Регулон перед эко: Регулон. Кому назначали перед ЭКО? — 5 ответов

Содержание

Регулон перед эко — Вопрос гинекологу

Если вы не нашли нужной информации среди ответов на этот вопрос, или же ваша проблема немного отличается от представленной, попробуйте задать дополнительный вопрос врачу на этой же странице, если он будет по теме основного вопроса. Вы также можете задать новый вопрос, и через некоторое время наши врачи на него ответят. Это бесплатно. Также можете поискать нужную информацию в похожих вопросах на этой странице или через страницу поиска по сайту. Мы будем очень благодарны, если Вы порекомендуете нас своим друзьям в социальных сетях.

Медпортал 03online.com осуществляет медконсультации в режиме переписки с врачами на сайте. Здесь вы получаете ответы от реальных практикующих специалистов в своей области. В настоящий момент на сайте можно получить консультацию по 74 направлениям: специалиста COVID-19, аллерголога, анестезиолога-реаниматолога, венеролога, гастроэнтеролога, гематолога, генетика, гепатолога, гериатра, гинеколога, гинеколога-эндокринолога, гомеопата, дерматолога, детского гастроэнтеролога, детского гинеколога, детского дерматолога, детского инфекциониста, детского кардиолога, детского лора, детского невролога, детского нефролога, детского онколога, детского офтальмолога, детского психолога, детского пульмонолога, детского ревматолога, детского уролога, детского хирурга, детского эндокринолога, дефектолога, диетолога, иммунолога, инфекциониста, кардиолога, клинического психолога, косметолога, липидолога, логопеда, лора, маммолога, медицинского юриста, нарколога, невропатолога, нейрохирурга, неонатолога, нефролога, нутрициолога, онколога, онкоуролога, ортопеда-травматолога, офтальмолога, паразитолога, педиатра, пластического хирурга, подолога, проктолога, психиатра, психолога, пульмонолога, ревматолога, рентгенолога, репродуктолога, сексолога-андролога, стоматолога, трихолога, уролога, фармацевта, физиотерапевта, фитотерапевта, флеболога, фтизиатра, хирурга, эндокринолога.

Мы отвечаем на 96.49% вопросов.

Оставайтесь с нами и будьте здоровы!

12 вопросов гинекологу: оральные контрацептивы

Акушер-гинеколог центра «Седьмое небо», Далья Эль Диефи, рассказала BeautyHack, как правильно подбирать оральные контрацептивы и можно ли принимать один препарат в течение нескольких лет. 

— Какие факторы нужно учитывать при подборе оральной контрацепции? 

Контрацептивы не назначаются по совету подруги и не подбираются самостоятельно! Их может прописать только опытный акушер-гинеколог, принимая во внимание возраст, семейный статус, регулярность половой жизни, наличие сопутствующих гинекологических и соматических патологий, детей и их планирования в будущем.

— Нужно ли сдавать анализы перед назначением препарата? 

Не только анализы! Необходимы гинекологический осмотр, УЗИ органов малого таза, мазки на флору, цитологию, скрытые инфекции, исследования крови на уровень гормонов и свертываемость. При наличии хронических и сопутствующих заболеваний гинеколог может отправить пациента на консультацию к терапевту, офтальмологу, эндокринологу и другим специалистам. После подбора и назначения контрацепции осмотр у гинеколога раз в 6 месяцев обязателен! В Беларуси, например, без этого не обойтись – оральные контрацептивы не отпускаются без рецепта, а его может выписать только доктор. 

— Правда ли, что от контрацептивов можно поправиться/похудеть?

10-15 лет назад оральные контрацептивы (ОК) содержали ударную дозу эстрогена (стероидный женский половой гормон), что могло стать причиной набора веса. В препаратах нового поколения содержание гормонов сведено к минимуму: их ровно столько, сколько необходимо, чтобы оказать воздействие. Незначительная прибавка в весе (1-2 кг) может наблюдаться в первые несколько месяцев после начала приема контрацептива. Не стоит паниковать! Это связано с тем, что в процессе адаптации к препарату организм задерживает влагу в тканях. Через 2-3 месяца он перестроится на новый режим работы, и набранные килограммы уйдут.

— Применяют ли оральную контрацепцию для лечения гинекологических заболевания? 

Кроме своей основной функции – предохранять от нежелательной беременности, гормональные контрацептивы решают ряд других задач: уменьшение менструальных болей, профилактика ПМС, снижение риска развития раковых заболеваний. Они помогают бороться с угревой сыпью и улучшают состояние кожи. При бесплодии оральные контрацептивы тоже назначаются. Препараты дают возможность яичникам «отдохнуть», после чего они начинают работать с новой силой. Это увеличивает шансы забеременеть.

Правда ли, что оральные контрацептивы сгущают кровь? Какие последствия от этого могут быть? 

Прием гормональных контрацептивов действительно может провоцировать тромбообразование и «сгущение» крови. Но только у женщин, имеющих к этому предрасположенность. Риск «сгущения» крови повышается при курении, варикозном расширении вен, сахарном диабете. Аккуратно нужно относиться к приему контрацептивов при наследственной предрасположенности к тромбоэмболии (закупорка сосуда сгустком крови).

— Есть ли противопоказания к применению оральных контрацептивов?

Есть, и много: артериальная гипертензия, заболевание печени, эпилепсия, заболевания щитовидной железы, мигрень, сахарный диабет с осложнениями, рак груди, период лактации более 6 месяцев после родов, недавно перенесенные травмы, ожирение.

— Нужно ли менять препарат, если да, то как часто?

Если подобранный препарат не вызывает дискомфорта, побочных эффектов (выпадение волос, набор веса и прочих) и нормально переносится организмом, его можно не менять – контрацептивы не вызывают привыкания.

 — Можно ли принимать контрацепцию без перерыва?

Перерыв – гормональная «встряска» для организма. Она может быть вредна для женщины. Поэтому, если она пьет контрацепцию на протяжении длительного времени, нужно продолжать это делать до момента планируемой беременности.

— Что делать, если пропустила прием таблетки? 

Пропущенной считается таблетка, принятая с опозданием на 24 часа и более. В зависимости от препарата нужно либо выпить следующую, либо использовать дополнительные методы контрацепции — в данном случае следует читать инструкцию. Никогда ее не выбрасывайте!

— Можно ли принимать оральные контрацептивы кормящим?

Выбор оральных контрацептивов для кормящих женщин ограничен. Они должны быть полностью безопасны для малыша и иметь высокую степень защиты. Кормящим мамам я бы рекомендовала использовать барьерные средства контрацепции. Возможно применение спермацидных местных средств: таблеток, мазей, свечей. Иногда после родов женщинам рекомендуют установить гормональные внутриматочные системы (спираль). Тут все индивидуально! 

— Совместимы ли контрацептивы с алкоголем?

 Алкоголь в разумных количествах употреблять можно, но желательно, чтобы после приема таблетки прошло 2 часа.

-Нужно ли принимать контрацепцию при отсутсвии  длительное время полового парнера?

Если гормональные контрацептивы были назначены  с целью предохранения от нежелательной беременности и не решают других задач (лечение акне, восстановление гормонального фона), можно сделать перерыв в приеме после консультации со своим гинекологом. 

короткий, стандартный и длинные схемы проведения искусственного оплодотворения в Клинике ЦКБ РАН

Пара, которая планирует искусственное оплодотворение, сталкивается с термином «протокол ЭКО». По сути, это поэтапная программа очередности мероприятий и приема лекарств, подобранная в зависимости от особенностей каждой женщины. Она учитывает ее возраст, здоровье и те причины, по которым будет проводиться экстракорпоральное оплодотворение.

Применяются естественные и стимулирующие протоколы. Вторые, могут быть длинными и короткими.

Стандартный вариант. Длинный протокол ЭКО

Схема длинного протокола ЭКО предполагает самый долгий путь из всех используемых. Протокол подробно составлен и рассчитан не менее чем на пять недель. Его особенность и главное достоинство – возможность контролировать гормональный фон, что позволяет получить наибольшее количество яйцеклеток. Их число может доходить до 20-ти.

Для успешности проведения ЭКО необходимо не только большое количество яйцеклеток, но и их хорошее качество. Процесс созревания взаимосвязан с выбранной схемой стимулирования овуляции. Для успешного выполнения этой задачи именно длинный протокол является наиболее результативным.

Для назначения пациенткам длинного протокола, существуют определенные показания:

  • Патология матки;
  • Ожирение;
  • Эндометриоз;
  • Высокая секреция андрогенов.

Еще одна причина – неудачная попытка ЭКО с использованием короткого протокола.

Этапы, по которым реализуется длинный протокол:

  • за неделю до менструации яичники медикаментозно переводят в режим внешнего управления – их естественные функции блокируются;
  • далее происходит стимуляция роста фолликулов до нужных размеров, процесс созревания проходит на фоне приема препаратов-триггеров;
  • пунция фолликулов, подсадка эмбрионов, контроль состояния до получения желаемого результата.

Метод имеет серьезный недостаток: риск развития синдрома гиперстимуляции яичников, приводящего к нежелательным последствиям.

Короткий протокол ЭКО

Его начало представляет собой стимулирующую фазу на 3-й день от начала менструации. Отличие методики состоит в отсутствии фазы регулирования. Как следствие – неравномерное созревание меньшего числа фолликулов. Качество их также может быть разным.

Как построен короткий протокол ЭКО по дням:

  • Блокада яичников проходит во время всего процесса, но в более легкой степени;
  • Через два дня от начала протокола пациентка начинает прием гонадотропинов сроком на две недели;
  • Для подготовки фолликулов к овуляции назначают препараты ХГЧ;
  • В период с 14 по 20 день от начала месячных проводится пункция.

Начиная с этого момента короткий и длинный протоколы – совпадают.

Эта схема может использоваться, если:

  • Пациентка не имеет проблем с придатками;
  • Ее возраст – немолодой;
  • При безрезультатном использовании длинного протокола.

Достоинство методики – короткий срок использования – около месяца, что обеспечивает относительно легкую переносимость.

