей» (MCTP) (Shin et al., 2005) и в расширенных синаптотагминах (Min et al., 2007). Последние способны опосредовать связывание Ca ²⁺-зависимых фосфолипидов, тогда как MCTP, по-видимому, не взаимодействуют с отрицательно заряженными или нейтральными фосфолипидами (Shin et al., 2005), а вместо этого связываются с Ca ²⁺ с высокой аффинностью. . Мы предполагаем, что один или несколько доменов C2 дисферлина могут вставляться в ближайший листок липидного бислоя как клин, и, кроме того, что некоторые из этих доменов, генерирующих кривизну мембраны, ориентированы продольно, чтобы создавать (Т-) канальцы.Наша работа, однако, также показывает, что образование канальцев не является универсальным свойством членов семейства ферлинов, поскольку экспрессия отоферлина или миоферлина не вызывает мембранных канальцев. Отоферлин и миоферлин представляют собой паралоги дисферлина с несколькими доменами C2 и аналогичной доменной структурой. Это подчеркивает особую функцию дисферлина в семействе ферлиновых белков.

Мы показали, что мембраны, индуцированные дисферлином, способны привлекать те фосфолипиды, которые являются важным компонентом системы Т-канальцев.Когда мы разложили PI (4,5) P ₂, дисферлин больше не мог индуцировать образование канальцев в немышечных клетках, что указывает на то, что присутствие PI (4,5) P ₂ является важным требованием. для образования дисферлин-зависимых Т-канальцев. Этот вывод согласуется с обогащением PI (4,5) P ₂ в Т-канальцах (Lee et al., 2002; Milting et al., 1994). Мы смогли показать, что истощение PI (4,5) P ₂ также изменяет систему Т-канальцев в мышечных трубках C2C12, усиливая связь между дисферлин-зависимым связыванием фосфолипидов и биогенезом системы Т-канальцев.Учитывая известный морфологический дефект системы Т-канальцев с дефицитом дисферлина (Al-Qusairi and Laporte, 2011; Demonbreun et al. , 2013), локализация белка в развивающейся системе Т-канальцев (Klinge et al., 2010b ) и свойств мембранных канальцев дисферлина, подразумевается прямая роль дисферлина в образовании / биогенезе этой клеточной органеллы. Связанные с заболеванием мутации DYSF мешают связыванию фосфолипидов и свойствам мембранных канальцев, предполагая, что дефекты связывания липидов и образования канальцев имеют отношение к патогенезу дисферлин-дефицитной мышечной дистрофии.Это подтверждается результатами нашей клеточной модели биогенеза Т-канальцев и нашими экспериментами по регенерации мышц in vivo и , которые демонстрируют функцию дисферлина, формирующую Т-канальцы.

Bin1 индуцирует кривизну мембраны вместе с PI (4,5) P ₂ и играет важную роль в биогенезе Т-канальцев (Lee et al., 2002; Wu and Baumgart, 2014). Эти данные вместе с нашими результатами показывают, что дисферлин и Bin1 оба необходимы для мембранных канальцев и образования Т-канальцев.Несмотря на функциональное сходство этих белков, структурные различия, которые мы обнаруживаем в Bin1- и дисферлин-зависимых канальцах, позволяют предположить, что эти белки действуют на разные субэлементы системы Т-канальцев. Основываясь на этих структурных различиях, мы также предполагаем, что дисферлин, локализованный в Т-канальцах, играет дополнительную роль ниже по течению, возможно, в отношении восстановления плазматической мембраны.

Результаты нашего исследования также подтверждают роль кавеолина-3, третьего белка, участвующего в биогенезе Т-канальцев, в качестве негативного регулятора дисферлина, модулируя его внутриклеточный перенос.Кавеолины ингибируют эндоцитоз дисферлина (Hernandez-Deviez et al., 2008), и это объясняет уменьшение индуцированных дисферлином мембранных канальцев при сверхэкспрессии кавеолина-3. Независимость индуцированной дисферлином мембранных канальцев от GTPase Dynamin2 указывает на то, что Bin1 и dysferlin действуют синергетически, но с разными механизмами, поскольку Bin1, как было показано, функционально взаимодействует с динамином2 в генерации кривизны мембраны (Nicot et al., 2007). Различные способы действия дисферлина и Bin1, хотя и участвуют в биогенезе одного и того же клеточного компартмента, могут объяснять развитие различных клинических фенотипов при дефиците белка.

Система Т-канальцев функционирует в связи с ЭК и миоплазматическим гомеостазом Ca ²⁺. Наши результаты показывают, что дефицит дисферлина приводит к аномальному гомеостазу Ca ²⁺ с увеличением переходных амплитуд Ca ²⁺ после стимуляции. Это также может объяснить, почему мышечная патология при дефиците дисферлина может быть уменьшена за счет блокирования канала Ca ²⁺ L-типа (Kerr et al., 2013) и длительного подавления высвобождения SR Ca ²⁺ (Hattori et al. al., 2007).

Недавнее исследование не обнаружило различий в вызванных транзиентах Ca ²⁺ в скелетных мышцах мышей с дефицитом дисферлина и предположило, что измененная регуляция Ca ²⁺ после травмы является причиной изменений Т-канальцев (Kerr et al., 2013). Поскольку одной только коррекции восстановления мембраны недостаточно для улучшения дистрофических изменений в мышцах с дефицитом дисферлина (Lostal et al., 2012), мы предлагаем модель, в которой дефицит дисферлина в первую очередь приводит к изменениям системы Т-канальцев. В нашей модели изменения переходных процессов Ca ²⁺ являются вторичными по отношению к морфологическим и функциональным изменениям системы Т-канальцев из-за дефицита дисферлина.

Около половины пациентов, страдающих дисферлин-дефицитной мышечной дистрофией, имеют повышенную мышечную работоспособность и становятся хорошими спортсменами до появления мышечной слабости (Biondi et al., 2013; Klinge et al., 2010a). Этот фенотип является уникальным среди нарушений мышечной атрофии, и его патофизиология неизвестна.Повышенные переходные амплитуды Ca ²⁺ не связаны с измененной экспрессией или локализацией белков Т-канальца или триады, и они не связаны с повышенным содержанием SR Ca ²⁺ или SOCE. Скорее, они могут быть результатом измененной кинетики высвобождения SR Ca ²⁺ из-за изменения процессов стробирования, кластеризации или переноса каналов, поскольку эти механизмы регулируются PI (4,5) P ₂ (Rodríguez-Menchaca et al. , 2012), который, в свою очередь, контролируется дисферлином в скелетных мышцах.Таким образом, мы предполагаем, что мутантный дисферлин индуцирует переходные процессы с высоким содержанием Ca ²⁺, ответственные за хорошее мышечное мастерство до появления слабости, тогда как именно первичное изменение мембран Т-канальцев в мышцах с дефицитом дисферлина лежит в основе дефектного восстановления и дифференцировки мембран. в конечном итоге приводит к мышечной дистрофии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные

Мыши с удаленным геном DYSF , Dysftm1 ^Kcam / Dysftm1 ^Kcam , были любезно предоставлены профессором Университета Кейт Бушби, Великобритания, с одобрения профессора Кейт Бушби. Мышиные региональные ресурсные центры (MMRRC), США.Однопометники дикого типа использовались в качестве контроля. Мышей содержали в стандартных условиях и лечили в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях (ETS 123). Эксперименты были одобрены разрешениями, выданными Landesamt für Verbraucherschutz, Ольденбург, Германия (Aktenzeichen 33.14.42502-04 / 085/08 и 33.9-42502-04-10 / 0192).

ДНК-конструкции

pcDNA3.1-дисферлин-Myc был получен из pcDNA4-EGFP-DFL.Последовательность DYSF клонировали в сайты Eco RI и Not I вектора pcDNA3.1 (+) Myc-His, и стоп-кодон удаляли с использованием праймеров OST630 и OST631. Патогенные мутации были введены в конструкции дисферлина посредством DpnI-опосредованного сайт-направленного мутагенеза с использованием праймеров OST907 и OST908 для pcDNA4-EGFP- DYSF ^V67D (мутация C2A), OST575 и OST576 для pcDNA6 DFPYS DFP. (мутация C2B), OST577 и OST578 для pcDNA4-EGFP- DYSF ^R959W (мутация C2D), OST579 и OST580 для pcDNA4-EGFP- DYSF ^{R13581L и OST2000 (между OST5000 и OST2000) (между ^{и OST531L) для pcDNA4-EGFP- DYSF ^L1341P (мутация C2E). Две усеченные конструкции, содержащие последние два домена C2 с (pcDNA3.1-EGFP- DYSF- C2FGTM) или без (pcDNA3.1-EGFP- DYSF -C2FG) трансмембранного (TM) домена, были амплифицированы с использованием праймеров Jh22 и Jh4 (с ТМ) или Jh20 (без ТМ). Другой мутант с трансмембранной делецией (pcDNA4-EGFP- DYSF ^Δ ™) был получен посредством DpnI-опосредованного сайт-направленного мутагенеза с праймерами OST616 и OST617. pcDNA4-EGFP-минидисферлин-3 (MD3) был получен посредством DpnI-опосредованного сайт-направленного мутагенеза с праймерами JH53 и JH54 (Azakir et al., 2012). Последовательность TagRFP амплифицировали с использованием праймеров pKG9 и pKG10 и вставляли в сайты Hind III и Eco RI вектора pcDNA3.1-Myc-His. Последовательность BIN1 амплифицировали с использованием праймеров pKG7 и pKG8 и вставляли в сайты Eco RI и Not I вектора pcDNA3.1-TagRFP. Для бактериальных экспрессионных конструкций дисферлина вектор pET41a был расщеплен Nde I и Bgl II, и было выполнено заполнение Кленова с последующим тупым лигированием для удаления метки глутатион-S-трансферазы (GST) из вектора. N-концевой His6-меченный DYSF затем вставляли в сайты Kpn I и Not I вектора (pET41aΔN-B-His6-DYSF). Мутация DYSF ^V67D была вставлена с использованием мутагенеза DpnI с использованием праймеров OST907 и OST908 (pET41aΔN-B-His6- DYSF ^V67D). MD3 был дополнительно клонирован в сайты Eco, RI и Not, I вектора pGEX6p1 (pGEX6p1-minidysferlin-3). Последовательность BIN , 1 была клонирована в сайты Bam HI и Not I вектора pGEX6p2 (pGEX6p2-Bin1).Все конструкции были проверены секвенированием ДНК. Все олигонуклеотиды, использованные в этом исследовании, перечислены в таблице S1, а все конструкции перечислены в таблице S3.}}

Культура клеток, иммунофлуоресценция, живое окрашивание и микроскопия

Клетки HeLa и COS-7 культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), содержащей 1% глутамин, 1% пенициллин-стрептавидин и 10% фетальную сыворотку теленка (FCS). Клетки C2C12 культивировали в среде DMEM, содержащей 15% FCS. Дифференцировку вызывали заменой FCS 3% лошадиной сывороткой.Конструкции ДНК трансфицировали с использованием реагента для трансфекции Effectene (Qiagen) и наблюдали через 48 часов. Для иммунофлуоресцентного окрашивания клетки фиксировали в течение 20 минут 4% параформальдегидом (PFA) и блокировали 3% лошадиной сывороткой и 0,5% сапонином в PBS. Первичные и вторичные антитела разводили в блокирующем растворе, и клетки инкубировали с антителами в течение 1 ч при комнатной температуре. Меченые Myc и гемагглютининовые (HA) конструкции окрашивали антителом против Myc (1: 200, Cell Signaling, 2272S) или антителом против HA (1: 100, ab9110, Abcam).Анти-PDI (1: 500, ab2792), анти-Lamp1 (1: 600, ab24170), анти-Гольджи (1: 100, белок Гольджи 58K, ab27043), анти-дисферлин (1: 500, ab124684) и анти- антитела к динамину2 (1: 500, ab151555) были приобретены у Abcam; Антитело против Pex14 было приобретено в ProteinTech (1: 500, 10594-1-AP). Антитела против Ca _v 1.2 (1:50, sc-103588) и против амфифизина-II (anti-Bin1) (1: 500, sc-13575) были приобретены в Santa Cruz. Использовали вторичные антитела (1: 500), конъюгированные с Cy3 (Jackson ImmunoResearch) или Alexa-Fluor-488 (MoBiTech).Колокализация была проанализирована путем расчета коэффициентов Пирсона и Спирмена (PSC) с использованием подключаемого модуля колокализации ImageJ PSC (imagej.nih.gov). Интенсивность флуоресценции EGFP измеряли с помощью ImageJ. Флуоресценцию умножали на анализируемую площадь и рассчитывали процент площади, покрытой флуоресценцией. Для экспериментов по детубуляции клетки обрабатывали 10 мМ β-метилциклодекстрином (β-MCD) или 30 мкМ нокодазолом в течение 30 мин и затем фиксировали. Анализировали три партии по 100 клеток на мутант.Для дикого типа и мутантов G229W, R959W и R1331L были проанализированы девять партий по 100 клеток. Клетки наблюдали с помощью Axioimager M1 (Zeiss), оборудованного линзой Plan Neofluar 100 × / 1.3 Oil и камерой AxioCam HRm (программное обеспечение AxioVision Rel. 4.8, Zeiss), и деконволюцию стеков z проводили. Анализ канальцев Bin1 и дисферлина в клетках COS-7 выполняли с использованием конфокальных изображений (Inverted IX81 Olympus Microscope, Software FV10-ASW, UPLANSApo 60x / 1.35 oil-immersion объектива). Анализ скелета был модифицирован из Morrison and Filosa (2013) с использованием ImageJ.Изображения были преобразованы в двоичные изображения, скелетонизированы и проанализированы с использованием плагина AnalyzeSkeleton (imagejdocu.tudor.lu/) для определения количества точек ветвления и конечных точек, а также длины ветвления. 3D-визуализацию конфокальных стопок z выполняли с помощью программы Imaris. Окрашивание плазматической мембраны FM4-64 (Life Technologies) выполняли в соответствии с инструкциями производителя. Клетки на покровных стеклах инкубировали в течение 40 с с 10 мкМ FM4-64 в HBSS (137 мМ NaCl, 5.4 мМ KCl, 0,25 мМ Na ₂ HPO _4, 0,44 мМ KH ₂ PO ₄, 1,3 мМ CaCl ₂, 1,0 мМ MgSO ₄, 4,2 мМ NaHCO ₃), промыт HBSS и изображение сразу в течение следующих 3 минут [LSM 710, программное обеспечение ZEN 2009 (Zeiss), оснащенное масляно-иммерсионным объективом Plan-Apochromat × 63 / 1,40]. ImageJ использовали для анализа внутриклеточной интенсивности FM4-64. Для покадровых экспериментов использовали 4-луночные микропрепараты Ph ⁺ (там же), а эксперименты проводили с микроскопом Olympus IX 81 (Camera OBS Mega / View; программное обеспечение, xcellence pro 1.2; Маслоиммерсионный объектив UPLANSApo 60 × / 1,35 или 100 × / 1,4). Для иммунофлуоресцентного анализа скелетных мышц отдельные волокна выделяли из мышей FDB дикого типа и мышей с удаленным геном DYSF , высевали на покрытые ламинином покровные стекла и инкубировали в течение ночи в DMEM, содержащей 5% FCS. Затем волокна промывали холодным PBS, фиксировали ледяным 100% этанолом при -20 ° C в течение 20 минут, блокировали 5% бычьим сывороточным альбумином (BSA) и 0,5% Triton X-100. Волокна инкубировали с первичными антителами (анти-RyR1, 1: 100, Cell Signaling, 8153; анти-DHPR, 1:50, Thermo Scientific, MA3-920) в течение ночи при 4 ° C и со вторичными антителами (1: 500), конъюгированными. в Cy3 (Jackson ImmunoResearch) или Alexa-Fluor-488 (MoBiTech) в течение 1 часа при комнатной температуре.