Одна из разновидностей короткого протокола – ультракороткий вариант, когда агонисты ГнРГ заменяются антагонистами. Цель такого решения – снижение вероятности получить преждевременную овуляцию, так как пункция проводится по истечении двух недель.

Интересно, что ощущения женщины при удачном переносе эмбрионов не отличаются от наступившей естественным путем беременности.

Узнать больше о протоколах и получить любую другую информацию об экстракорпоральном оплодотворении в ЦКБ РАН Москвы можно записавшись к врачу по репродуктивной медицине (499) 400-47-33.

Экспрессия Streptomyces coelicolor SoxR Regulon тесно связана с продукцией актинородина

J Bacteriol. 2010 декабрь; 192 (24): 6428–6438.

Rica Dela Cruz

Факультет биологии, колледж Брин-Мор, 101 North Merion Avenue, Bryn Mawr, Pennsylvania 19010

Yang Gao

Факультет биологии, Bryn Mawr College, 101 North Merion Avenue, Bryn Mawr 9 0 010 3 19010

Sahitya Penumetcha

Факультет биологии, Колледж Брин-Мор, 101 North Merion Avenue, Bryn Mawr, Pennsylvania 19010

Rebecca Sheplock

Факультет биологии, Bryn Mawr College, 101 North Merion Avenue, Bryn Mawr

10, Pennsylvania

0 Weng

Факультет биологии, Колледж Брин-Мор, 101 North Merion Avenue, Брин-Мор, Пенсильвания 19010

Моника Чандер

Факультет биологии, Колледж Брин-Мор, 101 North Merion Avenue, Брин-Мор, Пенсильвания 19010

90 Факультет биологии , Bryn Mawr College, 101 North Merion Avenue, Bryn Mawr, Pennsylvania 19010

* Автор, ответственный за переписку.Почтовый адрес: кафедра биологии, колледж Брин-Мор, 101 North Merion Ave., Bryn Mawr, PA 19010. Телефон: (610) 526-5096. Факс: (610) 526-5086. Электронная почта: [email protected]

Эти авторы внесли одинаковый вклад в эту работу.

Поступила в редакцию 5 августа 2010 г .; Принято 4 октября 2010 г.

Copyright © 2010, Американское общество микробиологииЭта статья цитировалась в других статьях PMC.
Дополнительные материалы

[Дополнительный материал]

GUID: 39B04893-CFE7-48B8-A547-4198ACF72512

GUID: 9A72F75B-12D8-4406-9298-AD0EDCD56390

Abstract

[2Fe-2S]-содержащий транскрипционный фактор SoxR консервативен у различных бактерий.SoxR традиционно известен как регулятор глобальной реакции на окислительный стресс у Escherichia coli , но недавние исследования показывают, что эта функция может быть ограничена кишечными бактериями. Предполагается, что у подавляющего большинства неэнтериков SoxR опосредует реакцию на эндогенно продуцируемые окислительно-восстановительные метаболиты. Мы исследовали регуляцию и функцию регулона SoxR в модели продуцирующей антибиотик нитчатой ​​бактерии Streptomyces coelicolor . В отличие от E.coli soxR , эквивалентный S. coelicolor , не обладает гиперчувствительностью к оксидантам, что указывает на то, что SoxR не усиливает антиоксидантную защиту последнего. SoxR регулирует пять генов у S. coelicolor , включая те, которые кодируют предполагаемый переносчик ABC, две оксидоредуктазы, монооксигеназу и возможную NAD-зависимую эпимеразу/дегидратазу. Экспрессия этих генов зависит от продукции бензохроманхинонового антибиотика актинородина и требует интактных кластеров [2Fe-2S] в SoxR.Эти данные показывают, что актинородин или окислительно-восстановительный предшественник модулирует активность SoxR в S. coelicolor , чтобы стимулировать продукцию мембранного переносчика и белков, гомологичных ферментам, формирующим актинородин. В то время как роль SoxR в S. coelicolor остается под вопросом, эти исследования подтверждают идею о том, что SoxR был адаптирован для выполнения различных физиологических функций для удовлетворения потребностей организмов, которые занимают разные экологические ниши и сталкиваются с различными экологическими проблемами.

[2Fe-2S]-содержащий фактор транскрипции SoxR принадлежит к семейству регуляторов транскрипции MerR. Члены этого семейства опосредуют защиту от различных воздействий окружающей среды, таких как токсичные металлы и антибиотики, и, в случае SoxR, от окислительного стресса, вызванного окислительно-восстановительными препаратами и оксидом азота (обзор в ссылке 4). Сгруппированные вместе на основе структурного сходства, эти гомодимерные белки также регулируют экспрессию генов посредством общего механизма. Каждая субъединица содержит N-концевой ДНК-связывающий домен спираль-виток-спираль, домен димеризации спираль-спираль и С-концевой регуляторный домен, который воспринимает соответствующий стимул.Белки типа MerR активируют транскрипцию с промоторов с субоптимальным расстоянием 19 ± 1 п.н. между элементами -35 и -10, что обычно препятствует образованию открытых комплексов с помощью РНК-полимеразы. Члены семейства MerR связываются с оператором с диадной симметрией, расположенным между -35 и -10 элементами их промоторов-мишеней, и при активации раскручивают промотор, тем самым облегчая инициацию РНК-полимеразой (25, 26, 27).

Лучше всего изучено на Escherichia coli (и родственных кишечных бактериях), SoxR воспринимает окислительно-восстановительный стресс через кластеры [2Fe-2S], которые закреплены четырьмя цистеиновыми остатками, расположенными в С-концевом регуляторном домене каждого мономера (3) (рис. .). Окислительно-восстановительный сигнал трансдуцируется в глобальный клеточный ответ через второй транскрипционный фактор, SoxS (обзор в ссылке 45). SoxR конститутивно экспрессируется и остается присоединенным к промотору soxS в отсутствие или в присутствии окислительного стресса. Однако в отсутствие оксидантов SoxR существует в состоянии покоя с восстановленными кластерами [2Fe-2S] и soxS не транскрибируется (28, 29). Воздействие окислительно-восстановительных препаратов вызывает одноэлектронное окисление центров SoxR [2Fe-2S], а окисленный белок облегчает транскрипцию soxS , опосредуя структурные изменения в промоторной ДНК, которые стимулируют инициацию РНК-полимеразой (14, 15, 21). , 22, 28).SoxS, в свою очередь, привлекает РНК-полимеразу для транскрипции оставшихся членов регулона (>100 генов), продукты которых облегчают удаление активных форм кислорода и восстанавливают любые повреждения, которые могли возникнуть во время стресса (46). На первый взгляд сложная, эта система предназначена для организации эффективной и быстрой активации большого набора функций, необходимых для восстановления окислительно-восстановительного баланса.

Гомологи SoxR из разных бактерий отличаются высокой консервативностью. Выравнивание белков SoxR из E.coli (ECO), P. aeruginosa (PAU), S. griseus (GRI), S. scabies (SCA), S. clavuligerus (CLA), S. avermitilis (SAV) и S. coelicolor (SCO). Квадраты под последовательностями, помеченными от h2 до h5, указывают на два мотива спираль-поворот-спираль, которые образуют ДНК-связывающий домен, H5 указывает на спираль димеризации и четыре консервативных цистеиновых остатка, которые закрепляют кластер [2Fe-2S] в E. coli SoxR выделены жирным шрифтом.Идентичные остатки отмечены звездочкой, а консервативные замены — двоеточием.

Ген soxR сохраняется в различных популяциях бактерий, как грамположительных, так и грамотрицательных. Сравнение последовательностей белков SoxR выявляет высококонсервативный ДНК-связывающий домен, указывая на то, что гомологи SoxR будут связываться со сходными последовательностями ДНК-мишеней (Fig. 1). Кроме того, четыре остатка цистеина, которые закрепляют кластеры [2Fe-2S] в E. coli SoxR, также полностью консервативны, что свидетельствует о том, что все гомологи SoxR будут регулироваться окислительно-восстановительным потенциалом (рис.). Несмотря на их биохимическое сходство, недавние исследования показали, что гомологи SoxR играют разные роли в разных организмах. Pseudomonas putida и Pseudomonas aeruginosa , например, не полагаются на SoxR для ответа на окислительный стресс и, что примечательно, также не имеют гомолога soxS (43, 44). В то время как функция SoxR у P. putida до сих пор неизвестна, у P. aeruginosa SoxR активируется эндогенно продуцируемыми редокс-активными феназиновыми антибиотиками и напрямую стимулирует транскрипцию двух эффлюксных насосов и предполагаемой флавин-зависимой монооксигеназы. для помощи в транспорте и модификации феназина, соответственно (12, 13, 44).Хотя биологическое значение этого все еще исследуется, soxR -дефицитный мутант проявляет измененную морфологию колонии и нарушение регуляции транспорта феназина, избыточную секрецию синего пиоцианина и недостаточную секрецию желтого и красного феназинов (12).

История, которая начинает разворачиваться, предполагает, что SoxR-опосредованные пути передачи сигналов отчетливо адаптированы у разных организмов. В то время как soxR высоко консервативен в ряде бактерий, soxS обнаруживается исключительно в энтеросолюбильных тканях, где он является единственной мишенью SoxR и помогает SoxR в запуске глобальной программы окислительной защиты.Комплексный поиск in silico предполагаемых генов, регулируемых SoxR, в бактериальных геномах предсказывает, что парадигма P. aeruginosa будет преобладать над традиционной моделью E. coli у подавляющего большинства видов бактерий, у всех из которых отсутствует soxS. (12). Более конкретно, для бактерий, продуцирующих антибиотики, предполагается, что SoxR эволюционировал, чтобы реагировать на эндогенные редокс-активные метаболиты и активировать механизмы для обработки / транспорта этих метаболитов.Это было подтверждено для P. aeruginosa , но не для других модельных систем.