Эксперименты с миобластами

Миобласты человека [Коллекция культур мышечной ткани (MTCC)] культивировали в среде для роста скелетных мышц (Promocell), содержащей 10% FCS, 1,5% глутамакса (100 ×, Gibco) и 50 мкг / мл гентамицина. Дифференцировку индуцировали заменой ростовой среды на DMEM, содержащую 5% лошадиной сыворотки, в течение 7 дней. Мембрану миобластов человека окрашивали DiIC ₁₆ (3) (Thermo Fisher Scientific). Дифференцированные клетки промывали сахарозным какодилатным буфером (SCB; 0.1 М сахарозы, 0,1 М какодилат натрия, pH 7,4), инкубировали с DiIC ₁₆ (3), разведенным до 12,5 мкг / мл в SCB в течение 10 мин при комнатной температуре, и визуализировали с помощью конфокальной микроскопии (Inverted IX81 Olympus Microscope, программное обеспечение FV10 -ASW, масляно-иммерсионный объектив UPSLANSApo 60 × / 1,35).

Экспрессия белка

Конструкции, экспрессирующие His6 – DYSF, His6 – DYSF ^V67D, His6 – DYSF ^Δ ™, GST – минидисферлин и GST – Bin1, были трансформированы в компетентные Escherichia coli 9021-RIL или BL21417 / rosettaia 9021-RIL. ячеек.50 мл ночной культуры выращивали в Luria Bertani (LB), содержащей антибиотики. Эту культуру использовали для инокуляции основной культуры 500 мл LB, содержащей антибиотики. При OD ₆₀₀ 0,6 экспрессию белка индуцировали 0,5 мМ изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) в течение 3 часов при 30 ° C. Клетки собирали при 4066 g в роторе центрифугирования Sorvall GSA в течение 20 минут, промывали холодным PBS, центрифугировали при 1464 g в течение 20 минут.Клетки замораживали при -80 ° C, оттаивали на льду и из расчета на 1 г осадка клетки ресуспендировали в 10 мл 300 мМ NaCl в PBS, pH 7,3, содержащем полные ингибиторы протеазы без EDTA (Roche), 50 ЕД ДНКазы. I и 50 мкг / мл лизоцима. Ресуспендированные клетки инкубировали в течение 30 минут при 4 ° C, а лизат клеток замораживали в аликвотах по 1 мл при -80 ° C. Лизат размораживали на льду и дважды обрабатывали ультразвуком (Ultrasonic processor, Hielscher) в течение 10 с с установкой амплитуды 30%.

Вестерн-блоттинг

Мышцу Quadriceps femoris выделяли от мышей дикого типа в возрасте 9–11 недель и мышей с удаленным геном DYSF , замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C.Образцы мышц гомогенизировали в буфере для гомогенизации (12,5 мМ сахарозы, 0,3 мМ NaN ₃, 10 мМ NaHCO ₃, pH 7, 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторид, полные ингибиторы протеазы) с TissueRuptor (Qiagen), и концентрацию белка определяли по Анализ BCA (Uptima). Образцы смешивали с 4-кратным буфером для образцов и инкубировали в течение 5 мин при 95 ° C. 20 мкг белка загружали в 8-12% гели SDS (в зависимости от размера белка) и переносили на нитроцеллюлозные мембраны. Белки детектировались антителами против дисферлина (1: 500, NCL Hamlet, Novocastra), Bin1 (1: 500, Santa Cruz), мицугумина-29 (1: 1000, ab106438, Abcam), SERCA (1: 2000, ab2818, Abcam ), FKBP12 (1: 1000, ab24373), L-тип Ca ²⁺ канал (1: 200, MA3-920, Thermo), RyR (1: 500, 8153, передача сигналов ячейки), TRPC3 (1: 1000, ab51560, Abcam), Orai1 (1: 200, ab59330, Abcam), Stim1 (1: 200, 610954, BD Biosciences), Calsequestrin (1: 1000, ab3516, Abcam) и GAPDH (1: 50000, G8795, Sigma). Вторичные антитела (1: 10000) конъюгировали с пероксидазой хрена (HRP) против кроличьих или антимышиных IgG. Денситометрию выполняли с использованием программного обеспечения для анализа ImageJ, и интенсивности нормализовали по GAPDH.

qPCR

Общую РНК выделяли из четырехглавой мышцы бедра дикого типа и мышей с удаленным геном DYSF с использованием peqGold TriFast ™ (PEQLAB) в соответствии с протоколом производителя. Для синтеза кДНК 1 мкг РНК использовали с праймерами oligo-dT и обратной транскриптазой Superscript III (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя.КДНК хранили при -20 ° C или использовали непосредственно для количественной ПЦР с использованием праймеров, перечисленных в таблице S2. Все реакции проводили с использованием реагента SYBR Green Supermix для ПЦР (BioRad) и системы обнаружения одноцветной ПЦР в реальном времени MyiQ (BioRad). Уровни мРНК были нормализованы к уровням GAPDH.

Эксперименты по связыванию липидов

Для приготовления липосом выпаривали 10 мкл липидов Folch-фракции (100 мг / мл, Sigma) с 5% PI (4,5) или без него P ₂ (Avanti Polar Lipids) в потоке азота. Затем липиды гидратировали 750 мкл гидратного раствора (20 мМ Трис-HCl, pH 7,4, 100 мМ NaCl, 150 мМ сахароза, 1 мМ EDTA). Раствор по каплям добавляли к липидам при интенсивном встряхивании. Для экспериментов по липосомным канальцам липосомы затем экструдировали 21 раз через 100-нм мембраны (Echelon). Анализ флотации липосом был модифицирован из работы Klopfenstein and Vale (2004). 5 мкл белка Bin1 (2 мкг / мкл) и 40 мкл лизатов дисферлина (5 мкг / мкл) добавляли к 100 мкл липосом в присутствии 2.5 мМ CaCl ₂, и смесь липосомных белков инкубировали в течение 20 мин при 37 ° C. Концентрацию сахарозы доводили до 1,6 М, используя 2 М исходный раствор, и на смесь белок-липосомы накладывали 300 мкл 1,4 М сахарозы, 150 мкл 0,4 М сахарозы и 300 мкл 0,25 М сахарозы. Градиентное центрифугирование проводили в роторе TLS55 в течение 60 мин при 201000 g и 4 ° C. Собирали фракции по 200 мкл и анализировали с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга.

Анализ липосомных канальцев

Для экспериментов с липосомными канальцами липосомы готовили в растворе для гидратации, содержащем 30 мМ трис-HCl, pH 7. 4, 150 мМ NaCl, 300 мМ сахароза и 1 мМ ЭДТА. 2,5 мкл лизата белка (10 мкг / мкл) и белка Bin1 (2 мкг / мкл) добавляли к 7,5 мкл липосом в присутствии 2,5 мМ CaCl ₂, и смесь липосомных белков инкубировали при 37 ° C в течение 20 мин. Смесь липосома-белок разбавляли 1:10 гидратным раствором и аликвоты по 6 мкл абсорбировали на медных решетках, покрытых формваром и углеродом (Polysciences) в течение 45 с. Раствор переносили на ватман и окрашивали в течение 20 с 2% фосфорновольфрамовой кислотой (ФТА).Раствор PTA промокали, сетку промывали гидратным раствором, снова промокали, сушили на воздухе и анализировали с помощью электронной микроскопии (LEO EM912 Omega, Zeiss) с осевой камерой 2048 × 2048-CCD (Proscan).

Электронная микроскопия

Для окрашивания Т-канальца камбаловидная мышца из Dysftm1 ^Kcam/ Dysftm1 ^Kcam, однопометники дикого типа и mdx мышей были вырезаны in vivo на , растянувшись на длину , закрепили и зафиксировали в 2% глутаровом альдегиде в буфере Соренсена в течение 15 мин. Затем мышцы были обрезаны, и сегменты средней части живота были разрезаны на блоки размером 1,0 мм × 0,5 мм × 0,5 мм. Эти образцы инкубировали при комнатной температуре в течение ночи в 2% -ном глутаральдегиде в буфере Соренсена. Их постфиксировали в 2% четырехокиси осмия с 0.8% ферроцианидом калия в течение 1 ч при комнатной температуре. После обезвоживания образцы заливали эпоксидной смолой, делали срезы толщиной 80-90 нм на ультрамикротоме Leica, собирали на сетки и исследовали при 100 кВ без дальнейшего окрашивания на просвечивающем электронном микроскопе (LEO EM912 Omega, Zeiss).

Регенерация in vivo
Цикл дегенерации и регенерации индуцировали у самцов мышей в возрасте 12 недель путем подкожной инъекции нотексина с помощью инсулинового шприца U-100 на 0,5 мл (50 мкл при 4 мг / мл в 0,9% растворе). NaCl; латоксан) в дорсолатеральную сторону левой задней конечности, чтобы омыть токсином нижележащую камбаловидную мышцу, как описано ранее (Klinge et al., 2010b). Анализ проводили через 10 дней после инъекции нотексина.
Окрашивание сукцинатдегидрогеназой
Для окрашивания сукцинатдегидрогеназой (SDH) были выделены икроножные мышцы у мышей дикого типа и мышей с делецией гена DYSF в возрасте 8 недель, и мышцы были помещены в питательную среду (Tissue-Tek) , замороженные в изопентане, охлажденном в жидком азоте.Срезы вырезали на микротоме и инкубировали 30 мин при 37 ° C в окрашивающем растворе SDH (0,011 мг / мл C ₄ H ₄ Na ₂ O ₄, 0,024 M Na ₂ HPO ₄ × 2H ₂ 0, 0,024 M KH ₂ PO ₄, pH 7,4, 0,7 мг / мл нитросинего тетразолия, 10 мМ MgCl ₂, 0,23 мг / мл менадиона) и промывали в воде в течение 2 мин. . Затем срезы фиксировали в 10% формалине в течение 10 мин, промывали водой и закрепляли с помощью Aquatex (Merck).Изображения анализировали с помощью Axioimager M1 и AxioVision Rel. 4.8 программное обеспечение (Zeiss).
Выделение одиночных мышечных волокон
FDB-мышцы были вырезаны у мышей в возрасте 8–15 недель после анестезии изофлураном и после смещения шейного отдела позвоночника. Изоляция отдельных волокон скелетных мышц была изменена из Capote et al. (2005). Мышцы FDB инкубировали в модифицированном растворе Tyrode (145 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1 мМ MgSO ₄, 10 мМ HEPES, 10 мМ глюкозы, 2 мМ CaCl ₂, pH 7.4), содержащий 4 мг / мл коллагеназы типа 2 (Worthington), в течение 50 мин при 37 ° C для ферментативной диссоциации мышечных волокон. Затем мышечные волокна механически отделяли от сухожилий и механически диссоциировали с помощью пипетки.
Измерение транзиентов внутриклеточного Ca
²⁺, SR Ca ²⁺ и SOCE
Ca ²⁺ транзиентов измеряли с помощью эпифлуоресцентной микроскопии при комнатной температуре. Изолированные одиночные волокна скелетных мышц помещали в стеклянные камеры, покрытые ламинином, и инкубировали в течение 30 минут до оседания волокон. Затем волокна инкубировали в течение 20 мин с индикаторным красителем Ca ²⁺ Fura-2-AM (10 мкмоль / л, MoBiTec) и помещали на предметный столик инвертированного микроскопа Nicon Eclipse TE 200-U. Клетки подвергали суперфузии с модифицированным раствором Тироде при постоянном потоке 80 мл / ч. Волокна стимулировали в электрическом поле с частотой 1 Гц. Fura-2-AM поочередно возбуждали на 340 и 380 нм, используя ксеноновую дуговую лампу мощностью 75 Вт, и флуоресцентное излучение при 510 нм регистрировали с помощью фотоумножителя (IonOptix Corp, Milton).Фоновую флуоресценцию при 340 и 380 нм вычитали, и коэффициент испускания флуоресценции использовали в качестве меры внутриклеточной концентрации Ca ²⁺. Анализ переходных процессов Ca ²⁺ был выполнен с помощью IONWizard версии 5.0 (IonOptix). Содержание SR Ca ²⁺ определяли путем измерения переходных процессов Ca ²⁺, индуцированных кофеином. Волокна FDB инкубировали в течение 4 мин в растворе Тирода без Ca ²⁺, содержащего 20 мкМ N-бензил-п-толуолсульфонамида (BTS). Высвобождение содержания SR Ca ²⁺ было вызвано добавлением 30 мМ кофеина и 20 мкМ BTS в растворе Тирода. Для измерения SOCE запас волокон FDB SR Ca ²⁺ был истощен посредством инкубации с 5 мкМ тапсигаргина, и вход Ca ²⁺ был измерен после повторного добавления Ca ²⁺ в раствор Тирода. Для измерений Ca ²⁺ было проанализировано N = 4 мыши и 67 (дикий тип), 61 (нокаут) или 36 (модель mdx на мышах) волокна.Для экспериментов с кофеином были проанализированы N = 8 мышей и 29 (дикий тип), 27 (нокаут) или 15 (модель mdx на мышах) волокон.
Эксперимент с бегущим колесом
Мышей дикого типа и мышей без дисферлина содержали по отдельности, и клетки устанавливали с обычным беговым колесом, когда мыши находились в возрасте 4, 12, 20, 40, 75 и 90 недель в течение определенного периода. от 3 недель. Беговое колесо было подключено к компьютеру, и ежедневная произвольная беговая активность контролировалась. Один оборот соответствует пробегу 0.38 мес. К оси колеса был подключен датчик вращения с разрешением 16 на оборот. Активность колес регистрировали с использованием специального программного обеспечения на основе LabVIEW ™ (National Instruments Corp.). В первом периоде бега мыши достигли максимальной эффективности бега на 12 день, а в следующие периоды бега на 8 день. Среднее дневное расстояние (м) и среднесуточная скорость бега (м / с) были рассчитаны на основе всех значений выше порогового значения. 40% средней дистанции бега началось с 12-го или 8-го дня соответственно.В этом эксперименте анализировали беговое поведение 17-20 мышей дикого типа и 14-23 мышей без дисферлина во временных точках 4-75 недель. Некоторых мышей пришлось исключить из анализа в разные моменты времени, потому что клетка была недоступна для записи по техническим причинам во время длительной записи (дефект датчика вращения, поломка компьютера). В последний период анализа были проанализированы 13 мышей дикого типа и 9 мышей без дисферлина, так как несколько животных умерли до этого момента.
Статистика
Статистический анализ проводился с помощью Excel или GraphPad Prism 4 с использованием теста Стьюдента t или двухфакторного дисперсионного анализа для повторных измерений.Данные представлены как среднее ± s.e.m. P -значения <0,05 считались статистически значимыми.
IJMS | Бесплатный полнотекстовый | Изменения в новых биомаркерах AKI после упражнений. Систематический обзор
Mingels et al.
(2009) [20] 70 бегунов-любителей в возрасте 47 (диапазон 30–68) лет марафон sCyst-C
Scherr et al.
(2011) [22] 102 здоровых бегуна-мужчины
возраст 42 ± 9 лет.5 лет Marathon sCyst-C
McCullough et al. (2011) [23] 25 здоровых бегунов
возраст 38,7 ± 9,0 лет
(13 женщин, 12 мужчин) Marathon sCyst-C
uNGAL
uKIM-1
Poortmans et al.
(2012) [25] 12 мужчин, занимающихся физкультурой
возраст 25 ± 5 лет 30 минут
беговая дорожка
при 80% VO ₂ max sCyst-C
Junglee et al.
(2012) [34] 20 здоровых активных взрослых
возраст 24 ± 4 года
(7 женщин, 13 мужчин) Спринт на 800 м pNGAL
uNGAL
uNGAL / uCr
Rullman et al.
(2012) [38] 10 здоровых мужчин
возраст 25 (диапазон 18–37) лет 60-минутный тест на велоэргометре
(20 минут при 50% VO ₂ макс;
+40 мин при 65 % от VO ₂ max) pNGAL
Lippi et al.
(2012) [40] 16 тренированных спортсменов-мужчин
возраст 42 (диапазон 34–52) лет 60 км
ультрамарафон sNGAL,
uNGAL, uNGAl / uCr
Junglee et al.
(2013) [35] 10 активных здоровых мужчин
возраст 20 ± 2 года 1. 60-минутный спуск с уклоном -10% + 40-минутный бег на беговой дорожке с уклоном 1% при 65% VO ₂ макс при темп. 33 ° C при относительной влажности 50%
2. 60-минутный бег на плоской дорожке + 40-минутный бег на беговой дорожке с уклоном 1% при 65% VO ₂ макс при темп.33 ° C при относительной влажности 50% pNGAL
uNGAL
uNGLA / u.f.
Mellor et al.
(2013) [42] 22 человека
возраст 36 ± 2,4 года
(7 женщин, 15 мужчин) подъем с уровня моря на 1085 м за 6 часов pNGAL
Sugama et al.
(2013) [59] 14 мужчин-триатлонистов
возраст 28,7 ± 7,9 лет Дуатлон:
бег 5 км + 40 км велогонки + 5 км бега uIL-6
uIL-8
Kanda et al.
(2014) [37] 9 нетренированных здоровых мужчин
возраст 24,8 ± 1,3 года Подъем на носки на одной ноге
10 подходов по 40 повторений упражнения с частотой 0,5 Гц с 3-х минутным отдыхом между подходами pNGAL
uNGAL
uFABP
Hewing et al.
(2015) [24] 167 бегунов-любителей
возраст 50,3 ± 11,4 года
(89 женщин, 78 мужчин) марафон sCyst-C
Андреаццоли и др.
(2017) [41] 18 профессиональных велосипедистов-мужчин
возраст 31,5 ± 4 года горный этап одного из крупнейших европейских соревнований профессионального велоспорта pNGAL
uNGAL
Mansour et al.
(2017) [46] 22 бегунов-любителей
возраст 44 (диапазон 22–63) лет
(13 женщин, 9 мужчин) марафон угал
уКИМ-1
УИЛ-6, УИЛ-8, uIL-18,
uTNFα, uYKL-40, uMCP-1
Bongers et al.
(2017) [44] 60 участников марша
возраст 29 ± 78 лет
(30 женщин, 30 мужчин) 30, 40 или 50 км в течение трех дней подряд uCyst-C, uNGAL, uNGAL / uCyst-C , uNGAL / Cr, uNGAL / uOsm
uKIM-1, uKIM-1 / uCyst-C, uKIM-1 / uCr, uKIM-1 / uOsm
Bongers et al.
(2018) [26] 35 активных здоровых мужчин
возраст 23 ± 3 года 150-минутный велоэргометрический тест при 80% ЧСС
до 3% гипогидратации
(образцы взяты через 30 и 50 минут) sCyst -C, uCyst-C
uNGAL, uNGAL / uCyst-C, uNGAL / uCr, uNGAL / uOsm
uKIM-1, uKIM / uCyst-C, uKIM-1 / uCr, uKIM-1 / uOsm
Spada al.
(2018) [48] 58 здоровых добровольцев
возраст 24 (диапазон 21–28) лет
(29 мужчин, 29 женщин) 4 мин HIIRT uNGAL, uNGAL / uCr
uIL-18, uIL- 18 / uCr
uCalbindin, uCalbindin / uCr
uTTF, uTTF / uCr
Wołyniec et al.
(2018) [47] 19 здоровых бегунов-любителей
возраст 35,74 ± 6,99 лет
(9 женщин, 10 мужчин) Тест бега на беговой дорожке УНГАЛ, УНГАЛ / УКР
УКИМ-1, УКИМ-1 / УКР
McDermott et al.
(2018) [39] 40 здоровых велосипедистов
возраст 52 ± 9 лет велоспорт на выносливость
(5,7 ± 1,2 ч) в жару
(33,2 ± 5,0 ° C, 38,4 ± 10,7% относительной влажности) sNGAL
Chapman et al.
(2019) [18] 12 здоровых взрослых
в возрасте 24 ± 5 лет
(3 женщины, 9 мужчин) 4-часовые упражнения в тепле
(35,1 ° C, 61% относительной влажности) pNGAL
uNGAL , угл / мкф
Wolyniec et al.
(2019) [45] 16 Здоровые бегуны-любители
36 лет.7 ± 8,2 года
(2 женщины, 14 мужчин) Беги на 10 и 100 км uCyst-C
uNGAL, uNGAL / uCr
uKIM-1, uKIM-1 / uCr
Jouffroy et al.
(2019) [51] 47 здоровых мужчин
возраст 43 ± 7 лет Ультрамарафон на 80 км uNGAL, uNGAL / uCr
uKIM-1, uKIM-1 / uCr
Poussel et al.
(2020) [27] 24 здоровых бегуна
возраст 36,5 (диапазон 24–57) лет
(1 женщина, 23 мужчины) Ультрамарафон на 120 км с 5700 м положительного набора высоты sCyst-C
uNGAL , uNGAL / uCr
Chapman et al.
(2020) [43] 13 здоровых взрослых
в возрасте 23 ± 2 года
(3 женщины, 10 мужчин) 2 часа тренировки в жару
(температура 39 ° C, относительная влажность 32%) uNGAL
uIGFBP -7
uTIMP-2
Kosaki et al.
(2020) [53] 116 взрослых без хронической болезни почек
возраст 62 (диапазон 24–83) лет
(31 женщина, 85 мужчин) инкрементальные короткие максимальные упражнения с использованием велоэргометра uL-FABP / uCr
Semen et al.
(2020) [50] 54 здоровых бегуна
возраст 47 ± 15 лет
(21 женщина, 33 мужчины) полумарафон после однократного приема 400 мг ибупрофена:
две группы:
1. с добавлением MOF -VVPP
2. Контроль uNGAL,
uCyst-C
uIL-6, uIL-8, uIL-18,
uTNFα
Semen et al.
(2020) [49] 1. 35 бегунов
возраст 44 ± 2 года
(17 женщин, 18 мужчин)
2. 45 бегунов
возраст 55 ± 2 года
(24 женщины, 21 мужчина) 1.Бег на 10 км
2. полумарафон uNGAL
Тренировка с отягощениями высокой интенсивности вызывает повреждение мышц и увеличивает биомаркеры острого повреждения почек у здоровых людей
Цитата: Spada TC, Silva JMRD, Francisco LS, Marçal LJ, Антонанджело Л., Занетта ДМТ и др. (2018) Высокоинтенсивные тренировки с отягощениями вызывают повреждение мышц и увеличивают биомаркеры острого повреждения почек у здоровых людей. PLoS ONE 13 (11): e0205791. https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0205791
Редактор: Джузеппе Ремуцци, Istituto Di Ricerche Farmacologiche Mario Negri, ITALY
Поступила: 11 апреля 2018 г .; Одобрена: 2 октября 2018 г .; Опубликовано: 6 ноября 2018 г.
Авторские права: © 2018 Spada et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.
Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.
Финансирование: Таня С. Спада была получателем гранта на степень магистра CNPq 133977 / 2015-3 от «Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico» (CNPq — Национальный совет по технологическому и научному развитию), Бразилия, из 2015–2017 гг. Эммануэль А. Бурдманн является получателем следующих исследовательских грантов: CNPq 305858 / 2013-0 от «Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico» (CNPq — Национальный совет по технологическому и научному развитию), Бразилия и FAPESP 2014 / 19286-4 из Фонда Ампаро в Пескисе ду Эстаду де Сан-Паулу (FAPESP, Исследовательский фонд Сан-Паулу), Сан-Паулу, Бразилия.Специального финансирования для этого исследования не было. Авторы заявляют, что у них нет других соответствующих финансовых интересов.
Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.
Введение
Адекватное и регулярное выполнение упражнений средней интенсивности обеспечивает хорошо известную пользу для здоровья. Он снижает риск инсулинорезистентности, метаболического синдрома и диабета 2 типа, снижает общую респираторную и сердечно-сосудистую смертность, снижает сердечно-сосудистую заболеваемость и предотвращает сердечные заболевания, снижает риск преждевременной смертности и эффективно предотвращает ряд хронических заболеваний [1–3].
Тем не менее, частота людей, регулярно выполняющих физические упражнения, остается низкой в развитых и развивающихся странах [4,5]. Одной из основных причин, о которых во всем мире сообщают люди об отсутствии физической активности, является недостаток времени для выполнения программы упражнений [6].
Интервальные тренировки высокой интенсивности (HIIT) стали одной из самых быстрорастущих программ упражнений в последние годы. Одна из основных причин его популярности заключается в том, что он дает преимущества, аналогичные обычным тренировкам с более короткими тренировками.Кроме того, практикующие HIIT считают его более динамичным и менее утомительным, чем обычные непрерывные занятия [7,8]. Хотя универсального определения не существует, ВИИТ обычно состоит из коротких серий последовательностей упражнений субмаксимальной интенсивности, разделенных периодами отдыха или упражнениями низкой интенсивности [9]. Еженедельные сеансы HIIT улучшают окислительную способность мышц, аэробную и анаэробную способность, снижают артериальное кровяное давление, снижают массу тела у пациентов с ожирением и улучшают регуляцию глюкозы и инсулинорезистентность при диабете 2 типа [7,8].Впоследствии была разработана высокоинтенсивная интервальная тренировка с отягощениями (HIIRT), чтобы объединить преимущества HIIT с работой над сопротивлением мышц. Соответственно, HIIRT следует той же методологии, что и HIIT, но использует упражнения с сопротивлением [10].
Тем не менее, хотя упражнения средней интенсивности безопасны, напряженные и высокоинтенсивные упражнения могут вызывать неблагоприятные последствия, включая рабдомиолиз и острое повреждение почек (ОПП), и они могут быть вредными для долгосрочных результатов для здоровья, особенно у плохо тренированных или малоподвижных частные лица [3].Фактически, недавно были опубликованы сообщения о случаях тяжелого рабдомиолиза с ОПН и без него, связанного с различными моделями высокоинтенсивных упражнений [11–13].
Учитывая растущее распространение высокоинтенсивных интервальных тренировок и потенциальные риски, связанные с нехваткой данных о его системных эффектах, это исследовательское исследование было направлено на оценку того, вызывает ли сеанс HIIRT повреждение мышц и почек у молодых, здоровых и физически активных людей. .
Методы
Этика
Это исследование было одобрено Этическим комитетом Медицинской школы Университета Сан-Паулу (Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, n ° 156/16).Все люди были проинформированы о возможных рисках и преимуществах исследования, согласились участвовать и подписали форму информированного согласия.
Дизайн исследования и участники
студента бакалавриата школы физического воспитания (Universidade de Guarulhos, Гуарульюс, Бразилия) были приглашены для участия в этом перспективном исследовании. Критерии включения: возраст> 18 лет, отсутствие хронических заболеваний, регулярные физические упражнения, отсутствие приема лекарств или диетических добавок.Критерии исключения: невозможность правильно выполнять предписанные упражнения и исходные лабораторные показатели сыворотки или мочи выше нормального диапазона.
Сбор данных
Сбор данных проводился за три разных визита, которые описаны ниже.
Первый визит.
Во время первого посещения мы объяснили участникам шкалы, используемые для оценки усилия и боли, шкалу оценки воспринимаемого напряжения Борга (RPE) и шкалу Borg CR10 (CR10P) для оценки боли соответственно.RPE — это числовая шкала от 6 до 20, используемая для измерения восприятия усилий, связанных с интенсивностью упражнений [14]. CR10P — это числовая шкала от нуля до 10, которая использовалась для оценки боли в бедре [14].
Участники были проинструктированы Табата и др. [15] выполнили приседания и выполнили один комплекс упражнений, чтобы проверить свои способности. Они получили инструкции по подготовке к сбору образцов крови и мочи, были проинструктированы о том, как правильно есть (люди были проинструктированы пить воду, когда испытывали жажду, и соблюдать обычный режим приема пищи, избегая тяжелой или слишком жирной пищи), и их попросили не выполнять любые упражнения в течение 48 часов перед посещениями 2 и 3.Кроме того, они были проинструктированы не принимать никаких лекарств или диетических добавок до и во время следующих посещений.
Мы получили рост и вес для всех людей и рассчитали индекс массы тела (ИМТ) по формуле вес / рост ².
Второй визит.
Первоначально участники заполняли шкалу CR10P, а затем были взяты образцы крови и мочи. Затем участники выполнили пять минут разминки на велоэргометре (Lifecycle 9500HR, Life Fitness, Lake Forest, IL, USA).
После этих процедур люди выполняли четыре минуты HIIRT (упражнения на корточки в стиле Табата). Сеанс HIIRT состоял из восьми подходов приседаний, выполняемых с максимальной скоростью и максимально возможным количеством повторений в течение 20 секунд с 10 секундами отдыха между подходами. Сразу после упражнения участники заполнили шкалы RPE и CR10P.
После упражнения участники выпили 300 мл водопроводной воды и отдыхали два часа. Это количество воды было дано после тренировки, потому что считалось достаточным для восполнения потерь в течение 4 минут тренировки и обеспечения адекватного диуреза для сбора пробы.Затем была завершена шкала CR10P и снова были собраны образцы крови и мочи.
Третий визит.
Через двадцать четыре часа после упражнения шкала CR10P была завершена, и были взяты образцы крови и мочи.
Сбор образцов.
Кровь собирали во флаконы на 5 мл с разделительным гелем и без ЭДТА. Образцы крови центрифугировали при 4500 об / мин в течение 20 минут при 4 ° C. Сыворотку использовали для оценки креатинина сыворотки (SCr), креатинфосфокиназы (CK) и миоглобина.Пятнадцать миллилитров каждого образца мочи переносили во флаконы Falcon, которые центрифугировали при 4500 об / мин в течение 20 минут при 4 ° C; Затем моча была разделена на две аликвоты и немедленно сохранена при -70 ° C для более поздней оценки биомаркеров мочи почечного повреждения. Остаток мочи использовался для измерения креатинина.
Лабораторные дозировки.
Креатинин оценивали с использованием метода Яффе (Cobas 8000 modular, ROCHE Diagnostics, Индианаполис, Индиана, США), КК с помощью УФ-теста и миоглобина с помощью метода электрохемилюминесценции.
Липокалин, связанный с желатиназой нейтрофилов в моче (UNGAL), интерлейкин 18 (IL-18), кальбиндин, микроальбуминурия (μalbum), фактор трилистника-3 (TFF3) и β-2 микроглобулин (β2M) оценивались с помощью Luminex xMAP (Bio -plex PRO II Wash Station, MAG-PIX, Millipore Corporation, Дармштадт, Германия).
Статистический анализ
Результаты оценивались с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Среднее значение и стандартное отклонение использовались для переменных с нормальным распределением.Медиана (с квартилями 25% и 75%) использовалась для переменных без нормального распределения. Данные анализировали с помощью двухкаудального непарного t-критерия Стьюдента, непараметрического дисперсионного анализа с повторными измерениями с последующим многократным пост-тестом Данна или дисперсионным анализом повторных измерений с последующим пост-тестом множественных сравнений Тьюки-Крамера, в зависимости от ситуации. Корреляцию между RPE и мышечными и почечными биомаркерами оценивали с помощью двухкаудальной ранговой корреляции Спирмена. Статистическая значимость была установлена на уровне p <0.05.
Результаты
Участники исследования
Шестьдесят шесть человек согласились участвовать. Они регулярно выполняли различные виды аэробных и анаэробных упражнений во время школьных уроков и личных тренировок, в основном силовые тренировки. Восемь человек были исключены: один из-за того, что не мог правильно выполнять упражнение, другой отрицал хронические заболевания при включении в исследование, но имел гипертонию до выполнения упражнения и поэтому был исключен, а шесть из-за того, что у них были исходные лабораторные показатели (перед выполнением упражнения) выше нормальный диапазон.В окончательную выборку для анализа вошли 58 человек (рис. 1), 29 мужчин и 29 женщин, в возрасте 24 лет (21–28 лет) и ИМТ 24,5 ± 2,8 (таблица 1). ИМТ был одинаковым для мужчин и женщин.
Весы Борга
RPE было 15 (15–18), что указывает на тяжелое усилие. Результаты по шкале CR10P для боли значительно увеличились с нуля до тренировки (0–1) до 1,5 через два часа после тренировки (0–3), p <0,001 по сравнению с до тренировки и до 4 через 24 часа после тренировки. -упражнение (2–5), p <0.001 против перед тренировкой и против двух часов. Результаты по шкале RPE и CR10P у мужчин и женщин были одинаковыми.
Маркеры мышечных повреждений
Статистически значимое увеличение КК произошло после нагрузки, при этом значения КК почти в три раза превышали исходный уровень через 24 часа (Рис. 2). Среди 58 человек 69% увеличили значения CK сверх установленных пределов. Кроме того, у 19% пациентов значения КК (МЕ / л) увеличились более чем в пять раз по сравнению с нормальным диапазоном, со 167 (139–306, 25–75% квартили) до 1537 (1,177–4,559, 25–75%). квартили), p <0.0001.
Сывороточный миоглобин значительно увеличился через два часа после тренировки и оставался значительно повышенным через 24 часа после тренировки (рис. 2 и таблица 2). Среди 58 человек у 74% уровень миоглобина в сыворотке крови после физических упражнений превысил допустимые пределы. Эти изменения были одинаковыми как у мужчин, так и у женщин.
Сывороточные почечные биомаркеры
SCr увеличился незначительно, но значительно через 24 часа после тренировки у 47% пациентов, а у 6% это повышение было совместимо с определением AKI (Таблица 2).
При отдельном анализе мужчин и женщин мы обнаружили, что SCr значительно увеличивался у мужчин (исходный уровень 1,03 ± 0,13 мг / дл, два часа 1,03 ± 0,13 мг / дл и 24 часа 1,10 ± 0,20 мг / дл, p <0,05), но был устойчивый у женщин (исходный уровень 0,79 ± 0,12 мг / дл, два часа 0,77 ± 0,10 мг / дл и 24 часа 0,77 ± 0,10 мг / дл, p> 0,05). SCr у двух мужчин увеличился более чем на 0,3 мг / дл по сравнению с исходным уровнем через 24 часа после тренировки (с 1,19 мг / дл до 1,7 мг / дл и с 1,21 мг / дл до 1,63 мг / дл), а SCr один человек увеличился на 0.27 мг от исходного уровня до 24 часов (от 0,96 мг / дл до 1,23 мг / дл).
Биомаркеры почек в моче
Все оцениваемые биомаркеры функции почек в моче значительно увеличились через два часа после тренировки и вернулись к значениям, аналогичным исходным через 24 часа после тренировки (рис. 3 и таблица 2). UNGAL увеличился на 70%, IL-18 на 74%, микроальбуминурия на 87%, кальбиндин на 70%, TFF3 на 81% и β2M у 77% участников исследования.
Рис. 3. Ящичковые диаграммы (медиана, 25% и 75% квартили) биомаркеров мочевого поражения почек: липокалин, связанный с желатиназой нейтрофилов (UNGAL), интерлейкин 18 (IL-18), кальбиндин, микроальбуминурия (μalbum), фактор трилистника 3 (TFF3) и β-2 микроглобулин (β2M).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0205791.g003
Когда мы отдельно проанализировали изменения биомаркеров мочи у мужчин и женщин, увеличение уровня IL-18, микроальбуминурии, кальбиндина, TFF3 и β2M имело сходные временные рамки и были статистически значимыми для обоих полов.
UNGAL (нг / мл) значительно увеличился у женщин: 20,2 на исходном уровне, 38,9 через 2 часа и 23,9 через 24 часа (p <0,05 на исходном уровне по сравнению с двумя часами). У пяти женщин значения UNGAL превышали 100 нг / мг Cr через два часа после тренировки.У мужчин UNGAL увеличился с 17,3 на исходном уровне до 26,8 через два часа и снизился до 9,6 через 24 часа, но разница не была статистически значимой (p = 0,1004).
Корреляция между РПЭ и биомаркерами повреждения мышц и почек
Обнаружена значимая и положительная корреляция между RPE и UNGAL (r = 0,3886, 95% ДИ 0,1371–0,5930, p = 0,0026) и RPE и микроальбуминурией (r = 0,4632, 95% CI 0,2253–0,6490, p = 0,0003). Положительной корреляции между РПЭ и другими биомаркерами повреждения мочевых почек не было.Корреляции между RPE и CK и RPE и миоглобином не было.
Обсуждение
Это предварительное проспективное когортное исследование показало, что один сеанс HIIRT продолжительностью четыре минуты вызывал раннее и значительное увеличение биомаркеров мышечного и почечного повреждения. Обнаружилась положительная и значимая корреляция между интенсивностью упражнений и UNGAL и микроальбуминурией. HIIRT имел сходные эффекты как у мужчин, так и у женщин, за исключением SCr и UNGAL. Нет доступных для сравнения проспективных исследований по влиянию упражнений с отягощениями на функцию почек, но описаны случаи, когда упражнения с отягощениями связаны с ОПП, включая тяжелую диализно-зависимую ОПП и гистологию почек, показывающую острый канальцевый некроз после высокоинтенсивных упражнений с отягощениями. [11,16].Ограничения этого исследования заключаются в том, что мы проанализировали один сеанс HIIRT и имели короткое время наблюдения.
В настоящем исследовании мы обнаружили умеренное, но статистически значимое увеличение SCr через 24 часа после тренировки только у мужчин, и, по крайней мере, у двоих из них SCr увеличился более чем на 0,3 мг / дл через 24 часа, что можно было бы считать ОПП. критерии KDIGO. Небольшое количество проспективных исследований оценило связь между аэробными упражнениями на длинные дистанции с увеличением SCr, совместимым с AKI, как исследование марафонцев, в котором 82% оцениваемых участников соответствовали критериям AKI по критериям AKIN [17].