В этой работе мы исследуем, можно ли распространить это предсказание на филогенетически отдаленную грамположительную почвенную бактерию Streptomyces coelicolor . Представители этого рода примечательны тем, что производят две трети биологически активных вторичных метаболитов, используемых в клинической медицине. S. coelicolor , генетически лучше всего охарактеризованный представитель этого рода, продуцирует по крайней мере четыре структурно различных антибиотика, в том числе трипиррол-ундецилпродигиозин с красным пигментом (Red) и поликетид бензохроманхинона с синим пигментом актинородин (Act).Производство этих антибиотиков зависит от фазы роста и совпадает с началом морфологической дифференциации культур, выращенных на агаре. Косвенные доказательства указывают на участие SoxR в модуляции экспрессии генов в ответ на пигментированные антибиотики Red и/или Act у этой бактерии. Уровни экспрессии двух генов, SCO2478 и SCO4266 , биоинформационно идентифицированных как потенциальные мишени SoxR, были значительно снижены у мутанта S. coelicolor , который не продуцирует ни Red, ни Act (12).Предполагается, что SCO2478 и SCO4266 кодируют оксидоредуктазы, гомологичные ферментам, модифицирующим малые молекулы (включая антибиотики) у других видов бактерий (17, 55). Эти наблюдения предполагают, что SoxR может быть функционально законсервирован и сходным образом регулироваться у эволюционно отдаленных продуцентов антибиотиков P. aeruginosa и S. coelicolor . Чтобы определить, так ли это, мы попытались (i) идентифицировать дополнительные гены, регулируемые SoxR, у S.coelicolor и (ii) изучить зависимость активности SoxR от специфических антибиотиков, продуцируемых S. coelicolor . Здесь мы представили доказательства регулона SoxR с пятью генами, экспрессия которого зависит от функционирующего пути биосинтеза Act. Мы отмечаем, что регулон SoxR консервативен у других представителей рода Streptomyces , и рассматриваем возможную физиологическую роль SoxR в Streptomyces.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы, плазмиды и условия культивирования.

Штаммы S. coelicolor , использованные в этом исследовании (таблица), культивировали при 30°C на чашках R2YE, SMMS, маннит-соевой муки или питательного агара (36). E. coli ET12567 (38), BW25113 (11) и BT340 (9) использовали для направленных на ПЦР разрушений (24), BL21 (λDE3) (Novagen) использовали для сверхпродукции рекомбинантного SoxR, а DH5α (Gibco BRL ) использовался в качестве хоста для рутинного клонирования. Среда, условия культивирования и манипуляции с ДНК для E. coli проводились, как описано ранее (49).Используемые плазмиды: pIJ773 (24), pSET152 (2), pSE380 (Stratagene) и pET16b (Novagen).

Таблица 1.

Таблица 1.

Streptomyces Coelicolor штаммы, используемые в этом исследовании

1 Это исследование / PSET152 штамм SOXR / PSET152 / PC118A / PC118A штамм
Desim Genotype или Описание Источник или ссылка
M145 SCP1 SCP2 36
M510 Δ СВОД производное M145 20
M511 Δ акт II-orf4 производное M145 20
M512 Δ СВОД Δ ACT II-ORF4 производной M145 20
M145-1 δ SOXR :: APR Производное производное M145 Это исследование
M145-1A без маршрутизации δ soxR производная M145 Это исследование
M511Δ soxR Δ soxR :: апреля производной M511 (Δ ACT II-ORF4 Δ SOXR ) SOXR )
M145 M145 преобразован с PSET152 Это исследование
M145-1A преобразован с PSET152 Это исследование
SOXR / PSOXR штамм / PSOXR 2 1 M145-1A преобразован с PSET152 :: SOXR Это исследование
M145-1A, трансформированный pSET152::C118A Настоящее исследование

Конструирование и комплементация штаммов с делецией

soxR .

Открытая рамка считывания soxR (от кодонов 1 до 141) была заменена кассетой устойчивости к апрамицину в хромосомах M145 и M511 с использованием методологии REDIRECT PCR-targeting (24). Кассету замены гена, содержащую точку начала переноса RK2 ( oriT ) и ген устойчивости к апрамицину ( apr ), амплифицировали с помощью ПЦР из pIJ773 с использованием праймеров FOR-KO и REV-KO, которые содержат 39 нуклеотидов (nt). 5′-удлинения гомологии, соответствующие гену soxR (см. Таблицу S1 в дополнительном материале).Очищенный продукт ПЦР рекомбинировали в soxR -содержащую космиду StI30A, используя E. coli BW25113/pIJ790 в качестве хозяина. Полученную рекомбинантную космиду StI30M пассировали через хозяина с дефицитом метилирования, E. coli ET12567, несущего нетрансмиссивную oriT -мобилизующую плазмиду pUZ8002 (36), а затем переносили в штаммы S. coelicolor M145 и M511 с помощью спряжение. Были идентифицированы и очищены устойчивые к апрамицину, чувствительные к канамицину эксконъюганты двойного кроссинговера (M145-1 и M511Δ soxR соответственно) (таблица).Аллель безмаркерной делеции soxR также был сконструирован на фоне М145. Космиду StI30M вводили в E. coli BT340, а кассету apr-oriT (которая окружена сайтами-мишенями распознавания FLP) удаляли путем индукции рекомбиназы FLP (24). Мутантную космиду StI30Mscar вводили в M145-1 путем трансформации протопластов и отбирали трансформанты Kan r . После одного цикла неселективного роста колонию, утратившую устойчивость как к апрамицину, так и к канамицину, отбирали и очищали (М145-1А) (таблица).Все нарушения soxR были подтверждены анализами ПЦР и Саузерн, а ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) дополнительно подтвердила отсутствие сообщения soxR (данные не показаны).

В дополнение к M145-1A, SCO1697 ( soxR ) вместе с 300 п. таблицу S1 в дополнительном материале) из геномной ДНК M145 и клонировали в сайт BamHI интегрирующего вектора pSET152 с получением pSET152:: soxR .Плазмиды pSET152 и pSET152:: soxR вводили в M145-1A путем конъюгации из E.coli ET12567/pUZ8002.

Клонирование, экспрессия и очистка рекомбинантного белка SoxR.

Кодирующая область soxR была амплифицирована с помощью ПЦР из хромосомной ДНК M145 с использованием праймеров SC-Eco и SC-Hind (см. Таблицу S1 в дополнительном материале) и клонирована в сайты EcoRI/HindIII pSE380 с получением pSE-SCSoxR. . Для сверхэкспрессии в E. coli кодирующую область soxR амплифицировали с помощью ПЦР из pSE-SCSoxR с использованием праймеров SC-C и SC-D (таблица S1) и клонировали в сайты NdeI/BamHI pET16b ниже по течению от 10-гистидиновая метка.Рекомбинантный белок S. coelicolor SoxR, меченный N-концом, сверхэкспрессировали в E. coli BL21(λDE3) и аффинно очищали на 1-мл колонке с никель-нитрилотриуксусной кислотой и агарозой (Qiagen), как описано для E. Белок SoxR из .coli (7), за исключением белка S. coelicolor SoxR, элюировали в буфере, содержащем 350 мМ имидазола. Концентрации белка определяли с помощью набора для анализа белка Брэдфорда (Bio-Rad), используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта.Очищенный SoxR обычно был >95% гомогенен, как было установлено при визуальном осмотре окрашенных кумасси синим гелей SDS-полиакриламида.

Создание мутанта C118A.

Кластеры [2Fe-2S] в SoxR удаляли путем замены цистеина в положении 118 на аланин с использованием набора для направленного мутагенеза QuikChange (Stratagene) в соответствии с инструкциями производителя. Плазмиду pSET152:: soxR использовали в качестве матрицы для мутагенеза вместе с праймерами C118A-F и C118A-R (см. Таблицу S1 в дополнительном материале).Полученный мутантный клон, pSET152::C118A, вводили в M145-1A путем конъюгации из E. coli ET12567/pUZ8002 для исследований in vivo . Для сверхэкспрессии и очистки из E.coli мутацию C118A вводили, как описано выше, в soxR , клонированном в векторе pET16b. Все мутации были подтверждены анализом последовательности ДНК, и мутантный белок был сверхэкспрессирован и аффинно очищен из E. coli , как описано выше.

Анализы сдвига электрофоретической подвижности (EMSA).

Связывание SoxR с промоторной ДНК оценивали с помощью анализов изменения подвижности в геле. ДНК-зонды были созданы с помощью ПЦР-амплификации с использованием геномной ДНК M145 и праймеров, перечисленных в таблице S1 в дополнительном материале. ДНК очищенных зондов метили дигоксигенином (DIG; Roche) в соответствии с инструкциями производителя, и 5 фмоль инкубировали индивидуально с меченым гистидином мутантным SoxR дикого типа (WT) или C118A (от 0 до 20 нМ) в течение 15 мин при 25°С. °C в буфере для связывания [10 мМ Tris-HCl, pH 7.5, 75 мМ KCl, 2 мМ дитиотреитола (ДТТ), 10% глицерина, 2 мМ MgCl 2 , 0,1 мкг поли(dI)-поли(dC)] в общем объеме 30 мкл. Для анализа конкуренции в реакционные смеси также добавляли 2500 фмоль немеченого зонда (специфический конкурент) или немеченой неспецифической мишени (фрагмент 160 п.н., содержащий промоторную область SCO7009 ). Связанные с белком и некомплексированные продукты ДНК разделяли на 5% полиакриламидном геле (3,3 мМ ацетат натрия, рН 7,9, трис-HCl, рН 8, 1 мМ ЭДТА, 2% глицерин), который нагревали при 10°С и 180 В в течение 90 мин.ДНК переносили на нейлоновые мембраны (Roche) и определяли хемилюминесцентно с использованием набора DIG gel shift 2-го поколения (Roche).

qRT-PCR.