Наблюдалось явное и статистически значимое увеличение UNGAL у женщин. Как у мужчин, так и у женщин через два часа после HIIRT наблюдалось статистически значимое повышение уровня IL-18 в моче, кальбиндина, μальбуминурии, TFF3 и β2M. Хотя аналогичных исследований для сравнения нет, существуют доказательства резкого увеличения сывороточных и мочевых биомаркеров повреждения почек у здоровых бегунов на длинные дистанции, включая цистатин С в сыворотке, альбуминурию, β2M в моче, NGAL, KIM-1, IL-18, IL-6 и TNF-α.Фактически, проспективное обсервационное исследование марафонцев выявило повышение уровня альбумина в моче, NGAL и IL-18 с аналогичной величиной и кинетикой (повышенные значения, обнаруживаемые в течение нескольких минут после завершения бега с возвратом к исходному уровню через 24 часа), с теми, которые наблюдаются в настоящее время. исследование [17]. Повышение биомаркеров, указывающих на структурное повреждение и восстановление почек, наблюдавшееся в настоящем исследовании, было ниже уровней, обычно обнаруживаемых у пациентов с клиническим ОПП, и указывает на наличие почечного стресса или легкого повреждения почек [18].
Значения
UNGAL увеличились почти в два раза в нашем исследовании, а у пяти женщин UNGAL достиг значений выше 100 нг / мгCr, что в некоторых сценариях совместимо с клиническим ОПП. NGAL, небольшой белок (25 кДа) из семейства липокалинов, выполняет бактериостатическую функцию. Нейтрофилы, матка, простата, слюнные железы, легкие, трахея, желудок, толстая кишка и почки производят и экспрессируют NGAL на стабильно низких уровнях [19]. Толстая восходящая ветвь петли Генле и интеркалированные клетки собирательного протока, вероятно, являются основными участками продукции почечного NGAL [20].NGAL, продуцируемый в тканях, отличных от почек, фильтруется клубочками и реабсорбируется проксимальными канальцами. Уровни NGAL в моче у здоровых людей обычно составляют около 20 нг / мл, что соответствует исходному уровню, измеренному у участников настоящего исследования [20]. Гены NGAL быстро экспрессируются после почечного инсульта, и убедительные доказательства показали, что NGAL в моче увеличивается в течение нескольких минут или нескольких часов после ишемического или токсического поражения почек. Поскольку было показано, что эти характеристики NGAL являются ранними маркерами структурного повреждения почек [19, 20], наши результаты указывают на HIIRT-ассоциированное повреждение почек, возможно, в толстой восходящей петле Генле, проксимальном канальце или в обоих канальцах, поскольку средние исходные уровни исследуемая популяция была нормальной, и нет никаких других факторов, таких как инфекция или повышенная внепочечная продукция NGAL, которая могла бы искажать результаты.Обнаружилась значимая положительная корреляция между интенсивностью упражнений, измеряемая с помощью RPE и UNGAL, что позволяет предположить, что чем выше интенсивность упражнений, тем интенсивнее было структурное повреждение почек. Вывод, сделанный в этом исследовании, о том, что UNGAL был значительно увеличен только у женщин, согласуется с тем фактом, что его продукция больше у женщин, чем у мужчин [21].
IL-18 представляет собой плейотропный цитокин с молекулярной массой 24 кДа из семейства цитокинов IL-1, который контролирует врожденный и адаптивный иммунитет [19].IL-18 конституционально экспрессируется во многих тканях и клетках, включая моноциты, клетки Купфера, кератиноциты, остеобласты, клетки коры надпочечников, эпителиальные клетки кишечника, микроглиальные клетки, синовиальные фибробласты, эпителиальные клетки проксимальных канальцев и интеркалированные клетки собирающих протоков [ 19]. Повышенный уровень IL-18 обычно возникает во время эндогенных воспалительных процессов, таких как сепсис [22]. Этот цитокин считается как медиатором, так и биомаркером ОПП [19], а уровни IL-18 в моче повышаются через несколько часов после воздействия нефротоксических агентов или ишемического повреждения у пациентов, у которых развивается ОПП.В настоящем исследовании мы обнаружили раннее повышение уровня IL-18 в моче отдельно от других факторов, которые могут увеличивать его системно, таких как инфекция. Маловероятно, что сеанс HIIRT повысил его уровни в плазме, поскольку несколько исследований, оценивающих влияние физических упражнений на системные уровни IL-18, не показали никаких резких изменений и фактически обнаружили снижение уровней в среднесрочной и долгосрочной перспективе [23,24]. Таким образом, текущие данные свидетельствуют о том, что наблюдаемое повышение уровня IL-18 в моче на самом деле связано с повреждением почечных канальцев.
Повышенная микроальбуминурия была связана с эндотелиальной дисфункцией, системным воспалением, повреждением клубочков, повреждением проксимальных канальцев, хроническим заболеванием почек и ОПН [25,26] и сообщалось после физических упражнений [27]. В этом исследовании экскреция альбумина с мочой значительно увеличилась сразу после сеанса HIIRT. Напряженная работа, выполняемая участниками исследования, вероятно, вызвала это увеличение альбуминурии, явление, о котором ранее сообщалось при изнурительных упражнениях и, вероятно, связанное с почечной и системной вазоконстрикцией, острым воспалительным взрывом и окислительным стрессом [27].Обнаружилась чрезвычайно значимая положительная корреляция между интенсивностью упражнений, измеряемой с помощью RPE, и микроальбуминурией, предполагая, что чем выше интенсивность упражнений, тем интенсивнее был вызванный HIIRT воспалительный всплеск.
Кальбиндин — это повсеместный и небольшой белок, связывающий Ca ²⁺ из суперсемейства тропонинов C, который функционирует как кальциевый буфер и сенсор. Он присутствует в различных тканях и клетках, включая субпопуляции нейронов центральной и периферической нервной системы, энтеральные нейроэндокринные клетки и клетки дистальных канальцев почек.Концентрации кальбиндина в моче быстро увеличиваются после повреждения почек на животных моделях с сепсисом и нефротоксичностью и возвращаются к исходным уровням через 24 часа после инсульта [28,29]. Существует несколько исследований, в которых кальбиндин оценивается клинически, но его уровни увеличиваются в восемь раз через три дня после инфузии цисплатина у пациентов с солидными опухолями. Его увеличение в настоящем исследовании предполагает повреждение дистальных канальцев почек.
TFF3 представляет собой пептид 13,1 кДа, который является частью семейства факторов трилистника (включая TFF1, TFF2 и TFF3), который экспрессируется в бокаловидных клетках кишечника, толстой кишки и почек.У человека TFFs продуцируются по всему мочевому тракту, а TFF3 преобладает в клетках проксимальных и дистальных канальцев и собирательных каналов [30]. Члены семейства TFF играют ключевую роль в защите и восстановлении эпителиальных клеток и слизистой оболочки, в основном в желудочно-кишечной системе. Совсем недавно TFF3 был признан частью регенеративной защиты почек и биомаркером острого и хронического повреждения почек [31–33]. В моделях на животных изменения уровней TFF3 в моче связаны с AKI [34].Специальное исследование риска атеросклероза в сообществах (ARIC) и МРТ сонных артерий ARIC показало, что повышенные уровни TFF3 в моче могут указывать на продолжающееся восстановление эпителия почечных канальцев и воспаление [32]. Первоначальные исследования у пациентов с трансплантатом почки показали, что уровни TFF3 повышаются сразу после трансплантации, а затем падают в течение семи дней, независимо от возникновения задержки функции трансплантата [34]. Быстрое увеличение TFF3 в настоящем исследовании, вероятно, связано с HIIRT-индуцированным повреждением проксимальных и дистальных канальцев и может быть связано с началом процесса регенерации эпителия.Проспективное обсервационное исследование с участием 22 марафонцев также обнаружило раннее увеличение биомаркеров восстановления после упражнений (гликопротеин 39 хряща человека — YKL-40 и хемоаттрактантный белок 1 моноцитов — MCP-1) [17].
β2M, белок 12 кДа, непрерывно генерируемый всеми ядросодержащими клетками организма, свободно фильтруется клубочками и почти полностью (99,9% отфильтрованного белка) реабсорбируется и катаболизируется в проксимальных извитых канальцах. Концентрация β2M в моче увеличивается при повреждении клубочков и / или канальцев [35], а его способность обнаруживать повреждение канальцев, вызванное нефротоксином, была показана в различных клинических сценариях [36].В контексте настоящего исследования повышение β2M в моче, вероятно, отражает повреждение проксимального канальца.
Острое повреждение почек и ОПП, связанное с физическими нагрузками, может возникать из-за различных механизмов, вызываемых упражнениями, включая рабдомиолиз, системную и почечную вазоконстрикцию, сердечную дисфункцию, а также системный воспалительный взрыв и окислительный стресс. Эти триггеры могут быть связаны с отдельными отягчающими факторами риска, такими как обезвоживание, возраст, привычный уровень физической активности, наличие генетических миопатий, использование нестероидных противовоспалительных препаратов, злоупотребление алкоголем, употребление рекреационных наркотиков, высокая температура окружающей среды, наличие инфекционное заболевание и интенсивность упражнений.
В текущем исследовании HIIRT вызывал раннее и прогрессирующее мышечное повреждение, о чем свидетельствуют болезненность мышц и значительные изменения сывороточных CK и миоглобина у большинства обследованных лиц, при этом повышение CK указывает на рабдомиолиз у 19% участников. Рабдомиолиз — хорошо известная потенциальная причина ОПН из-за нефротоксичности миоглобина, почечной вазоконстрикции, вызванной гемом, системного воспаления и окислительного повреждения почечной ткани из-за индуцированных гемом активных форм кислорода [37].В проспективных исследованиях бега на длинные дистанции, триатлона и дуатлона, а также в отчетах о спиннинге, ВИИТ, предшествующие исследования, касающиеся развития мышечного разрушения или рабдомиолиза, связанного с напряженными физическими нагрузками, в сочетании с клиническим увеличением ОПП или SCr, совместимым с диагнозом ОПП. HIIRT, поднятие тяжестей и упражнения с сопротивлением. Однако не было предыдущего проспективного исследования, оценивающего эту связь после HIIRT, как описано в настоящей рукописи. Кроме того, европейские эпидемиологические исследования показали, что количество пациентов, поступающих в больницу с рабдомиолизом, вызванным физической нагрузкой, резко увеличилось с 2010–2011 по 2014–2015 годы.Большинство пациентов были направлены в результате силовых тренировок в фитнес-центры, и до 6% пациентов заболели ОПП. Авторы предположили, что наблюдаемый рост частоты рабдомиолиза, вызванного физическими упражнениями, может быть связан с культурой высокоинтенсивных тренировок и повышенным давлением общества на упражнения [38,39]. В некоторых случаях сообщалось о тяжелом индуцированном физическими нагрузками рабдомиолизе, характеризующемся чрезвычайно высокими уровнями КК, без увеличения SCr [12,13].Однако практически во всех случаях с повышенным CK и нормальным SCr авторы не оценивали биомаркеры, указывающие на структурное повреждение почек. Вполне возможно, что тяжелый рабдомиолиз может способствовать субклиническому повреждению почек и легкому структурному повреждению почек, не вызывая заметного изменения скорости клубочковой фильтрации. В соответствии с этой гипотезой в недавней публикации описана группа из восьми новобранцев, госпитализированных с тяжелым рабдомиолизом при физической нагрузке, с нормальными значениями SCr и цистатина С, но значительным увеличением сывороточного NGAL, что свидетельствует о почечном стрессе, как это произошло в настоящем исследовании [40].
Каково клиническое значение настоящих результатов? Люди, участвовавшие в нашем исследовании, были здоровыми, молодыми и регулярно занимались спортом, и у них не было явных факторов риска повреждения почек. Однако HIIRT вызвала повреждение мышц (разрушение и рабдомиолиз) и субклиническое повреждение почек у участников. Эта ситуация потенциально ставит этих людей в более уязвимое положение с точки зрения клинически значимого повреждения почек, если одновременно возникают факторы риска ОПП, такие как обезвоживание, системная инфекция, прием НПВП или других.Точно так же неизвестны долгосрочные эффекты повторяющихся еженедельных всплесков субклинических травм у людей, выполняющих упражнения высокой интенсивности. Однако также возможно, что у некоторых людей может развиться повышенная сопротивляемость почечным инсультам, как это наблюдалось с дистанционной ишемической предварительной подготовкой, предотвращающей ОПП, которая улучшала восстановление почек у пациентов с ОПП и уменьшала долгосрочную частоту серьезных неблагоприятных событий со стороны почек при высокой пациенты риска, перенесшие кардиохирургические вмешательства [41]. Точно так же интенсивные упражнения или режим непрерывных тренировок могут вызывать или активировать белки теплового шока, группу белков, которая имеет решающее значение для сохранения гомеостаза белков и клеток [42].Ограниченное количество доказательств показало раннее повышение уровня биомаркеров восстановления почек в моче и повышение уровня белка теплового шока (HSP70) в крови после физических упражнений [42].
В заключение, один сеанс HIIRT у молодых и здоровых людей вызвал повреждение мышц и почек. У некоторых людей были уровни биомаркеров, совместимые с диагнозом ОПП в клинически значимых сценариях. Упражнения высокой интенсивности должны выполняться под профессиональным наблюдением постепенно и адекватно для лиц, начинающих регулярную физическую активность, которые должны быть предупреждены о возможности рабдомиолиза и проинструктированы, чтобы избегать изменяемых факторов риска ОПП.Наши результаты показывают, что упражнения высокой интенсивности следует выполнять с особой осторожностью или избегать их у людей с немодифицируемым высоким риском повреждения почек.
Упражнение 91: Физиология почечной системы: Упражнение 1: Эффект артериолы
Предварительный текст
Имя: Стеффани А. Ривера
Упражнение 9: Физиология почечной системы: Мероприятие 1: Влияние радиуса артериолы на клубочковую фильтрацию Отчет лаборатории
Результаты предварительных тестов Вы набрали 100%, если правильно ответили на 5 из 5 вопросов.
В здоровой почке человека примерно __ нефронов. Вы правильно ответили: c. 1 × 106
В каком из нижеследующих анатомические структуры перечислены в правильном порядке, поскольку они встречаются с кровью и фильтруемая жидкость в процессе фильтрации? Вы правильно ответили: d. афферентная артериола, клубочковый капилляр, капсула Боумена
Капсула Боумена подключена к началу Вы правильно ответили: б.проксимальный извитый канальец.
Функциональной единицей почки является Вы правильно ответили: c. нефрон.
В процессе реабсорбции почек жидкость и растворенные вещества перемещаются из Вы правильно ответили: б. почечные канальцы в перитубулярные капилляры.
Результаты эксперимента Предсказать вопрос: Предсказать вопрос 1: что произойдет с давлением в капиллярах клубочков и скоростью фильтрации, если вы уменьшите радиус афферентная артериола? Ваш ответ: а.Увеличится как давление, так и скорость фильтрации.
Предсказать вопрос 2: Что произойдет с давлением в капиллярах клубочков и скоростью фильтрации, если вы увеличите радиус афферентная артериола? Ваш ответ: а. Увеличится как давление, так и скорость фильтрации.
Предсказать вопрос 3: Что произойдет с давлением в капиллярах клубочков и скоростью фильтрации, если вы уменьшите радиус эфферентная артериола? Ваш ответ: а. Увеличится как давление, так и скорость фильтрации.
Stop & Think Вопросы: Потребление кофеина приводит к повышенному образованию мочи. Исходя из результатов этого эксперимента, вы можете предложить который Вы правильно ответили: d. кофеин расширяет афферентную артериолу.
Когда вы находитесь в пустыне и обезвоживаетесь, какая из следующих комбинаций артериол принесет вам наибольшую пользу? Ваш ответ: б. афферентное расширение и эфферентное сужение Правильный ответ: c. афферентное сужение и эфферентное расширение
Данные эксперимента:
Афферентный радиус (мм)
Эфферентный радиус (мм)
Пресс для стаканов.(мм рт. ст.)
Гломерулярный пресс. (мм рт. ст.)
Glom. Filt. Ставка (мл / мин)
Объем мочи (мл) 0,10 0,30 70 44,44 0,00 0. 0,45 0,30 70 49,69 58,17 244. 0,40 0,30 70 47,99 37,06 230. 0,35 0,30 70 46,64 20,36 138. 0,55 0,30 70 53,80 109,12 257. 0,60 0,30 70 55,94 135,71 260. 0,50 0,30 70 51,67 82,71 252. 0,50 0,40 70 50,61 69,53 200. 0,50 0,35 70 51,24 77,41 231. 0,50 0,30 70 51,67 82,71 252.
Обзор результатов
Каковы две основные функции почек? Ваш ответ: Две основные функции почек — выводить лишнюю воду, продукты жизнедеятельности и инородные вещества из крови и регулируют осмолярность плазмы, объем плазмы, кислотно-щелочной баланс и баланс электролитов в организме.
Каковы компоненты почечного тельца? Ваш ответ: Компоненты — клубочки и капсула Боумена.
Начиная с почечного тельца, перечислите компоненты почечного канальца по мере их попадания в фильтрат. Ваш ответ: Почечное тельце, проксимальный извитый канальец, петля гениталий, дистальный извитый каналец ro собирательный проток
Опишите влияние уменьшения радиуса афферентной артериолы на давление в капиллярах клубочков и скорость фильтрации.Как соответствуют ли результаты вашему прогнозу? Ваш ответ: Если raduis афферентной артериолы уменьшается, то скорость филатации и давление увеличиваются.
Опишите влияние увеличения радиуса афферентной артериолы на давление в капиллярах клубочков и скорость фильтрации. Как соответствуют ли результаты вашему прогнозу? Ваш ответ: При уменьшении радиуса афферентной артериолы давление и фильтрация уменьшаются.
Опишите влияние уменьшения радиуса эфферентной артериолы на давление в капиллярах клубочков и скорость фильтрации.Как соответствуют ли результаты вашему прогнозу? Ваш ответ: Уменьшение диаметра эфферентной артериолы приводит к увеличению фильтрации и давления
Опишите влияние увеличения радиуса эфферента на давление в капиллярах клубочков и скорость фильтрации. Ваш ответ: Увеличение эфферентного радиуса приводит к снижению капиллярного давления клубочков и снижению скорости фильтрации
Тубулярная реабсорбция — анатомия и физиология
Цели обучения
К концу этого раздела вы сможете:
Перечислите конкретные механизмы переноса, происходящие в различных частях нефрона, включая активный транспорт, осмос, облегченную диффузию и пассивные электрохимические градиенты
Перечислите различные мембранные белки нефрона, включая каналы, транспортеры и насосы АТФазы
Сравните и сравните пассивную и активную тубулярную реабсорбцию
Объясните, почему для образования мочи необходима дифференциальная проницаемость или непроницаемость определенных участков канальцев нефрона.
Опишите, как и где вода, органические соединения и ионы реабсорбируются в нефроне.
Объясните роль петли Генле, прямой кишки и противоточных механизмов размножения в концентрации мочи.
Перечислите места в нефроне, где происходит секреция канальцев
Поскольку через нефроны почек проходит до 180 литров в день, совершенно очевидно, что большая часть этой жидкости и ее содержимого должны реабсорбироваться.Это восстановление происходит в PCT, петле Генле, DCT и собирательных каналах ((Рисунок) и (Рисунок)). Различные части нефрона отличаются своей способностью реабсорбировать воду и конкретные растворенные вещества. Хотя большая часть реабсорбции и секреции происходит пассивно на основе градиентов концентрации, количество воды, которая реабсорбируется или теряется, строго регулируется. Этот контроль осуществляется напрямую АДГ и альдостероном и косвенно ренином. Большая часть воды восстанавливается в PCT, петле Генле и DCT.Около 10 процентов (около 18 л) попадает в сборные каналы. Коллекторные каналы под действием ADH могут собирать почти всю воду, проходящую через них, в случае обезвоживания, или почти не использовать воду в случае чрезмерного увлажнения.
Места секреции и реабсорбции в нефроне
Вещества, секретируемые или реабсорбированные в нефроне, и их местонахождение
Вещество РСТ Петля Генле DCT Коллекторные каналы
Глюкоза Почти 100% реабсорбируется; вторичный активный транспорт с Na ⁺
Олигопептиды, белки, аминокислоты Почти 100% реабсорбируется; Симпорт с Na ⁺
Витамины Реабсорбированный
Лактат Реабсорбированный
Креатинин Секретный
Мочевина 50 процентов реабсорбируется за счет диффузии; также секрет Выделение, распространение в нисходящей конечности Реабсорбция в собирательных протоках костного мозга; диффузия
Натрий 65 процентов активно реабсорбируется 25 процентов реабсорбируется толстой восходящей конечностью; активный транспорт 5 процентов реабсорбируется; активный 5 процентов реабсорбируется, стимулируется альдостероном; активный
Хлорид Reabsorbed, симпорт с Na ⁺, диффузия Реабсорбируется тонкой и толстой восходящей конечностью; диффузия в восходящей конечности реабсорбированный; диффузия реабсорбированный; Симпорт
Вода 67 процентов осмотически реабсорбируется растворенными веществами 15 процентов реабсорбируется в нисходящей конечности; осмос 8 процентов реабсорбируется, если АДГ; осмос Реабсорбция варьируется, контролируется АДГ, осмос
Бикарбонат 80–90% реабсорбция симпорта с Na ⁺ Reabsorbed, симпорт с Na ⁺ и антипорт с Cl ^—; в восходящей конечности Антипорт реабсорбированный с Cl ^—
H ⁺ Секретный; диффузия Секретный; активный Секретно; активный
NH ₄ ⁺ Секретно; диффузия Секретный; диффузия Секретно; диффузия
HCO ₃ ^— реабсорбированный; диффузия реабсорбированный; диффузия в восходящей конечности реабсорбированный; диффузия реабсорбированный; антипорт с Na ⁺
Некоторые лекарства Секретный Секретный; активный Секретный; активный
Калий 65 процентов реабсорбируется; диффузия 20 процентов реабсорбируется толстой восходящей конечностью; Симпорт Секретный; активный Секреция регулируется альдостероном; активный
Кальций реабсорбированный; диффузия Реабсорбируется толстой восходящей конечностью; диффузия Реабсорбируется, если присутствует гормон паращитовидной железы; активный
Магний реабсорбированный; диффузия Реабсорбируется толстой восходящей конечностью; диффузия Реабсорбированный
Фосфат Реабсорбируется на 85 процентов, ингибируется паратироидным гормоном, диффузия реабсорбированный; диффузия
Механизмы восстановления
Механизмы, с помощью которых вещества перемещаются через мембраны для реабсорбции или секреции, включают активный транспорт, диффузию, облегченную диффузию, вторичный активный транспорт и осмос.Они обсуждались в предыдущей главе, и вы можете просмотреть их.
Активный транспорт использует энергию, обычно энергию, обнаруженную в фосфатной связи АТФ, для перемещения вещества через мембрану от низкой до высокой концентрации. Он очень специфичен и должен иметь рецептор соответствующей формы для транспортируемого вещества. Примером может служить активный перенос Na ⁺ из ячейки и K ⁺ в ячейку насосом Na ⁺ / K ⁺.Оба иона перемещаются в противоположных направлениях от более низкой концентрации к более высокой.
Простая диффузия перемещает вещество от более высокой к более низкой концентрации вниз по градиенту концентрации. Он не требует энергии и должен быть только растворимым.
Облегченная диффузия похожа на диффузию в том, что она перемещает вещество вниз по градиенту его концентрации. Разница в том, что для движения требуются специфические мембранные рецепторы или белки каналов. Движение глюкозы и, в некоторых случаях, ионов Na ⁺ является примером облегченной диффузии.В некоторых случаях опосредованного транспорта два разных вещества используют один и тот же порт белка канала; эти механизмы описываются терминами симпорт и антипорт.
Механизмы Симпорта перемещают два или более веществ в одном направлении одновременно, тогда как механизмы антипорта перемещают два или более веществ в противоположных направлениях через клеточную мембрану. Оба механизма могут использовать градиенты концентрации, поддерживаемые насосами АТФ. Как описано ранее, когда активный транспорт обеспечивает перенос другого вещества таким образом, это называется «вторичным активным переносом».«Реабсорбция глюкозы в почках происходит за счет вторичного активного транспорта. Na ⁺ / K ⁺ АТФазы на базальной мембране трубчатой клетки постоянно выкачивают Na ⁺ из клетки, поддерживая сильный электрохимический градиент для Na ⁺, чтобы перейти в клетку из просвета канальцев. На люминальной (апикальной) поверхности симпортный белок Na ⁺ / глюкоза способствует перемещению как Na +, так и глюкозы в клетку. Котранспортер перемещает глюкозу в клетку против градиента ее концентрации, когда Na ⁺ движется вниз по электрохимическому градиенту, создаваемому базальными мембранами Na ⁺ / K ⁺ АТФаз.Затем молекула глюкозы диффундирует через базальную мембрану, облегчая диффузию в интерстициальное пространство, а оттуда в перитубулярные капилляры.
Большая часть Ca ⁺⁺, Na ⁺, глюкозы и аминокислот должна реабсорбироваться нефроном для поддержания гомеостатических концентраций в плазме. Другие вещества, такие как мочевина, K ⁺, аммиак (NH ₃₎, креатинин и некоторые лекарственные препараты, выделяются в фильтрат в виде отходов. Кислотно-щелочной баланс поддерживается за счет действий легких и почек: легкие избавляют тело от H ⁺, тогда как почки секретируют или реабсорбируют H ⁺ и HCO ₃ ^— ((рисунок)).В случае мочевины около 50 процентов пассивно реабсорбируется ПКТ. По мере необходимости в сборных каналах собирается больше. АДГ индуцирует встраивание переносчиков мочевины и белков аквапоринового канала.
Вещества, отфильтрованные и реабсорбируемые почками за 24 часа
Вещество Отфильтрованное количество (граммы) Количество реабсорбированных (граммов) Количество в моче (граммы)
Вода 180 л 179 л 1 л
Белки 10–20 10–20 0
Хлор 630 625 5
Натрий 540 537 3
Бикарбонат 300 299.7 0,3
Глюкоза 180 180 0
Мочевина 53 28 25
Калий 28 24 4
Мочевая кислота 8,5 7,7 0,8
Креатинин 1,4 0 1,4
Реабсорбция и секреция в PCT
Почечное тельце фильтрует кровь для создания фильтрата, который отличается от крови главным образом отсутствием клеток и крупных белков.С этого момента до концов собирающих каналов фильтрат или образующаяся моча претерпевает модификацию посредством секреции и реабсорбции, прежде чем будет произведена истинная моча. Первая точка изменения формирующейся мочи — это ПКТ. Здесь одни вещества реабсорбируются, а другие секретируются. Обратите внимание на использование термина «реабсорбированный». Все эти вещества «абсорбировались» в пищеварительном тракте — 99 процентов воды и большая часть растворенных веществ, отфильтрованных нефроном, должны быть реабсорбированы.Вода и вещества, которые реабсорбируются, возвращаются в кровоток через перитубулярные и прямокишечные капилляры. Важно понимать разницу между клубочком и перитубулярными капиллярами и капиллярами vasa recta. Внутри капилляров клубочка находится относительно высокое давление, и он может выдерживать его, расширяя афферентную артериолу и сужая эфферентную артериолу. Это обеспечивает адекватное давление фильтрации даже при изменении системного артериального давления. На движение воды в перитубулярные капилляры и прямую вазу будут влиять в первую очередь градиенты осмолярности и концентрации.Натрий активно перекачивается из ПКТ в интерстициальные пространства между клетками и диффундирует вниз по градиенту концентрации в перитубулярный капилляр. При этом вода будет пассивно следовать за ней, чтобы поддерживать изотоническую жидкую среду внутри капилляра. Это называется обязательной реабсорбцией воды, потому что вода «обязана» следовать Na ⁺ ((Рисунок)).
Вещества, реабсорбированные и секретируемые PCT
Через мембраны ПКТ проходит больше веществ, чем через любую другую часть нефрона.Многие из этих веществ (аминокислоты и глюкоза) используют механизмы симпорта для транспорта вместе с Na ⁺. Антипорт, активный транспорт, диффузия и облегченная диффузия — это дополнительные механизмы, с помощью которых вещества перемещаются с одной стороны мембраны на другую. Напомним, что клетки имеют две поверхности: апикальную и базальную. Апикальная поверхность — это поверхность, обращенная к просвету или открытому пространству полости или трубки, в данном случае к внутренней части ПКТ. Базальная поверхность клетки обращена к основанию соединительной ткани, к которому клетка прикрепляется (базальная мембрана), или к клеточной мембране ближе к базальной мембране, если имеется многослойный слой клеток.{3 -} [/ латекс]. Натрий активно обменивается на K ⁺ с помощью АТФ на базальной мембране. Большинство веществ, транспортируемых по механизму симпорта на апикальной мембране, переносятся путем облегченной диффузии на базальной мембране. По крайней мере, три иона, K ⁺, Ca ⁺⁺ и Mg ⁺⁺, диффундируют латерально между соседними клеточными мембранами (трансцеллюлярно).
Около 67 процентов воды, Na ⁺ и K ⁺, поступающей в нефрон, реабсорбируются в PCT и возвращаются в кровоток.Здесь обычно восстанавливается почти 100 процентов глюкозы, аминокислот и других органических веществ, таких как витамины. Некоторое количество глюкозы может появиться в моче, если уровни циркулирующей глюкозы достаточно высоки, чтобы все транспортеры глюкозы в PCT были насыщены, так что их способность перемещать глюкозу превышена (транспортный максимум, или T _m). У мужчин максимальное количество глюкозы, которое может быть восстановлено, составляет около 375 мг / мин, тогда как у женщин оно составляет около 300 мг / мин. Эта скорость восстановления соответствует артериальной концентрации около 200 мг / дл.Хотя исключительно высокое потребление сахара может вызвать кратковременное появление сахара в моче, появление глюкозурии обычно указывает на сахарный диабет I или II типа. Транспорт глюкозы из просвета ПКТ в интерстициальное пространство аналогичен тому, как она всасывается в тонком кишечнике. И глюкоза, и Na ⁺ одновременно связываются с одними и теми же белками симпорта на апикальной поверхности клетки, которые транспортируются в одном и том же направлении, к интерстициальному пространству. Натрий перемещается по своему электрохимическому градиенту и градиенту концентрации в клетку и забирает с собой глюкозу.{2 -} [/ latex] также восстанавливаются в РСТ.
Извлечение бикарбоната (HCO ₃ ^—) жизненно важно для поддержания кислотно-щелочного баланса, поскольку это очень мощный и быстродействующий буфер. Важный фермент используется, чтобы катализировать этот механизм: карбоангидраза (КА). Тот же самый фермент и реакция используются в красных кровяных тельцах при транспортировке CO ₂, в желудке для производства соляной кислоты и в поджелудочной железе для производства HCO ₃ ^— для буферизации кислого химуса из желудка.В почках большая часть КА находится внутри клетки, но небольшое количество связано с щеточной каймой мембраны на апикальной поверхности клетки. В просвете PCT HCO ₃ ^— соединяется с ионами водорода с образованием угольной кислоты (H ₂ CO ₃). Это ферментативно катализируется с образованием CO ₂ и воды, которые диффундируют через апикальную мембрану в клетку. Вода может осмотически перемещаться через двухслойную липидную мембрану из-за наличия водных каналов аквапоринов.Внутри клетки происходит обратная реакция с образованием ионов бикарбоната (HCO ₃ ^—). Эти ионы бикарбоната котранспортируются с Na ⁺ через базальную мембрану в интерстициальное пространство вокруг ПКТ ((Рисунок)). В то же время, антипортер Na ⁺ / H ⁺ выводит H ⁺ в просвет, в то время как он восстанавливает Na ⁺. Обратите внимание на то, как рециркулирует ион водорода, чтобы можно было восстановить бикарбонат. Также обратите внимание, что градиент Na ⁺ создается насосом Na ⁺ / K ⁺.{\ text {+}} ↔ {\ text {H}} _ {\ text {2}} {\ text {CO}} _ {\ text {3}} ↔ {\ text {CO}} _ {\ text {2}} {\ text {+ H}} _ {\ text {2}} \ text {O} [/ latex]
Значительное извлечение растворенных веществ из просвета ПКТ в интерстициальное пространство создает осмотический градиент, который способствует извлечению воды. Как отмечалось ранее, вода движется по каналам, созданным белками аквапоринов. Эти белки обнаруживаются во всех клетках в различных количествах и помогают регулировать движение воды через мембраны и клетки, создавая проход через гидрофобную двухслойную липидную мембрану.Изменение количества белков аквапоринов в мембранах собирательных трубок также помогает регулировать осмолярность крови. Движение множества положительно заряженных ионов также создает электрохимический градиент. Этот заряд способствует движению отрицательных ионов к межузельным промежуткам и движению положительных ионов к просвету.
Реабсорбция бикарбоната из РСТ
Реабсорбция и секреция в петле Генле
Петля Генле состоит из двух частей: толстой и тонкой нисходящей и тонкой и толстой восходящей.Петли кортикальных нефронов не заходят очень далеко в мозговое вещество почек, если вообще заходят. Юкстамедуллярные нефроны имеют петли, которые простираются на разные расстояния, некоторые очень глубоко в мозговом веществе. Нисходящие и восходящие части петли являются узкоспециализированными, что позволяет извлекать большую часть Na ⁺ и воды, которые были отфильтрованы клубочками. По мере прохождения образующейся мочи по петле осмолярность будет меняться от изосмотической с кровью (около 278–300 мОсмоль / кг) до очень гипертонического раствора около 1200 мОсмоль / кг и очень гипотонического раствора около 100 мОсмоль / кг.Эти изменения осуществляются за счет осмоса в нисходящей конечности и активного транспорта в восходящей конечности. Растворенные вещества и вода, извлеченные из этих петель, возвращаются в кровоток через прямую вазу.
Нисходящая петля
Большая часть нисходящей петли состоит из простых клеток плоского эпителия; чтобы упростить функцию цикла, в данном обсуждении основное внимание уделяется этим ячейкам. Эти мембраны имеют постоянные белки аквапориновых каналов, которые позволяют неограниченное движение воды из нисходящей петли в окружающий интерстиций, когда осмолярность увеличивается с примерно 300 мОсмоль / кг до примерно 1200 мОсмоль / кг.Это увеличение приводит к реабсорбции до 15 процентов воды, поступающей в нефрон. Здесь также извлекаются умеренные количества мочевины, Na ⁺ и других ионов.
Большинство растворенных веществ, которые были отфильтрованы в клубочках, теперь извлечены вместе с большей частью воды, около 82 процентов. Когда образующаяся моча попадает в восходящую петлю, в концентрацию растворенных веществ вносятся основные изменения, чтобы создать то, что вы воспринимаете как мочу.
Восходящая петля
Восходящая петля состоит из очень коротких тонких и более длинных толстых участков.Еще раз, чтобы упростить функцию, в этом разделе рассматривается только толстая часть. Толстая часть выстлана простым кубовидным эпителием без щеточной каймы. Он полностью непроницаем для воды из-за отсутствия белков аквапоринов, но ионы, в основном Na ⁺ и CL ^—, активно реабсорбируются системой котранспорта. Это имеет два важных эффекта: удаление NaCl при сохранении воды приводит к гипоосомотическому фильтрату к тому времени, когда он достигает DCT; закачка NaCl в интерстициальное пространство способствует созданию гиперосмотической среды в мозговом веществе почек.
Насосы АТФазы Na ^{+ /} K ⁺ в базальной мембране создают электрохимический градиент, позволяющий реабсорбировать Cl ^– симпортерами Na ⁺ / Cl ^– в апикальной мембране. В то же время, когда Na ⁺ активно перекачивается с базальной стороны клетки в интерстициальную жидкость, Cl ^— следует за Na ⁺ из просвета ^{в интерстициальную жидкость параклеточным путем между клетками через протекающие плотные стыки.Они находятся между ячейками восходящей петли, где они позволяют определенным растворенным веществам перемещаться в соответствии с их градиентом концентрации. Большая часть K ⁺, который входит в клетку через симпортеры, возвращается в просвет (вниз по градиенту концентрации) через протекающие каналы в апикальной мембране. Обратите внимание на среду, созданную теперь в межузельном пространстве: с «выходом черного хода» K ⁺, в интерстиции, окружающей восходящую петлю, остается один ион Na ⁺ и два иона Cl ^—.Следовательно, по сравнению с просветом петли, межузельное пространство теперь представляет собой отрицательно заряженную среду. Этот отрицательный заряд притягивает катионы (Na ⁺, K ⁺, Ca ⁺⁺ и Mg ⁺⁺) из просвета параклеточным путем в межклеточное пространство и в прямую кишку.}
Система умножения противотока
Структура петли Генле и связанной с ней прямой кишки создает противоточную систему умножения ((рисунок)).Термин «противоток» происходит от того факта, что нисходящая и восходящая петли расположены рядом друг с другом, и их жидкость течет в противоположных направлениях (противоток). Член множителя обусловлен действием насосов растворенного вещества, которые увеличивают (умножают) концентрации мочевины и Na ⁺ глубоко в мозговом веществе.
Система умножения противотока
Как обсуждалось выше, восходящая петля активно реабсорбирует NaCl из образующейся мочи в интерстициальные пространства.Кроме того, в сборных каналах установлены насосы для мочевины, которые активно перекачивают мочевину в межклеточные пространства. Это приводит к возвращению NaCl в кровоток через прямую вазу и создает высокоосмолярную среду в глубинах мозгового вещества.
Аммиак (NH ₃) — токсичный побочный продукт метаболизма белков. Он образуется при дезаминировании аминокислот гепатоцитами печени. Это означает, что аминогруппа NH ₂ удаляется из аминокислот по мере их расщепления. Большая часть образующегося аммиака превращается в мочевину гепатоцитами печени.Мочевина не только менее токсична, но и используется для восстановления воды с помощью петли Генле и сборных каналов. В то же время, когда вода свободно диффундирует из нисходящей петли через каналы аквапоринов в интерстициальные пространства мозгового вещества, мочевина свободно диффундирует в просвет нисходящей петли, когда она спускается глубже в продолговатый мозг, причем большая часть ее реабсорбируется из образующаяся моча, когда она достигает собирающего протока. Таким образом, перемещение Na ⁺ и мочевины в интерстициальные пространства с помощью этих механизмов создает гиперосмотическую среду в мозговом веществе.Конечным результатом этой противоточной системы умножения является восстановление как воды, так и Na ⁺ в циркуляции.
Аминокислота глутамин может дезаминироваться почками. Поскольку NH ₂ из аминокислоты превращается в NH ₃ и закачивается в просвет ПКТ, Na ⁺ и HCO ₃ ^— выводятся в интерстициальную жидкость почечной пирамиды через симпорт. механизм. Когда этот процесс происходит в клетках PCT, дополнительным преимуществом является чистая потеря иона водорода (который образует комплекс с аммиаком с образованием слабой кислоты NH ₄ ⁺) с мочой и увеличением иона бикарбоната ( HCO ₃ ^—) в крови.Аммиак и бикарбонат обмениваются в соотношении один к одному. Этот обмен — еще одно средство, с помощью которого организм может буферизовать и выводить кислоту. Наличие аквапориновых каналов в нисходящей петле позволяет огромному количеству воды покидать петлю и попадать в гиперосмолярный интерстиций пирамиды, где она возвращается в кровообращение через прямую вазу. Поскольку петля превращается в восходящую петлю, каналы аквапорина отсутствуют, поэтому вода не может покинуть петлю. Однако в базальной мембране клеток толстой восходящей петли АТФазные насосы активно удаляют из клетки Na ⁺.Симпортер Na ⁺ / K ⁺ / 2Cl ^— в апикальной мембране пассивно позволяет этим ионам проникать в цитоплазму клетки из просвета петли вниз по градиенту концентрации, создаваемому помпой. Этот механизм работает, чтобы в конечном итоге разбавить жидкость восходящей петли примерно до 50–100 мОсмоль / л.
При переходе от DCT к коллекторному каналу около 20 процентов исходной воды все еще присутствует и около 10 процентов натрия. Если бы не существовало другого механизма реабсорбции воды, было бы произведено около 20-25 литров мочи.Теперь рассмотрим, что происходит в соседних капиллярах, прямой кишке. Они восстанавливают как растворенные вещества, так и воду со скоростью, которая сохраняет противоточную систему умножения. Как правило, кровь течет по капиллярам медленно, чтобы дать время для обмена питательными веществами и отходами. В частности, в прямом сосуде эта скорость важна по двум дополнительным причинам. Поток должен быть медленным, чтобы клетки крови могли терять и восстанавливать воду без зазубрин и разрывов. Во-вторых, быстрый поток удалит слишком много Na ⁺ и мочевины, разрушив осмолярный градиент, необходимый для восстановления растворенных веществ и воды.Таким образом, при медленном движении для сохранения противоточного механизма при опускании прямой кишки Na ⁺ и мочевина могут свободно проникать в капилляр, в то время как вода свободно выходит; по мере подъема Na ⁺ и мочевина секретируются в окружающий мозговой слой, а вода возвращается обратно и удаляется.
Посмотрите это видео, чтобы узнать о системе умножителя противотока.
Реабсорбция и секреция в дистальном извитом канальце
Примерно 80 процентов отфильтрованной воды было восстановлено к тому времени, когда образующаяся разбавленная моча попадает в DCT.DCT восстановится еще на 10–15 процентов до того, как образующаяся моча попадет в собирательные каналы. Альдостерон увеличивает количество Na ⁺ / K ⁺ АТФазы в базальной мембране DCT и собирательном канале. Движение Na ⁺ из просвета собирающего канала создает отрицательный заряд, который способствует перемещению Cl ^— из просвета в межклеточное пространство параклеточным путем через плотные соединения. Перитубулярные капилляры получают растворенные вещества и воду, возвращая их в кровоток.
Ячейки DCT также извлекают Ca ⁺⁺ из фильтрата. Рецепторы паратиреоидного гормона (ПТГ) обнаруживаются в клетках DCT и, будучи связанными с ПТГ, индуцируют встраивание кальциевых каналов на их просветную поверхность. Каналы увеличивают извлечение Ca ⁺⁺ из образующейся мочи. Кроме того, когда Na ⁺ откачивается из ячейки, возникающий электрохимический градиент притягивает Ca ⁺⁺ в ячейку. Наконец, кальцитриол (1,25 дигидроксивитамин D, активная форма витамина D) очень важен для восстановления кальция.Он вызывает выработку кальций-связывающих белков, которые транспортируют Ca ⁺⁺ в клетку. Эти связывающие белки также важны для движения кальция внутри клетки и способствуют экзоцитозу кальция через базолатеральную мембрану. Любой Ca ⁺⁺, который не реабсорбируется к этому моменту, теряется с мочой.
Сборные каналы и восстановление воды
Растворенные вещества перемещаются через мембраны собирательных каналов, которые содержат два разных типа клеток: основные клетки и интеркалированные клетки.Основная клетка имеет каналы для восстановления или потери натрия и калия. Интеркалированная клетка секретирует или поглощает кислоту или бикарбонат. Как и в других частях нефрона, в мембранах этих клеток демонстрируется множество микромашин (насосов и каналов).
Регулирование объема и осмолярности мочи — основные функции собирающих протоков. Изменяя количество собираемой воды, собирающие каналы играют важную роль в поддержании нормальной осмолярности организма.Если кровь становится гиперосмотической, собирательные каналы собирают больше воды для разбавления крови; если кровь становится гипосмотической, собирательные каналы собирают меньше воды, что приводит к концентрации крови. Другими словами, если осмолярность плазмы повышается, восстанавливается больше воды и уменьшается объем мочи; если осмолярность плазмы снижается, восстанавливается меньше воды и увеличивается объем мочи. Эта функция регулируется гормоном задней доли гипофиза АДГ (вазопрессином). При умеренном обезвоживании осмолярность плазмы немного повышается.Это увеличение обнаруживается осморецепторами в гипоталамусе, которые стимулируют высвобождение АДГ из задней доли гипофиза. Если осмолярность плазмы немного снижается, происходит обратное.
При стимуляции АДГ каналы аквапоринов вставляются в апикальную мембрану основных клеток, выстилающих собирательные каналы. По мере того, как протоки опускаются по мозговому веществу, окружающая их осмолярность увеличивается (из-за противоточных механизмов, описанных выше). Если водные каналы аквапоринов присутствуют, вода будет осмотически вытягиваться из собирательного канала в окружающее интерстициальное пространство и в перитубулярные капилляры.Следовательно, конечная моча будет более концентрированной. Если выделяется меньше АДГ, вводится меньше каналов аквапорина и рекуперируется меньше воды, что приводит к разбавлению мочи. Изменяя количество аквапориновых каналов, изменяется объем извлеченной или потерянной воды. Это, в свою очередь, регулирует осмолярность крови, артериальное давление и осмолярность мочи.
Поскольку Na ⁺ перекачивается из образующейся мочи, вода пассивно улавливается для циркуляции; это сохранение объема сосудов критически важно для поддержания нормального кровяного давления.Альдостерон секретируется корой надпочечников в ответ на стимуляцию ангиотензином II. Как чрезвычайно сильнодействующее сосудосуживающее средство, ангиотензин II немедленно повышает кровяное давление. Стимулируя выработку альдостерона, он обеспечивает более длительный механизм поддержки артериального давления за счет поддержания объема сосудов (восстановление воды).
В дополнение к рецепторам ADH, основные клетки имеют рецепторы для стероидного гормона альдостерона. В то время как ADH в первую очередь участвует в регуляции восстановления воды, альдостерон регулирует восстановление Na ⁺.Альдостерон стимулирует основные клетки продуцировать просветные каналы Na ⁺ и K ⁺, а также насосы АТФазы Na ⁺ / K ⁺ на базальной мембране клеток. Когда выработка альдостерона увеличивается, больше Na ⁺ восстанавливается из образующейся мочи, и вода пассивно следует за Na ⁺. Поскольку насос восстанавливает Na ⁺ для тела, он также перекачивает K ⁺ в формирующуюся мочу, поскольку насос перемещает K ⁺ в противоположном направлении.Когда альдостерон снижается, больше Na ⁺ остается в образующейся моче, а больше K ⁺ восстанавливается в кровотоке. Каналы Symport перемещают Na ⁺ и Cl ^— вместе. Еще другие каналы в основных клетках секретируют K ⁺ в собирающий канал прямо пропорционально извлечению Na ⁺.
Интеркалированные клетки играют важную роль в регулировании pH крови. Интеркалированные клетки реабсорбируют K ⁺ и HCO ₃ ^—, секретируя H ⁺.Эта функция снижает кислотность плазмы, одновременно повышая кислотность мочи.
Обзор главы
Почки регулируют восстановление воды и кровяное давление, вырабатывая фермент ренин. Именно ренин запускает серию реакций, ведущих к выработке сосудосуживающего ангиотензина II и солеудерживающего стероидного альдостерона. На восстановление воды также сильно и напрямую влияет гормон АДГ. Даже в этом случае он влияет только на последние 10 процентов воды, доступной для восстановления после фильтрации в клубочках, потому что 90 процентов воды восстанавливается до того, как достигнет собирательных каналов.В зависимости от жидкого состояния организма в любой момент времени, собирающие каналы могут не собирать почти всю воду, достигающую их.
Механизмы восстановления растворенных веществ включают активный транспорт, простую диффузию и облегченную диффузию. Большинство фильтруемых веществ реабсорбируются. Мочевина, NH ₃, креатинин и некоторые лекарства фильтруются или выделяются как отходы. H ⁺ и HCO ₃ ^— секретируются или реабсорбируются по мере необходимости для поддержания кислотно-щелочного баланса.Движение воды из клубочков происходит в первую очередь за счет давления, тогда как движение воды из перитубулярных капилляров и прямых сосудов связано с градиентами осмолярности и концентрации. ПКТ является наиболее метаболически активной частью нефрона и использует широкий спектр белковых микромашин для поддержания гомеостаза — симпортеры, антипортеры и активные переносчики АТФазы — в сочетании с диффузией, как простой, так и облегченной. Почти 100 процентов глюкозы, аминокислот и витаминов восстанавливаются с помощью ПКТ.Бикарбонат (HCO ₃ ^—) восстанавливается с использованием того же фермента, карбоангидразы (КА), обнаруженного в эритроцитах. Восстановление растворенных веществ создает осмотический градиент, способствующий восстановлению воды. Нисходящая петля юкстагломерулярных нефронов достигает осмолярности до 1200 мОсмоль / кг, способствуя восстановлению воды. Восходящая петля непроницаема для воды, но активно восстанавливает Na ⁺, снижая осмолярность фильтрата до 50–100 мОсмоль / кг. Нисходящая и восходящая петля и прямая ваза образуют противоточную систему умножения, повышающую концентрацию Na ⁺ в мозговом веществе почки.Собирающие каналы активно перекачивают мочевину в мозговое вещество, что еще больше способствует формированию высокоосмотической среды. Прямая ваза восстанавливает растворенные вещества и воду в мозговом веществе, возвращая их в кровоток. Почти 90 процентов воды восстанавливается до того, как образующаяся моча достигает DCT, которая восстанавливает еще 10 процентов. На восстановление кальция ^{в DCT влияют ПТГ и активный витамин D. В собирательных каналах АДГ стимулирует введение аквапориновых каналов, чтобы увеличить восстановление воды и тем самым регулировать осмолярность крови.Альдостерон стимулирует восстановление Na ⁺ через собирательный проток.}
Обзорные вопросы
Аквапориновые каналы находятся только в сборном канале.
правда
ложь
Наибольшая абсорбция и секреция происходит в этой части нефрона.
проксимальный извитый канальец
нисходящая петля Генле
восходящая петля Генле
каналец извитый дистальный
коллекторные каналы
Точная настройка восстановления или удаления воды происходит в ________.
проксимальный извитый канальец
коллекторы
восходящая петля Генле
трубочка дистальная извитая
Вопросы о критическом мышлении
Какие сосуды и какая часть нефрона участвуют в противоточном размножении?
Прямая ваза и петля Генле участвуют в противоточном размножении.
Укажите приблизительную осмолярность жидкости в проксимальном извитом канальце, самой глубокой части петли Генле, дистальном извитом канальце и собирательных протоках.
Приблизительные значения осмолярности: CT = 300; самая глубокая петля = 1200; DCT = 100; и коллекторные каналы = 100–1200.
Глоссарий
противоточная система умножения
включает в себя нисходящую и восходящую петли Генле, направляющие формирование мочи в противоположных направлениях для создания градиента концентрации в сочетании с переменной проницаемостью и перекачкой натрия
глюкозурия
наличие глюкозы в моче; вызвано высоким уровнем глюкозы в крови, который превышает способность почек реабсорбировать глюкозу; обычно результат нелеченого или плохо контролируемого сахарного диабета
интеркалированная ячейка
специализированная ячейка собирательных каналов, выделяющая или поглощающая кислоту или бикарбонат; важен для кислотно-щелочного баланса
негерметичные герметичные соединения
плотных контактов, в которых герметизирующие нити белков между мембранами соседних клеток меньше по количеству и являются неполными; допускает ограниченное межклеточное движение растворителя и растворенных веществ
основная ячейка
обнаружен в собирательных трубах и имеет каналы для восстановления или потери натрия и калия; под контролем альдостерона; также имеют каналы аквапоринов под контролем ADH для регулирования извлечения воды
Физиология мышц
Физиология мышц
л
Скелет
л
Обеспечивает движение тела