Тотальную РНК экстрагировали из клеток, культивируемых на покрытых целлофаном чашках R2YE. Для сбора клетки инкубировали с бактериальным реагентом RNAprotect (Qiagen) в течение 5 мин при комнатной температуре, соскабливали с целлофановых мембран, центрифугировали в течение 10 мин при 5000 × г и замораживали при -80°C. Клетки лизировали, инкубируя их при 30°С в течение 30 мин в ТЕ-буфере, содержащем 3.3 мг/мл лизосом с последующей обработкой ультразвуком. Тотальную РНК экстрагировали из лизированных клеток с использованием мини-набора для растений RNeasy (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя. Геномную ДНК удаляли обработкой 5 ед. ДНКазы I, не содержащей РНКаз (Qiagen), в течение 1 ч при 37°С. Препарат РНК однократно экстрагировали кислым фенол-хлороформом и осаждали этанолом. Отсутствие загрязняющей геномной ДНК было подтверждено с помощью ПЦР с использованием праймеров HrdB (см. Таблицу S1 в дополнительном материале). кДНК была сгенерирована с помощью iScript (Bio-Rad) и использовалась в качестве матрицы для количественной ОТ-ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) (машина StepOne PCR; Applied Biosystems).Праймеры для qRT-PCR (Integrated DNA Technologies) были разработаны с использованием программного обеспечения Primer3 (48), с использованием температуры плавления 60 ° C, длины ~ 20 нуклеотидов и длины ампликона ~ 100 п.н. (Таблица S1). Каждая 20 мкл смеси qRT-PCR содержала 25 нг кДНК, по 250 мкМ каждого прямого и обратного праймера и 10 мкл мастер-микса Power Sybr green PCR (Applied Biosystems). Параметры реакции были следующими: 95°С в течение 10 мин, затем 40 двухэтапных циклов амплификации, состоящих из 15 с денатурации при 95°С и 1 мин отжига и удлинения при 60°С.Заключительную стадию диссоциации проводили для построения кривой плавления и проверки специфичности продуктов амплификации. Образцы анализировали в трех повторностях, и сигнал мишени стандартизировали до уровня hrdB (фактор сигма домашнего хозяйства).

Испытания на чувствительность к окислителям.

Влияние различных окислителей на рост M145 и M145-1A определяли с помощью анализа дисковой диффузии. споры S. coelicolor (~10 8 ) добавляли к 4 мл расплавленного мягкого питательного агара (Difco) и высевали на чашки с питательным агаром (Difco).Затем на агар помещали 6-миллиметровые бумажные диски ватмана, пропитанные различными окислителями. Планшеты инкубировали при 30°С в течение 48 ч и регистрировали зону задержки роста вокруг каждого диска. Испытываемыми препаратами были паракват, 4-нитрохинолин, феназинметосульфат, плюмбагин, менадион, диамид, H 2 O 2 и трет--бутилгидропероксид в указанных концентрациях (все реагенты были приобретены у Sigma). Пиоцианин был щедрым подарком Ларса Дитриха.

Количественное определение антибиотиков в твердых культурах. Споры

дикого типа и Δ soxR мутанта S. coelicolor (~10 8 ) культивировали на покрытых целлофаном чашках R2YE в течение 3 и 5 дней для анализа на Red и Act, соответственно. Клетки соскребали с целлофана, промывали водой, извлекали вакуумной фильтрацией и высушивали при 75°С перед взвешиванием. Красный экстрагировали подкисленным метанолом и обрабатывали 1 н. КОН, как описано ранее (5, 30). Оба пигмента были количественно определены спектроскопически с использованием опубликованных коэффициентов экстинкции (5, 30).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Мутант

S. coelicolor soxR не обладает гиперчувствительностью к окислителям и не имеет явного морфологического фенотипа.

За заметным исключением псевдомонад, SoxR опосредует защиту от окислительного стресса во всех группах бактерий, в которых он изучался (включая E. coli , Salmonella enterica серовары Typhimurium, Agrobacterium tumefaciens и Vibrio vulnific ) (16, 23, 35, 37).Чтобы определить, проявляет ли SoxR аналогичную способность в S. coelicolor , мы проверили влияние различных соединений, генерирующих супероксид, на рост штаммов дикого типа и Δ soxR S. coelicolor . Мутант E. coli Δ soxR гиперчувствителен к препаратам 4-нитрохинолин, феназин метосульфат и паракват (23). Напротив, анализ дисковой диффузии показал, что штаммы дикого типа и Δ soxR S. coelicolor были одинаково чувствительны к уничтожению этими агентами (рис.) и другие испытанные препараты, генерирующие супероксид (данные не представлены для менадиона, плюмбагина и пиоцианина). Обработка другими стандартными окислителями, в том числе H 2 O 2 , органическими пероксидами и диамидом, также не выявила существенных различий между штаммами (рис. и данные не представлены). Таким образом, подобно псевдомонадам, S. coelicolor не использует SoxR для защиты от окислительного стресса.

Мутант Δ soxR S. coelicolor не обладает гиперчувствительностью к пероксиду или веществам, образующим супероксид.Бумажные диски, пропитанные растворами 4-нитрохинолина, феназинметосульфата, параквата или перекиси водорода, помещали на бактериальные газоны дикого типа S. coelicolor или мутанта Δ soxR , растущих на чашках с питательным агаром. Зоны задержки роста вокруг дисков регистрировали через 48 ч при 30°С. Зона ингибирования 6 мм соответствует диаметру диска и свидетельствует об отсутствии обнаруживаемой зоны ингибирования. Данные представляют собой среднее значение результатов 5 повторов ± стандартное отклонение.

Как описано ранее, было высказано предположение, что SoxR может быть функционально законсервирован у S. coelicolor и P. aeruginosa , обоих обитающих в почве видов бактерий, продуцирующих антибиотики (12). SoxR модулирует развитие колоний и секрецию антибиотиков в последних; как таковой, мутант P. aeruginosa soxR -null проявляет повышенную секрецию синего антибиотика пиоцианина и образует колонии с более гладкой текстурой, чем колонии дикого типа (12). Чтобы определить, приводит ли дефицит soxR к аналогичному фенотипу у S.coelicolor , мы исследовали с помощью световой микроскопии морфологию клеток дикого типа и Δ soxR S. coelicolor , растущих на различных средах (богатая R2YE, минимальная SMMS и спорообразующая маннит-соевая мука) в течение 2-недельного периода. Поскольку хорошо известно, что на морфологическую и биохимическую дифференциацию Streptomyces влияют условия питания, для определения того, является ли какой-либо наблюдаемый фенотип специфичным для среды, использовались разные среды. Наши анализы показали, что не было заметной фенотипической разницы между штаммами дикого типа и штаммами с делецией soxR (данные не показаны).Количественное определение Red и Act, выделенных из культур, выращенных на поверхности, также не показало заметной разницы между двумя штаммами (данные не показаны).

Предполагаемый регулон SoxR состоит из пяти генов, экспрессия которых регулируется в процессе развития.

Фенотипический анализ описанного выше мутанта soxR не дал каких-либо указаний на физиологическую роль SoxR в S. coelicolor . Таким образом, мы решили применить биоинформатический подход и идентифицировать гены, регулируемые SoxR, у этой бактерии.Мы пришли к выводу, что природа этих генов поможет понять функцию SoxR. Ранее проведенный in silico поиск регулируемых SoxR генов в S. coelicolor , основанный на сходстве с промотором E. coli soxS , идентифицировал SCO2478 и SCO4266 в качестве потенциальных кандидатов (12). Эти два гена кодируют предполагаемые оксидоредуктазы, гомологичные ферментам адаптации антибиотиков (17, 53). Геном S. coelicolor содержит три дополнительных потенциальных гена-мишени SoxR, о которых Ларс Дитрих и его коллеги не сообщили, поскольку они упали ниже порога, установленного этими исследователями (личное сообщение).Эти гены включают предполагаемый переносчик ABC ( SCO7008 ), предполагаемую монооксигеназу ( SCO1909 ) и предполагаемую НАД-зависимую эпимеразу/дегидратазу ( SCO1178 ) (рис. и таблица). Примечательно, что SCO1909 подобен PA2274 , подтвержденному SoxR-регулируемому гену в P. aeruginosa (12, 43). Подобно промотору E. coli soxS и другим промоторам, регулируемым белками семейства MerR, промоторы предполагаемого регулона SoxR в S.coelicolor имеют удлиненный спейсер из 19 п.н. между их предсказанными последовательностями -10 и -35 (рис. 1).

Промоторы предполагаемых генов, регулируемых SoxR, у S. coelicolor содержат консервативные сайты связывания SoxR. Промоутер E.coli SOXS COLI SOXS выровнен с промотателями предсказанных S. Coelicolor Genxr-регулируемых генов, SCO2478 , SCO4266 ( ECAD ), SCO7008 ( ECAA ), SCO1909 ( ecaB ) и SCO1178 ( ecaC ).Сайты связывания SoxR выделены жирным шрифтом, а перевернутые стрелки показывают последовательность диадной симметрии. Звездочки указывают на консервативные нуклеотиды в сайте связывания SoxR. Сайт начала транскрипции E. coli soxS помечен +1, а поля -10 и -35 указаны. Показано количество нуклеотидов в стартовых кодонах различных генов. Подчеркнутая и выделенная курсивом последовательность «TCGAG» отмечает предполагаемый сайт связывания ActII-ORF4.

ТАБЛИЦА 2.