л
Гладкая
л
Обеспечивает соответствующее распределение кровотока во время тренировки

л
Сердечный
л
Обеспечивает соответствующее распределение кровоток для функций организма
л
Эпимизий
л
Наружное покрытие, сплошное с жилами
л
Охватывает все 430 скелетных мышц тела
л
Перимизий
л
Наружное покрытие пучков мышечных волокон
л
Эндомизий
л
Наружное покрытие для каждого мышечного волокна
л
Содержит от сотен до тысяч миофибриллы
л
Содержит аппарат для сжатия мышечные волокна
л
Аппарат включает:
л
Саркоплазматический ретикулум
л
Поперечная площадь кальциевых канальцев склад
л
Канал продольный — мостовой для транспорт кальция к миофиламентам
л
Миофиламенты
л
Актин
л
Миозин
— мостовой переход соединение

л
Процесс
л
Сигнал от головного и / или спинного мозга
л
Сигнал движется по нерву к нервно-мышечному соединению
л
Болезнь в соединении передает сообщение к мышце
л
Электрическая активность в мышцах сигнализирует, что кальций вышел из области поперечного канальца
л
Кальций движется по продольным канальцам
л
Разрыв между нервным окончанием и мышечным волокном
л
Процесс продолжается
6.Кальций связывается с тропонином
7. Тропомиозин (ингибирующий белок) выходит из-под контроля, позволяя миозиновый мостик для соединения с актином
8. Миозиновый мостик соединяется с актином
9. АТФ расщепляется и выделяет энергию
10. Кроссбридж перемещает актин внутрь, вызывая укорочение мышечные волокна
11. Храповой эффект продолжается до полного сокращения

л
Изометрический
л
Развитие напряжения в мышце без изменения длины мышцы
л
Изотонический
л
Развитие напряжения в мышце с изменение длины мышцы
л
Концентрическое укорачивание
л
Эксцентриковое удлинение
л
Изокинетический
л
Развитие напряжения в мышце, которая встречает равное противодействующее сопротивление

л
Зависит от:
л
Количество кросс-мостиков, связанных с актином в в любой момент времени
л
Предварительно загруженное или незагруженное состояние
л
например.При подъеме штанги изометрическая сжатие необходимо для удержания веса (предварительно нагружено)
л
например. При подъеме с помощью гидравлики или изокинетические системы (непревращенные)
л
Размер площади поперечного сечения имеет значение
л
Скорость укорачивания
л
Возможно меньшее усилие быстрее сокращение

л
Зависит от:
л
Угол перистый (расположение волокон)
л
3 типа
л
Мышечные волокна проходят параллельно
л
Один набор мышечных волокон наклонен к сухожилию
л
Мышечные волокна расположены под косым углом на обоих стороны сухожилия
л
Длина саркомера
л
Предварительная растяжка
л
Может усилить концентрическое сокращение
л
Из-за эластичности и феномена растяжения-укорачивания

л
Зависит от:
л
Повреждение мышц, вызванное физической нагрузкой
л
Тяжелые упражнения могут привести к DOMS (отсроченное начало болезненности мышц)
л
Происходит через 24-48 часов после тяжелого упражнение
л
Скорее всего, из-за разрыва мышцы и соединительной ткани
л
Возраст мышц
л
Саркопения уменьшает размер мышц и сила
л
Тип волокна
л
Быстрое сокращение
л
Медленно сокращающийся

.