S.coelicolor SoxR регулона сохраняется в других Streptomyces

видов Прогнозируемая функция флавопротеида редуктазы SCO2478 SAV_5665 SCLAV_1679
С. coelicolor SoxR гомолог в:
S. coelicolor S.avermitilis, A 90 031 С. clavuligerus С. пзеиз S. чесотки
SGR_5059 SCAB62351
оксидоредуктазы SCO4266 (ECAD) SAV_3956 SCLAV_3239 SGR_4037 Нет гомолог
ABC транспортеров SCO7008 (ECAA ) SAV_7218 SCLAV_0059 SGR_6589 SCAB12171
монооксигеназная SCO1909 ( ECAB ) Нет гомолог SCLAV_1111 SGR_5610 SCAB70221
НАД-зависимых эпимераза / дегидратазе SCO1178 ( ЕСАС ) Нет гомолог SCLAV_p0595 SGR_3374 SCAB5581

Интересно, четыре предполагаемых гена-мишени SoxR ( SCO7008 , SCO1909 , SCO1178 и SCO4266 ) ранее были идентифицированы как гены, уровни экспрессии которых были временно согласованы с Act ( eca ) и чьи уровни экспрессии были значительно снижены в мутант, которому не хватает th e Активатор специфического пути биосинтеза Act actII -ORF4 (32).Мы независимо проверили выражение развития SCO7008 ( ECAA ), SCO1909 ( ECAB ), SCO1178 ( ECAC ) и SCO4266 ( ECAD ) от QRT-PCR. В дополнение к этим генам мы следили за экспрессией пятой предполагаемой мишени SoxR, SCO2478 , а также SCO7009 , гена eca ( ecaE ), который, по прогнозам, не находится под контролем SoxR (поскольку его промотор не имеет очевидной последовательности связывания SoxR).Клетки дикого типа выращивали на покрытой целлофаном агаровой среде R2YE, и образцы собирали через 1, 2, 3 или 5 дней инкубации для получения РНК для количественной ОТ-ПЦР. Пять предполагаемых генов-мишеней SoxR проявляли экспрессию, зависящую от фазы роста, и были максимально экспрессированы между 3 и 5 днями после инокуляции (фиг.1). Это время совпало с появлением Act в наших экспериментальных условиях (красный цвет появился на 24 часа раньше) и согласуется с выводами Хуанга и его сотрудников для ecaA-ecaD (32).В отличие от сообщений Huang et al. (31, 32), мы не наблюдали значительных изменений в экспрессии ecaE в течение 5-дневного периода (рис. ). Эксперименты, описанные ниже, также показали, что экспрессия ecaE не снижалась в мутанте act II-ORF4 (см. фиг. 7). Непоследовательные результаты для ecaE могут быть объяснены различными используемыми методологиями (микрочип по сравнению с qRT-PCR). Несмотря на это, поскольку ecaE служит только в качестве отрицательного контроля в наших экспериментах, мы больше не занимались этим вопросом.

Предполагаемый регулон S. coelicolor SoxR активируется на поздних стадиях развития. РНК экстрагировали из выращенного на чашках S. coelicolor дикого типа после 1 (D1), 2 (D2), 3 (D3) или 5 (D5) дней инкубации при 30°C и использовали для получения кДНК для количественной RT. -ПЦР. Сигналы были стандартизированы по уровням hrdB , а кратность изменений нормализована до уровня на D1. soxR также тестировали на изменения экспрессии гена, как и ecaE , ген, который, по прогнозам, не находится под контролем SoxR.Данные представляют собой средние значения результатов двух независимых экспериментов, а планки погрешностей указывают на стандартные отклонения.

SoxR специфически связывается с промоторами своих предполагаемых генов-мишеней.

Способность SoxR связываться с промоторными областями его пяти предполагаемых генов-мишеней оценивали с помощью EMSA с использованием очищенных фрагментов ДНК SoxR с N-концевой гистидиновой меткой и меченых на конце DIG фрагментов ДНК, охватывающих различные промоторы. SoxR связывается с высокой аффинностью со всеми пятью промоторами; количество белка, необходимое для связывания 50% ДНК, варьировалось от 1 до 5 нМ (рис.). Это сродство сравнимо с таковым E. coli SoxR для промотора soxS (7). Напротив, SoxR не связывался с контрольным фрагментом ДНК, охватывающим промотор ecaE (который, как предполагается, не находится под контролем SoxR) (фиг. 1). Специфичность связывания исследовали с помощью анализов конкуренции. Добавление 500-кратного избытка немеченого зонда устраняло связывание SoxR с ДНК меченого зонда (рис. 1). Добавление 500-кратного избытка неспецифического зонда промотора ecaE мало влияло на связывание SoxR с промоторами SCO2478 , ecaD и ecaA , но немного конкурировало со связыванием с промоторами ecaB . и ecaC (рис.). Это, вероятно, отражает уменьшенную аффинность SoxR к последним промоторам, которые несут несовершенную последовательность инвертированных повторов (Fig. 3).

SoxR связывается с промоторами своих пяти предсказанных генов-мишеней. Фрагменты ДНК с мечеными концами DIG, охватывающими промоторные области SCO2478 , ecaD , ecaA , ecaB , ecaC , и отрицательный контроль , очищенный гистид-индуцированный ecaE , инактивировали с различными количествами очищенного гистида ecaE . белок.Связанные с белком комплексы (С) отделяли от свободной ДНК (F) на 5% нативном полиакриламидном геле. Специфичность связывания SoxR была продемонстрирована путем добавления 500-кратного молярного избытка немеченой, неспецифической (не sp.) ДНК-конкурента (фрагмент промотора ecaE ) и 500-кратного молярного избытка немеченого зонда (специфический [Spec.] ДНК конкурентов).

Количественная ПЦР в реальном времени подтверждает SoxR-зависимую экспрессию регулона SoxR.

Описанные выше анализы сдвига в геле продемонстрировали, что SoxR специфически связывается с промоторами пяти предполагаемых промоторов генов-мишеней in vitro .Чтобы изучить регуляцию in vivo с помощью SoxR, уровни экспрессии пяти предполагаемых мишеней SoxR в диком типе и мутанте Δ soxR измеряли с помощью qRT-PCR. Поскольку предполагаемый регулон SoxR максимально экспрессировался между 3 и 5 днями после инокуляции, из 4-дневных культур (при активной продукции Act) выделяли суммарную РНК и подвергали количественной ОТ-ПЦР. Анализ показал, что уровни мРНК пяти предполагаемых генов-мишеней SoxR были значительно снижены у мутанта Δ soxR по сравнению с диким типом (от 6 до 150 раз), подтверждая, что эти гены действительно находятся под контролем SoxR (рис.). Наоборот, уровни экспрессии ecaE у двух штаммов существенно не различались, как и ожидалось.

Количественная ОТ-ПЦР подтверждает зависимую от SoxR экспрессию регулона SoxR в S. coelicolor . (A) Уровень экспрессии пятигенного регулона SoxR значительно ниже у мутанта Δ soxR , чем у дикого типа. Клетки дикого типа и Δ soxR мутантные клетки выращивали на покрытых целлофаном чашках R2YE в течение 4 дней. РНК экстрагировали, кДНК готовили и проводили qRT-PCR для анализа экспрессии SCO2478 , ecaD , ecaA , ecaB и ecaC , а также отрицательного контроля eca4 eca.Уровни экспрессии всех генов стандартизировали по уровню конститутивно экспрессированного гена hrdB . Показана разница в экспрессии генов между диким типом и мутантом Δ soxR . (B) Комплементарный анализ. qRT-PCR проводили на РНК, выделенной из WT/pSET152, Δ soxR /pSET152 и штамма Δ soxR , комплементированного soxR дикого типа (pSoxR), выращенных на чашках R2YE в течение 5 дней. Уровни экспрессии soxR , SCO2478 и ecaD стандартизировали до уровня hrdB и нормализовали по экспрессии в WT/pSET152.Значения, указанные на панелях А и В, представляют собой средние значения результатов трех независимых экспериментов ± стандартные отклонения.

Чтобы подтвердить, что регуляторный дефект мутанта Δ soxR был обусловлен отсутствием soxR , а не какими-либо полярными эффектами, возникающими в результате делеции, мы провели комплементарный эксперимент. С этой целью мы использовали qRT-PCR для анализа изменений экспрессии SCO2478 и ecaD в комплементированном штамме Δ soxR (который экспрессирует soxR из хромосомно интегрированной плазмиды, pSET152).На рисунке показано, что эписомальная экспрессия soxR восстанавливала способность мутанта soxR индуцировать SoxR-зависимые гены. Вместе с результатами EMSA эти результаты демонстрируют, что SoxR напрямую активирует экспрессию пяти генов у S. coelicolor .

Экспрессия регулона SoxR значительно снижена у актинородин-дефицитного мутанта.

SoxR конститутивно экспрессируется в E. coli и P. aeruginosa , однако он активирует транскрипцию своих генов-мишеней только после получения соответствующего сигнала.Этот сценарий, по-видимому, сохраняется у S. coelicolor , где мРНК soxR была обнаружена на протяжении всего развития, но регулон SoxR значительно экспрессировался только на поздних стадиях развития, после продукции пигментированных антибиотиков Red и Act (Fig. 1). Этот паттерн предполагает, что Red и/или Act (или биосинтетические предшественники любого антибиотика) могут запускать активность SoxR. Чтобы проверить эту гипотезу, экспрессия регулона SoxR в M511 (штамм с внутрирамочной делецией act II-ORF4, специфический для пути регулятор биосинтеза Act), M510 (мутант Δ redD , лишенный пути -специфический активатор синтеза Red), и был проанализирован пигмент-дефицитный штамм M512 (Δ redD Δ act II-ORF4) (20).Анализ qRT-PCR показал, что в то время как soxR экспрессировался на сравнимых уровнях у дикого типа и у Act-null мутанта M511 (данные не показаны), экспрессия пяти генов-мишеней SoxR была значительно снижена у Act-null мутанта по сравнению с дикий тип (от 20 до 70 раз), демонстрируя, что экспрессия пути Act необходима для активности SoxR (Fig. 1). Напротив, регулон SoxR экспрессировался на сходных уровнях у дикого типа и у Red-null мутанта M510, тем самым устраняя Red как эффектор активности SoxR (фиг.). Экспрессия гена, регулируемая SoxR, в M512 существенно не отличалась от таковой в M511, что указывает на то, что Red и Act не действуют синергетически для регуляции SoxR (Fig. 1). Как упоминалось ранее, экспрессия ecaE , который был идентифицирован микрочиповым анализом как ген, экспрессия которого координируется с Act, не снижалась в мутантном Act штамме M511 по сравнению с диким типом в наших экспериментах (рис. 1).

Экспрессия регулона SoxR зависит от продукции актинородина.(A) Экспрессия регулона SoxR с пятью генами значительно снижена у Act-дефицитного мутанта. qRT-PCR проводили на РНК, выделенной из 4-дневных выращенных на чашках клеток дикого типа, Red-дефицитных (M510), Act-дефицитных (M511) и Red- и Act-дефицитных (M512). Сигналы были стандартизированы до уровня hrdB , и показаны различия в экспрессии генов между диким типом и различными мутантами. Статистическая обработка данных с помощью теста Стьюдента t не показывает существенных различий в экспрессии генов на фоне М511 и М512.(B) гена eca напрямую регулируются SoxR, но не ActII-ORF4. Уровни экспрессии ecaA , ecaB и ecaC в диком типе, мутанте soxR (белые столбцы), мутанте Act (M511, серые столбцы) и soxR , двойном мутанте Act (M512Δ soxR , черные столбцы) анализировали с помощью qRT-PCR. Сигналы были стандартизированы до уровня hrdB , и показаны кратные различия между диким типом и различными мутантами.Данные на панелях A и B представляют собой средние значения результатов трех независимых экспериментов ± стандартные отклонения.

Представленные данные демонстрируют, что регулон SoxR S. coelicolor состоит из пяти генов и что активность SoxR (и, следовательно, экспрессия регулона) зависит от функционального пути биосинтеза Act. Huang и соавт. независимо наблюдали Act-зависимую экспрессию четырех из этих генов, ecaA-ecaD , и они предположили, что эти гены могут быть непосредственно активированы активатором ActII-ORF4, специфичным для пути Act (32).Это предположение было основано на наблюдении, что промоторы ecaA , — B и — C содержат последовательность 5′-TCGAG, которая является потенциальным сайтом стыковки ActII-ORF4 (1) (Fig. ). Мы допускали возможность того, что эти гены находятся под двойной регуляцией SoxR и ActII-ORF4. Если это правда, то можно было бы ожидать, что их экспрессия будет более серьезно дефектной у двойного мутанта Δact II-ORF4 Δ soxR , чем у любого из одиночных мутантов. Чтобы проверить этот механизм двойной регуляции, мы сравнили уровни экспрессии ecaA , — B и — C в M145-1A (Δ soxR ), M511 (Δ act II-ORF4), и M511Δ soxR act II-ORF4 Δ soxR ) и обнаружили, что эти гены экспрессировались на сравнимых уровнях в Δ soxR и Δ act II-ORF4 Δ 3 двойной мутант sox4 .). Отсюда мы заключаем, что ecaA , — B и — C находятся под прямым контролем SoxR, тогда как ActII-ORF4 действует опосредованно, включая путь биосинтеза Act, продукт которого модулирует активность SoxR.

Кластеры [2Fe-2S] в SoxR необходимы для транскрипционной активности. Кластеры

[2Fe-2S] необходимы для активности SoxR E. coli (3) и, хотя это формально не продемонстрировано (путем мутагенного анализа), предположительно также для активности белков SoxR псевдомонад.В этих организмах редокс-активные агенты окисляют кластеры SoxR [2Fe-2S] для активации белка. Чтобы подтвердить, что SoxR аналогично регулируется окислительно-восстановительным потенциалом в S. coelicolor , мы создали мутант с дефицитом [2Fe-2S] путем замены цистеина в положении 118 на аланин (рис. 1). Эквивалентная мутация в E. coli SoxR приводит к устранению кластеров [2Fe-2S] и неспособности активировать транскрипцию soxS (3). Мы подтвердили отсутствие кластеров [2Fe-2S], наблюдая за оптическим спектром очищенного мутантного белка C118A.В то время как SoxR дикого типа давал спектр поглощения, характерный для [2Fe-2S]-содержащих белков, вариант C118A этого не делал (рис. 1). Анализы сдвига геля, проведенные с очищенными мечеными гистидином белками, показали, что, хотя мутантный белок C118A сохраняет способность связываться с промоторами ecaD и SCO2478 , он связывается с более низким уровнем аффинности, чем SoxR дикого типа (рис. и данные не показаны). Это также наблюдалось с дефектным кластером E. coli SoxR, который обнаруживает дефект связывания промотора как in vivo , так и in vitro (7, 8).Мы ввели мутантный ген C118A soxR в штамм Δ soxR через вектор pSET152, чтобы обеспечить хромосомную интеграцию гена через сайт att , и отслеживали транскрипцию самого soxR и двух генов-мишеней SoxR, . SCO2478 и eCAD , с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Результаты, показанные на фиг., показывают, что, хотя комплементация с soxR дикого типа восстанавливала активацию SCO2478 и ecaD , мутант C118A был неспособен восстановить дефект Δ soxR .Следовательно, кластеры [2Fe-2S] являются критическими кофакторами, необходимыми для транскрипционной активности S. coelicolor SoxR.

Кофакторы [2Fe-2S] имеют решающее значение для активности SoxR. (A) Спектры поглощения белков SoxR дикого типа и C118A. Спектр SoxR дикого типа показывает четыре пика при 332, 414, 462 и 548 нм, что характерно для белков [2Fe-2S] (42). Мутант C118A не дает этого спектра, что указывает на потерю кластеров [2Fe-2S]. (B) Мутантный белок C118A имеет небольшой дефект связывания с ДНК.Меченую DIG-концом ДНК, охватывающую промоторную область ecaD , инкубировали с возрастающими количествами очищенных меченных гистидином белков дикого типа или белков C118A SoxR. Связанные с белком комплексы (С) отделяли от свободной ДНК (F) на 5% нативном полиакриламидном геле. Процент общего фрагмента ДНК, связанного на каждой дорожке, был количественно определен с использованием программного обеспечения ImageQuant (Bio-Rad) и указан под гелем. (C) Мутант C118A SoxR не дополняет штамм Δ soxR . qRT-PCR проводили на РНК, выделенной из WT/pSET152, Δ soxR /pSET152, и штамма Δ soxR , комплементированного soxR дикого типа (pSoxR) или мутанта C118A, выращенных на чашках R2YE в течение 5 дней. .Уровни экспрессии soxR , SCO2478 и ecaD стандартизировали до уровня hrdB и нормализовали по экспрессии в WT/pSET152. Значения представляют собой средние значения результатов трех независимых экспериментов ± стандартные отклонения.

ОБСУЖДЕНИЕ

В последнее десятилетие несколько групп исследовали функцию гомологов SoxR в различных бактериях. Эта активность была мотивирована наблюдением, что, хотя soxR является высококонсервативным, его хорошо охарактеризованный партнер в E.coli , soxS , отсутствует в геномах некишечных видов, что указывает на то, что физиологическая роль и пути передачи сигнала, опосредованные SoxR, отчетливо адаптированы у разных бактерий. Несколько видов, исследованных на сегодняшний день, подтвердили это. В E. coli и родственных энтеробактериях SoxR защищает от супероксидного стресса, вызванного экзогенными окислительно-восстановительными препаратами. У этих бактерий эффект SoxR опосредован SoxS. SoxR, по-видимому, действует аналогичным образом в отношении грамотрицательных патогенов V.vulnificus и A. tumefaciens , где дефицит soxR приводит к гиперчувствительности к супероксидному стрессу (16, 35, 37). Здесь SoxR активирует марганецсодержащие супероксиддисмутазы SoxS-независимым образом (16, 35, 37). Два других исследованных организма, P. aeruginosa и P. putida , не используют SoxR для защиты от окислительного стресса (43, 44). Скорее, SoxR регулирует экспрессию механизма оттока и модификации феназина в ответ на эндогенно продуцируемые феназиновые антибиотики в P.aeruginosa (12, 13). Регулон P. putida SoxR не был выяснен эмпирически, но анализ генома in silico показывает сайты связывания SoxR выше по течению от переносчика RND (кодируется PP2063-PP2065 ), оксидоредуктазы (кодируется PP2547 90 ) и GGDEF-содержащий белок (кодируемый PP2505 ) (данные не показаны). Недавно было продемонстрировано, что гены, кодирующие эти белки (среди других генов), индуцируются при воздействии 2,4,6-тринитротолуола, нитроароматического соединения, которое вызывает токсичность за счет увеличения клеточных уровней активных форм кислорода и соединений гидроксиламина (18).

В этой работе мы описали пятигенный регулон SoxR у S. coelicolor , продукты которого, как предполагается, кодируют транспортный белок ABC ( SCO7008 [ ecaA ]), две оксидоредуктазы ( SCO2478 и SCO4266 [ ecaD ]), монооксигеназа ( SCO1909 [ ecaB ]) и НАД-зависимая эпимераза/дегидратаза ( SCO1178 [ ecaC ]) (таблица). Примечательно, что ecaD сходен с оксидоредуктазами (ActVI-ORF2 и ActVI-ORF4), а ecaB с монооксигеназой (ActVA-ORF6), которые катализируют более поздние этапы пути биосинтеза Act.Эти реакции адаптации приводят к продукции ряда биологически активных метаболитов и, наконец, к действию (33, 41, 50). Также следует отметить, что PA2274 , SoxR-регулируемая монооксигеназа в P. aeruginosa , по предсказаниям (на основе гомологии последовательностей) принадлежит к тому же классу монооксигеназ, что и ecaB и ActVA-ORF6 (50). Таким образом, регулон S. coelicolor SoxR напоминает эквивалент P. aeruginosa в кодировании мембранного транспортного белка и ферментов, модифицирующих малые молекулы.У этих продуцентов антибиотиков регулоны SoxR экспрессируются при производстве специфических окислительно-восстановительных антибиотиков, Act в S. coelicolor и пиоцианин в P. aeruginosa , что подтверждает мнение о том, что SoxR активируется эндогенно продуцируемыми антибиотиками и опосредует отток. и их оборот в бактериях-продуцентах. Интересно, что регулон SoxR S. coelicolor , по-видимому, консервативен у других членов этого рода плодовитых продуцентов антибиотиков, что позволяет предположить, что SoxR играет аналогичную роль у всех продуцентов антибиотиков, где он присутствует.Полностью секвенированные геномы Streptomyces avermitilis , S. clavuligerus , S. griseus и S. scabies содержат все (или подмножество) генов S. coelicolor , регулируемых SoxR (таблица). Все гены, перечисленные в таблице, содержат предполагаемый сайт связывания SoxR в своих промоторах (данные не показаны; последовательности доступны на http://strepdb.streptomyces.org.uk/). гомологи ecaB и ecaC отсутствуют у S. avermitilis ; однако эта бактерия содержит три других гена, которые потенциально находятся под контролем SoxR, включая SAV_1623 (предполагаемая транскетолаза), SAV_4018 (предполагаемая дегидрогеназа) и SAV_4017 (предполагаемый регулятор транскрипции семейства TetR).Последнее интригует и предполагает, что SoxR может потенциально контролировать экспрессию генов на более глобальном уровне посредством второго транскрипционного фактора, аналогично ситуации в E. coli .