Mingels et al. (2009) [20]	70 бегунов-любителей в возрасте 47 (диапазон 30–68) лет	марафон	sCyst-C
Scherr et al. (2011) [22]	102 здоровых бегуна-мужчины возраст 42 ± 9 лет.5 лет	Marathon	sCyst-C
McCullough et al. (2011) [23]	25 здоровых бегунов возраст 38,7 ± 9,0 лет (13 женщин, 12 мужчин)	Marathon	sCyst-C uNGAL uKIM-1
Poortmans et al. (2012) [25]	12 мужчин, занимающихся физкультурой возраст 25 ± 5 лет	30 минут беговая дорожка при 80% VO ₂ max	sCyst-C
Junglee et al. (2012) [34]	20 здоровых активных взрослых возраст 24 ± 4 года (7 женщин, 13 мужчин)	Спринт на 800 м	pNGAL uNGAL uNGAL / uCr
Rullman et al. (2012) [38]	10 здоровых мужчин возраст 25 (диапазон 18–37) лет	60-минутный тест на велоэргометре (20 минут при 50% VO ₂ макс; +40 мин при 65 % от VO ₂ max)	pNGAL
Lippi et al. (2012) [40]	16 тренированных спортсменов-мужчин возраст 42 (диапазон 34–52) лет	60 км ультрамарафон	sNGAL, uNGAL, uNGAl / uCr
Junglee et al. (2013) [35]	10 активных здоровых мужчин возраст 20 ± 2 года	1. 60-минутный спуск с уклоном -10% + 40-минутный бег на беговой дорожке с уклоном 1% при 65% VO ₂ макс при темп. 33 ° C при относительной влажности 50% 2. 60-минутный бег на плоской дорожке + 40-минутный бег на беговой дорожке с уклоном 1% при 65% VO ₂ макс при темп.33 ° C при относительной влажности 50%	pNGAL uNGAL uNGLA / u.f.
Mellor et al. (2013) [42]	22 человека возраст 36 ± 2,4 года (7 женщин, 15 мужчин)	подъем с уровня моря на 1085 м за 6 часов	pNGAL
Sugama et al. (2013) [59]	14 мужчин-триатлонистов возраст 28,7 ± 7,9 лет	Дуатлон: бег 5 км + 40 км велогонки + 5 км бега	uIL-6 uIL-8
Kanda et al. (2014) [37]	9 нетренированных здоровых мужчин возраст 24,8 ± 1,3 года	Подъем на носки на одной ноге 10 подходов по 40 повторений упражнения с частотой 0,5 Гц с 3-х минутным отдыхом между подходами	pNGAL uNGAL uFABP
Hewing et al. (2015) [24]	167 бегунов-любителей возраст 50,3 ± 11,4 года (89 женщин, 78 мужчин)	марафон	sCyst-C
Андреаццоли и др. (2017) [41]	18 профессиональных велосипедистов-мужчин возраст 31,5 ± 4 года	горный этап одного из крупнейших европейских соревнований профессионального велоспорта	pNGAL uNGAL
Mansour et al. (2017) [46]	22 бегунов-любителей возраст 44 (диапазон 22–63) лет (13 женщин, 9 мужчин)	марафон	угал уКИМ-1 УИЛ-6, УИЛ-8, uIL-18, uTNFα, uYKL-40, uMCP-1
Bongers et al. (2017) [44]	60 участников марша возраст 29 ± 78 лет (30 женщин, 30 мужчин)	30, 40 или 50 км в течение трех дней подряд	uCyst-C, uNGAL, uNGAL / uCyst-C , uNGAL / Cr, uNGAL / uOsm uKIM-1, uKIM-1 / uCyst-C, uKIM-1 / uCr, uKIM-1 / uOsm
Bongers et al. (2018) [26]	35 активных здоровых мужчин возраст 23 ± 3 года	150-минутный велоэргометрический тест при 80% ЧСС до 3% гипогидратации (образцы взяты через 30 и 50 минут)	sCyst -C, uCyst-C uNGAL, uNGAL / uCyst-C, uNGAL / uCr, uNGAL / uOsm uKIM-1, uKIM / uCyst-C, uKIM-1 / uCr, uKIM-1 / uOsm
Spada al. (2018) [48]	58 здоровых добровольцев возраст 24 (диапазон 21–28) лет (29 мужчин, 29 женщин)	4 мин HIIRT	uNGAL, uNGAL / uCr uIL-18, uIL- 18 / uCr uCalbindin, uCalbindin / uCr uTTF, uTTF / uCr
Wołyniec et al. (2018) [47]	19 здоровых бегунов-любителей возраст 35,74 ± 6,99 лет (9 женщин, 10 мужчин)	Тест бега на беговой дорожке	УНГАЛ, УНГАЛ / УКР УКИМ-1, УКИМ-1 / УКР
McDermott et al. (2018) [39]	40 здоровых велосипедистов возраст 52 ± 9 лет	велоспорт на выносливость (5,7 ± 1,2 ч) в жару (33,2 ± 5,0 ° C, 38,4 ± 10,7% относительной влажности)	sNGAL
Chapman et al. (2019) [18]	12 здоровых взрослых в возрасте 24 ± 5 лет (3 женщины, 9 мужчин)	4-часовые упражнения в тепле (35,1 ° C, 61% относительной влажности)	pNGAL uNGAL , угл / мкф
Wolyniec et al. (2019) [45]	16 Здоровые бегуны-любители 36 лет.7 ± 8,2 года (2 женщины, 14 мужчин)	Беги на 10 и 100 км	uCyst-C uNGAL, uNGAL / uCr uKIM-1, uKIM-1 / uCr
Jouffroy et al. (2019) [51]	47 здоровых мужчин возраст 43 ± 7 лет	Ультрамарафон на 80 км	uNGAL, uNGAL / uCr uKIM-1, uKIM-1 / uCr
Poussel et al. (2020) [27]	24 здоровых бегуна возраст 36,5 (диапазон 24–57) лет (1 женщина, 23 мужчины)	Ультрамарафон на 120 км с 5700 м положительного набора высоты	sCyst-C uNGAL , uNGAL / uCr
Chapman et al. (2020) [43]	13 здоровых взрослых в возрасте 23 ± 2 года (3 женщины, 10 мужчин)	2 часа тренировки в жару (температура 39 ° C, относительная влажность 32%)	uNGAL uIGFBP -7 uTIMP-2
Kosaki et al. (2020) [53]	116 взрослых без хронической болезни почек возраст 62 (диапазон 24–83) лет (31 женщина, 85 мужчин)	инкрементальные короткие максимальные упражнения с использованием велоэргометра	uL-FABP / uCr
Semen et al. (2020) [50]	54 здоровых бегуна возраст 47 ± 15 лет (21 женщина, 33 мужчины)	полумарафон после однократного приема 400 мг ибупрофена: две группы: 1. с добавлением MOF -VVPP 2. Контроль	uNGAL, uCyst-C uIL-6, uIL-8, uIL-18, uTNFα
Semen et al. (2020) [49]	1. 35 бегунов возраст 44 ± 2 года (17 женщин, 18 мужчин) 2. 45 бегунов возраст 55 ± 2 года (24 женщины, 21 мужчина)	1.Бег на 10 км 2. полумарафон	uNGAL

Вещества, секретируемые или реабсорбированные в нефроне, и их местонахождение
Вещество	РСТ	Петля Генле	DCT	Коллекторные каналы
Глюкоза	Почти 100% реабсорбируется; вторичный активный транспорт с Na ⁺
Олигопептиды, белки, аминокислоты	Почти 100% реабсорбируется; Симпорт с Na ⁺
Витамины	Реабсорбированный
Лактат	Реабсорбированный
Креатинин	Секретный
Мочевина	50 процентов реабсорбируется за счет диффузии; также секрет	Выделение, распространение в нисходящей конечности		Реабсорбция в собирательных протоках костного мозга; диффузия
Натрий	65 процентов активно реабсорбируется	25 процентов реабсорбируется толстой восходящей конечностью; активный транспорт	5 процентов реабсорбируется; активный	5 процентов реабсорбируется, стимулируется альдостероном; активный
Хлорид	Reabsorbed, симпорт с Na ⁺, диффузия	Реабсорбируется тонкой и толстой восходящей конечностью; диффузия в восходящей конечности	реабсорбированный; диффузия	реабсорбированный; Симпорт
Вода	67 процентов осмотически реабсорбируется растворенными веществами	15 процентов реабсорбируется в нисходящей конечности; осмос	8 процентов реабсорбируется, если АДГ; осмос	Реабсорбция варьируется, контролируется АДГ, осмос
Бикарбонат	80–90% реабсорбция симпорта с Na ⁺	Reabsorbed, симпорт с Na ⁺ и антипорт с Cl ^—; в восходящей конечности		Антипорт реабсорбированный с Cl ^—
H ⁺	Секретный; диффузия		Секретный; активный	Секретно; активный
NH ₄ ⁺	Секретно; диффузия		Секретный; диффузия	Секретно; диффузия
HCO ₃ ^—	реабсорбированный; диффузия	реабсорбированный; диффузия в восходящей конечности	реабсорбированный; диффузия	реабсорбированный; антипорт с Na ⁺
Некоторые лекарства	Секретный		Секретный; активный	Секретный; активный
Калий	65 процентов реабсорбируется; диффузия	20 процентов реабсорбируется толстой восходящей конечностью; Симпорт	Секретный; активный	Секреция регулируется альдостероном; активный
Кальций	реабсорбированный; диффузия	Реабсорбируется толстой восходящей конечностью; диффузия		Реабсорбируется, если присутствует гормон паращитовидной железы; активный
Магний	реабсорбированный; диффузия	Реабсорбируется толстой восходящей конечностью; диффузия	Реабсорбированный
Фосфат	Реабсорбируется на 85 процентов, ингибируется паратироидным гормоном, диффузия		реабсорбированный; диффузия

Вещества, отфильтрованные и реабсорбируемые почками за 24 часа
Вещество	Отфильтрованное количество (граммы)	Количество реабсорбированных (граммов)	Количество в моче (граммы)
Вода	180 л	179 л	1 л
Белки	10–20	10–20	0
Хлор	630	625	5
Натрий	540	537	3
Бикарбонат	300	299.7	0,3
Глюкоза	180	180	0
Мочевина	53	28	25
Калий	28	24	4
Мочевая кислота	8,5	7,7	0,8
Креатинин	1,4	0	1,4

Логопедия для чайников | УЧЕБНЫЙ ЦЕНТР ЛОГОПЕД МАСТЕР

Артикуляционная гимнастика

1. «Улыбка» («заборчик»)

2. «Трубочка» («хоботок»)

3. «Домик открывается»(«бегемотик)

4. «Язык здоровается с подбородком»

5. «Язык здоровается с верхней губой»

(adsbygoogle=window.adsbygoogle||[]).push({});6. «Обезьянка»

7. «Бульдог»

8. «Хомяк»

9. «Кружок»

10. «Накажем непослушный язычок»

11.

12. «Покусаем язычок»

13. «Лопаточка»

<img src='/800/600/http/images.myshared.ru/26/1283559/slide_15.jpg' style='float: right;' /> 1.1.$SITE_PAGES.$fvsw6.1.$comp-ihw2ulzx.0.$dataItem-ihw2czzx.1.0.0″>14. «Дуем на лопаточку»

15. «Горка» («мостик»)

(adsbygoogle=window.adsbygoogle||[]).push({});16. «Ветерок дует с горки»

<img src='/800/600/https/sun9-9.userapi.com/5tyuD_IkAZ4qbGrEXQes8m8_XsldGO3cxg1quw/zZakW31rAyk.jpg' style='float: right;' /> $fvsw6.1.$comp-ihw2ulzx.0.$dataItem-ihw3eds9.1.0.0″>17. «Чистим нижние зубки» (с внутренней стороны)

18. «Катушка»

19. «Жуем блинчик»

20. «Чашечка»

21. «Вкусное варенье»

22. «Ступеньки»

23. «Фокус»

<img src='/800/600/https/allyslide.com/thumbs_4/9c4ac8bc74319439badfe47a79c2cff8/img1.jpg' style='float: right;' /> $desktop_siteRoot.$PAGES_CONTAINER.1.1.$SITE_PAGES.$fvsw6.1.$comp-ihw2ulzx.0.$dataItem-ihw3kf541.1.0.0″>24. «Не разбей чашечку»

25. «Чистим верхние зубы» (с внутренней стороны)

26. «Маляр»

<img src='/800/600/https/prezentacii.info/wp-content/uploads/2015/11/HrkbQ45i7JRyH5eq/7.jpg' style='float: right;' /> 0.$SITE_ROOT.$desktop_siteRoot.$PAGES_CONTAINER.1.1.$SITE_PAGES.$fvsw6.1.$comp-ihw2ulzx.0.$dataItem-ihw3ytu2.1.0.0″>27. «Барабанщик»

28. «Лошадка»

29. «Грибок»

30. «Гармошка»

31. «Кучер»

<img src='/800/600/https/ds02.infourok.ru/uploads/ex/0fc2/0002e269-4d82b322/img17.jpg' style='float: right;' /> 0.$SITE_ROOT.$desktop_siteRoot.$PAGES_CONTAINER.1.1.$SITE_PAGES.$fvsw6.1.$comp-ihw2ulzx.0.$dataItem-ihw94mtk.1.0.0″>32. «Иголочка»

33. «Маятник»

34. «Индюк» («болтушка»)

35. «Качели»

36. «Пароход»

Артикуляционная гимнастика

Артикуляционная гимнастика. ПРАКТИКА ежедневных занятий для дислексика.

Артикуляционная гимнастика: как научиться говорить четко?

Дыхательная гимнастика

С детьми проводят дыхательную гимнастику, используя игровые приёмы.

Игровая дыхательная гимнастика

Рекомендации по выполнению дыхательных упражнений

Дыхательная гимнастика с использованием игровых приёмов

Как восстановить легкие после перенесенного коронавируса

Ремоделирование поперечных канальцев усиливает Orai1-зависимое поступление Ca2 + в скелетные мышцы

Влияние нокаута кальсеквестрина типа 1 (CASQ1-null) на общее высвобождаемое содержимое магазина Ca

Влияние повторяющейся высокочастотной стимуляции на общее количество высвобождаемых запасов Ca

Дисферлин опосредует мембранные канальцы и связывает биогенез Т-канальцев с мышечной дистрофией

ВВЕДЕНИЕ

РЕЗУЛЬТАТЫ

Дисферлин опосредует мембранные канальцы

Функциональное взаимодействие дисферлина с белками, участвующими в биогенезе Т-канальцев

Липидная специфичность дисферлина

Дефицит дисферлина увеличивает высвобождение SR Ca

ОБСУЖДЕНИЕ

Трубочки дисферлина мембраны

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные

ДНК-конструкции

Культура клеток, иммунофлуоресценция, живое окрашивание и микроскопия

Эксперименты с миобластами

Экспрессия белка

Вестерн-блоттинг

qPCR

Эксперименты по связыванию липидов

Анализ липосомных канальцев

Электронная микроскопия

Окрашивание сукцинатдегидрогеназой

Выделение одиночных мышечных волокон

Измерение транзиентов внутриклеточного Ca

Эксперимент с бегущим колесом

Статистика

IJMS | Бесплатный полнотекстовый | Изменения в новых биомаркерах AKI после упражнений. Систематический обзор

Тренировка с отягощениями высокой интенсивности вызывает повреждение мышц и увеличивает биомаркеры острого повреждения почек у здоровых людей

Введение

Методы

Этика

6. «Обезьянка»

1.1.$SITE_PAGES.$fvsw6.1.$comp-ihw2ulzx.0.$dataItem-ihw2czzx.1.0.0″>14. «Дуем на лопаточку»

16. «Ветерок дует с горки»

$fvsw6.1.$comp-ihw2ulzx.0.$dataItem-ihw3eds9.1.0.0″>17. «Чистим нижние зубки» (с внутренней стороны)

$desktop_siteRoot.$PAGES_CONTAINER.1.1.$SITE_PAGES.$fvsw6.1.$comp-ihw2ulzx.0.$dataItem-ihw3kf541.1.0.0″>24. «Не разбей чашечку»

0.$SITE_ROOT.$desktop_siteRoot.$PAGES_CONTAINER.1.1.$SITE_PAGES.$fvsw6.1.$comp-ihw2ulzx.0.$dataItem-ihw3ytu2.1.0.0″>27. «Барабанщик»

0.$SITE_ROOT.$desktop_siteRoot.$PAGES_CONTAINER.1.1.$SITE_PAGES.$fvsw6.1.$comp-ihw2ulzx.0.$dataItem-ihw94mtk.1.0.0″>32. «Иголочка»