Каково биологическое значение активности SoxR? На основании идентичности генов регулона SoxR наиболее очевидным выводом является защита организма-продуцента от токсического действия эндогенных антибиотиков. В соответствии с этой теорией делеция mexGHI-ompD (регулируемый SoxR переносчик феназинов в P.aeruginosa ) приводит к снижению приспособленности (12). Учитывая явное сходство между системами S. coelicolor и P. aeruginosa , мы были удивлены тем, что не наблюдали какой-либо сниженной жизнеспособности (по оценке размера колонии) или какого-либо видимого фенотипа мутанта S. coelicolor soxR . Самое простое объяснение этого состоит в том, что S. coelicolor обладает несколькими видами самосопротивления действию; в случае отказа одного механизма компенсационные механизмы обеспечат безопасность организма-продуцента.Действительно, генетические данные указывают на то, что продукты act II-ORF2/ORF3 и act VA-ORF1 играют важную роль в экспорте Act и производных синих пигментов (5, 19). Тройной мутантный штамм act II-ORF2/ORF3 act VA-ORF1 показал значительное снижение экспорта синих пигментов по сравнению с диким типом, но, что примечательно, отток не был полностью устранен (5). Мы предполагаем, что в отсутствие основных экспортеров Закона регулируемый SoxR транспортер ABC ecaA компенсирует это.Интересно, что ecaA является наименее активным из генов регулона SoxR. Таким образом, если он участвует в экспорте Акта, он может быть второстепенным игроком. Нам не удалось обнаружить каких-либо различий в количестве синих пигментов, продуцируемых или секретируемых штаммами дикого типа или мутантными штаммами soxR (данные не показаны).

Четыре других члена регулона SoxR также потенциально могут быть посредниками в детоксикации Акта. Как упоминалось ранее, два из предсказанных генных продуктов подобны ферментам, которые модифицируют биосинтетические предшественники Act.Вполне возможно, что окислительно-восстановительные ферменты, регулируемые SoxR, химически модифицируют предшественники Act, превращая их в менее токсичные виды. Этот дополнительный защитный механизм будет функционировать в сочетании с оттоком лекарств. Использование множественных механизмов резистентности к одному токсичному продукту не редкость (10). Streptomyces lavendulae , например, защищает себя от вредного воздействия митомицина тремя различными способами: инактивация лекарственного средства фларин-адениндинуклеотид-зависимой оксидоредуктазой (34), экспорт лекарственного средства (51) и секвестрация лекарственного средства (52).То, что S. coelicolor использует несколько механизмов для предотвращения самоуничтожения с помощью Act, объясняет тот факт, что тройной мутант act II-ORF2/ORF3 act VA-ORF1 (дефектный в экспорте Act) является жизнеспособным ( 5), как и мутант soxR .

Нельзя сбрасывать со счетов альтернативную функцию Act-detoxification для S. coelicolor SoxR regulon. Продукты регулона, несомненно, влияют на какой-то процесс, связанный с Актом, поскольку их выражение тесно связано с производством Акта.Но с какой целью? В последние годы ведется много споров об экологической роли вторичных метаболитов. Растет понимание того, что эти метаболиты, обычно рассматриваемые как отходы или медиаторы биологической войны, на самом деле могут играть важную физиологическую роль в организмах-продуцентах. Феназиновые антибиотики, продуцируемые P. aeruginosa , например, помогают в усвоении железа и выработке энергии в условиях высокой плотности клеток, когда доступность кислорода становится ограниченной (47).Феназины также действуют как межклеточные сигнальные молекулы и участвуют в сети восприятия кворума для координации образования биопленок у P. aeruginosa и Pseudomonas aureofaciens (12, 13, 39). SoxR может опосредовать некоторые из этих эффектов у псевдомонад (12, 13). Физиологическая роль вторичных метаболитов в S. coelicolor неизвестна, хотя предполагается, что они могут действовать как эффекторы дифференцировки (т.е. способствовать спорообразованию) (6, 40, 54). Эта гипотеза подтверждается тем фактом, что продукция вторичных метаболитов временно связана с морфологической дифференцировкой, и многие мутанты с нарушениями развития также являются дефицитными по антибиотикам (и наоборот).Принимая во внимание сложные генетические детерминанты, кодирующие вторичные метаболиты, и метаболические ресурсы, необходимые для их производства, легко предположить, что эти метаболиты играют полезную роль, которая обеспечивает преимущество выживания в природе. SoxR может опосредовать часть эффектов Act у S. coelicolor , аналогично его предполагаемой роли у P. aeruginosa . Причина, по которой мы не наблюдаем ассоциированного фенотипа с мутантом soxR , заключается в том, что лабораторные условия не точно имитируют естественные экологические условия S.Целиколор . Мы разрабатываем экраны для дальнейшего изучения этого.

Какой физиологический сигнал регулирует активность SoxR у S. coelicolor ? Мы можем предположить с разумной уверенностью, что сигнал должен быть редокс-активной молекулой, которая регулирует SoxR через его [2Fe-2S] кластеры, поскольку мутантный белок SoxR с дефицитом кластера был дефектен в транскрипционной активности (Fig. 1). Мы предоставили доказательства того, что этот сигнал должен быть связан с Act, поскольку SoxR не индуцирует свои гены-мишени в отсутствие синтеза Act (рис.). Триггером может быть сам Act или окислительно-восстановительный предшественник или производное Act. Интересно, что единственный задокументированный механизм устойчивости к Act (описанный выше экспортер Act) активируется (S)-DNPA, предшественником Act, и калафунгином, молекулой, родственной другому предшественнику, дигидрокалафунгину (53). Остается определить, вызывают ли эти же молекулы активность SoxR.

Благодарности

Эта работа была поддержана стартовым грантом колледжа Брин-Мор и грантом AREA Национального института общих медицинских наук (R15GM0) М.C.

Мы благодарны Ларсу Дитриху и Трейси Тил за обмен неопубликованными биоинформационными данными и участие в стимулирующих дискуссиях, Мервину Биббу за предоставление штаммов M510, M511 и M512, Эми Геринг за pSET152, Центру перенаправления Джона Иннеса. реагентов, Уильяму Малаховски за советы по редокс-активным молекулам и Питеру Сетлоу, Джоанн Уилли и Лилиан Хсу за полезные комментарии к рукописи.

Сноски

Опубликовано до печати 15 октября 2010 г.

Дополнительный материал к этой статье можно найти на http://jb.asm.org/.

ССЫЛКИ

1. Ариас П., М. А. Фернандес-Морено и Ф. Мальпартида. 1999. Характеристика специфического для пути положительного регулятора транскрипции биосинтеза актинородина в Streptomyces coelicolor A3(2) как ДНК-связывающего белка. Дж. Бактериол. 181 : 6958-6968. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]2. Бирман, М., Р.Логан, К. О’Брайен, Э. Т. Сено, Р. Н. Рао и Б. Э. Шонер. 1992. Плазмидные клонирующие векторы для конъюгального переноса ДНК из Escherichia coli в Streptomyces spp. Ген 116 : 43-49. [PubMed] [Google Scholar]3. Брэдли, Т. М., Э. Идальго, В. Леото, Х. Дин и Б. Демпл. 1997. Замена цистеина на аланин в белке Escherichia coli SoxR и роль центров [2Fe-2S] в активации транскрипции. Нуклеиновые Кислоты Res.25 : 1469-1475. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]4. Браун, Н. Л., Дж. В. Стоянов, С. П. Кидд и Дж. Л. Хобман. 2003. Семейство регуляторов транскрипции MerR. ФЭМС микробиол. 27 : 145-163. [PubMed] [Google Scholar]5. Быстрых Л.В., Фернандес-Морено М.А., Эррема Дж.К., Мальпартида Ф., Хопвуд Д.А., Дийкхейзен Л. 1996. Производство актинородиновых «голубых пигментов» с помощью штамма Streptomyces coelicolor A3(2). Дж. Бактериол.178 : 2238-2244. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]6. Чаллис, Д. Л. и Д. А. Хопвуд. 2003. Синергизм и непредвиденные обстоятельства как движущие силы эволюции производства множественных вторичных метаболитов видами Streptomyces . проц. Натл. акад. науч. США 105 : 14555-14561. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]7. Чандер М. и Б. Демпл. 2004. Функциональный анализ остатков SoxR, влияющих на трансдукцию сигналов окислительного стресса в экспрессию генов.Дж. Биол. хим. 279 : 41603-41610. [PubMed] [Google Scholar]8. Чандер М., Л. Радуча-Грейс и Б. Демпл. 2003. Дефектные по транскрипции soxR мутанты Escherichia coli : выделение и характеристика in vivo . Дж. Бактериол. 185 : 2441-2450. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]9. Черепанов П. П. и Вакернагель В. 1995. Нарушение гена в кассетах Escherichia coli : Tc R и Km R с возможностью катализируемого Flp вырезания детерминанты устойчивости к антибиотикам.Гена 158 : 9-14. [PubMed] [Google Scholar] 10. Cundliffe, E. 1992. Механизмы самозащиты у производителей антибиотиков. Циба найдена. Симп. 171 : 199-214. [PubMed] [Google Scholar] 11. Даценко К.А., Ваннер Б.Л. 2000. Одноэтапная инактивация хромосомных генов в Escherichia coli K-12 с использованием продуктов ПЦР. проц. Натл. акад. науч. США 97 : 6640-6645. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]12. Дитрих, Л.Э. П., Т. К. Тил, А. Прайс-Уилан и Д. К. Ньюман. 2008. Редокс-активные антибиотики контролируют экспрессию генов и поведение сообщества дивергентных бактерий. Science 321 : 1203-1206. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]13. Дитрих, Л.Э.П., А. Прайс-Уилан, А. Петерсен, М. Уайтли и Д.К. Ньюман. 2006. Феназин пиоцианин является конечным сигнальным фактором в сети распознавания кворума Pseudomonas aeruginosa . Мол. микробиол. 61 : 1308-1321.[PubMed] [Google Scholar] 14. Дин, Х. и Б. Демпл. 1997. In vivo Кинетика окислительно-восстановительного переключателя транскрипции. проц. Натл. акад. науч. США 94 : 8445-8449. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]15. Дин, Х., Э. Идальго и Б. Демпл. 1996. Редокс-состояние кластеров [2Fe-2S] в белке SoxR регулирует его активность как фактора транскрипции. Дж. Биол. хим. 271 : 33173-33175. [PubMed] [Google Scholar] 16. Эйамфунгпорн, В., Н. Чароенлап, П. Ваттанавибун и С. Монгколсук. 2006. Agrobacterium tumefaciens soxR участвует в защите от супероксидного стресса, а также непосредственно регулирует индуцируемую супероксидом экспрессию самого себя и гена-мишени. Дж. Бактериол. 188 : 8669-8673. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]17. Фауст Б., Д. Хоффмайстер, Г. Вайтнауэр, Л. Вестрих, С. Хааг, П. Шнайдер, Х. Декер, Э. Кунцель, Дж. Рор и А. Бехтольд. 2000. Два новых портняжных фермента, гликозилтрансфераза и оксигеназа, участвуют в биосинтезе ангуциклинового антибиотика урдамицина А в Streptomyces fradiae Tu2717.Микробиология 146 : 147-154. [PubMed] [Google Scholar] 18. Фернандес, М., Э. Дуке, П. Писарро-Тобиас, П. ван Диллевейн, Р. М. Виттих и Дж. Л. Рамос. 2009. Микробные реакции на соединения ксенобиотиков. Выявление генов, позволяющих Pseudomonas putida KT2440 справляться с 2,4,6-тринитротолуолом. микроб. Биотехнолог. 2 : 287-294. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]19. Фернандес-Морено, М. А., Дж. Л. Кабальеро, Д. А. Хопвуд и Ф.Мальпартида. 1991. Кластер act содержит регуляторные гены и гены экспорта антибиотиков, прямые мишени для трансляционного контроля с помощью гена тРНК bldA Streptomyces . Сотовый 66 : 769-780. [PubMed] [Google Scholar] 20. Флориано, Б. и М. Бибб. 1996. afsR является плейотропным, но условно необходимым регуляторным геном для производства антибиотиков в Streptomyces coelicolor A3(2). Мол. микробиол. 21 : 385-396.[PubMed] [Google Scholar] 21. Гауду, П., Н. Мун и Б. Вайс. 1997. Регулирование регулона окислительного стресса soxRS . Обратимое окисление Fe-S центров SoxR in vivo. Дж. Биол. хим. 272 : 5082-5086. [PubMed] [Google Scholar] 22. Гауду П. и Б. Вайс. 1996. SoxR, фактор транскрипции [2Fe-2S], активен только в своей окисленной форме. проц. Натл. акад. науч. США 93 : 10094-10098. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]23. Гринберг, Дж. Т., П. Монах, Дж. Дж. Чоу, П. Д. Джозефи и Б. Демпл. 1990. Положительный контроль регулона глобальной антиоксидантной защиты, активированного агентами, генерирующими супероксид, в Escherichia coli . проц. Натл. акад. науч. США 87 : 6181-6185. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]24. Гаст Б., Г. Л. Чаллис, К. Фаулер, Т. Кизер и К. Ф. Чейтер. 2003. Замена гена с помощью ПЦР в Streptomyces и ее использование для идентификации белкового домена, участвующего в биосинтезе сесквитерпенового геосмина с запахом.проц. Натл. акад. науч. США 100 : 1541-1546. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]25. Хельдвейн, Э. Э. и Р. Г. Бреннан. 2001. Кристаллическая структура транскрипционного фактора BmrR, связанного с ДНК и лекарственным средством. Природа 409 : 378-382. [PubMed] [Google Scholar] 26. Heltzel, A., I.W. Lee, P.A. Totis и A.O. Summers. 1990. Зависимое от активатора преиндукционное связывание сигма-70 РНК-полимеразы с регулируемым металлом -мерным промотором . Биохимия 29 : 9572-9584.[PubMed] [Google Scholar] 27. Идальго, Э. и Б. Демпл. 1997. Расстояние между промоторными элементами регулирует базальную экспрессию гена soxS и превращает SoxR из активатора транскрипции в репрессор. EMBO J. 16 : 1056-1065. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]28. Идальго Э., Дж. М. Боллинджер-младший, Т. М. Брэдли, К. Т. Уолш и Б. Демпл. 1995. Двуядерные кластеры [2Fe-2S] в белке Escherichia coli SoxR и роль металлоцентров в транскрипции.Дж. Биол. хим. 270 : 20908-20914. [PubMed] [Google Scholar] 29. Идальго, Э. и Б. Демпл. 1994. Железо-серный центр, необходимый для активации транскрипции окислительно-восстановительным белком SoxR. EMBO J. 13 : 138-146. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]30. Ху, Х., К. Чжан и К. Очи. 2002. Активация биосинтеза антибиотика с помощью определенных мутаций в гене rpoB (кодирующем β-субъединицу РНК-полимеразы) штамма Streptomyces lividans .Дж. Бактериол. 184 : 3984-3991. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]31. Хуанг Дж., С. Ши, В. Молле, Б. Солберг, Д. Уивер, М. Дж. Бибб, Н. Каронутаисири, К. Дж. Лих, К. М. Као, М. Дж. Баттнер и С. Н. Коэн. 2005. Перекрестная регуляция различных путей биосинтеза антибиотиков Streptomyces coelicolor . Мол. микробиол. 58 : 1276-1287. [PubMed] [Google Scholar] 32. Huang, J., C.J. Lih, K.H. Pan и S.N. Cohen. 2001.Глобальный анализ экспрессии генов, отвечающих за фазу роста, и регуляции путей биосинтеза антибиотиков у Streptomyces coelicolor с использованием ДНК-микрочипов. Гены Дев. 15 : 3183-3192. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]33. Ичиносе, К., К. Сурти, Т. Тагучи, Ф. Мальпартида, К. И. Букер-Милберн, Г. Р. Стефенсон, Ю. Эбизука и Д. А. Хопвуд. 1999. Доказательство того, что генетический регион ACTVI Streptomyces coelicolor A3(2) участвует в формировании стереоспецифического кольца пирана в биосинтезе актинородина.биоорг. Мед. хим. лат. 9 : 395-400. [PubMed] [Google Scholar] 34. Джонсон, Д. А., П. Р. Август, К. Шеклтон, Х. В. Лю и Д. Х. Шерман. 1997. Микробная резистентность к митомицинам включает окислительно-восстановительный механизм. Варенье. хим. соц. 119 : 2576-2577. [Google Академия] 35. Кан, И. Х., Дж. С. Ким и Дж. К. Ли. 2007. Вирулентность Vibrio vulnificus зависит от клеточного уровня активности супероксиддисмутазы. Дж. Микробиол. Биотехнолог.17 : 1399-1402. [PubMed] [Google Scholar]

36. Кизер Т., М. Дж. Бибб, М. Дж. Баттнер, К. Ф. Чейтер и Д. А. Хопвуд. 2000. Практическая генетика Streptomyces. Фонд Джона Иннеса, Норвич, Англия.

37. Kim, J.S., M.H. Sung, D.H. Kho, and J.K. Lee. 2005. Индукция марганецсодержащей супероксиддисмутазы необходима для кислотоустойчивости у Vibrio vulnificus . Дж. Бактериол. 187 : 5984-5995. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]38. MacNeil, D.J., JL Occi, KM Gewain, T. MacNeil, PH Gibbons, C.L. Ruby и SL Danis. 1992. Сложная организация генов Streptomyces avermitilis , кодирующих поликетидсинтазу авермектина. Ген 115 : 119-125. [PubMed] [Google Scholar] 39. Маддула, В. С., З. Чжан, Э. А. Пирсон и Л. С. Пирсон. 2006. Чувство кворума и феназины участвуют в формировании биопленки штаммом Pseudomonas chlororaphis ( aureofaciens ) 30-84.микроб. Экол. 52 : 289-301. [PubMed] [Google Scholar]41. Окамото С., Т. Тагучи, К. Очи и К. Ичиносе. 2009. Биосинтез актинородина и родственных антибиотиков: открытие альтернативных путей образования хинона, закодированного в кластере генов акта. хим. биол. 16 : 226-236. [PubMed] [Google Scholar]42. Орм-Джонсон, У. Х. и Н. Р. Орм-Джонсон. 1982. Железо-серные белки, с. 67-96. В Т. Г. Спиро (ред.), Ферменты, том. 13.John Wiley and Sons, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк. [Google Академия]43. Пальма, М., Дж. Зурита, Дж. А. Феррерас, С. Воргалл, Д. Х. Лароне, Л. Ши, Ф. Кампань и Л. Е. Н. Квадри. 2005. Pseudomonas aeruginosa SoxR не соответствует архетипической парадигме SoxR-зависимой регуляции адаптивной реакции бактериального окислительного стресса. Заразить. Иммун. 73 : 2958-2966. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]44. Парк, В., С. Пена-Ллопис, Ю. Ли и Б. Демпл. 2006.Регуляция супероксидного стресса у Pseudomonas putida KT2440 отличается от парадигмы SoxR у Escherichia coli . Биохим. Биофиз. Рез. коммун. 341 : 51-56. [PubMed] [Google Scholar]45. Помпозиелло, П.Дж. и Б. Демпл. 2001. Окислительно-восстановительные генетические переключатели: транскрипционные факторы SoxR и OxyR. Тенденции биотехнологии. 19 : 109-114. [PubMed] [Google Scholar]46. Помпосиелло, П. Дж., М. Х. Бенник и Б. Демпл. 2001.Полногеномный транскрипционный профиль ответов Escherichia coli на супероксидный стресс и салицилат натрия. Дж. Бактериол. 183 : 3890-3902. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]47. Прайс-Уилан, А., Л.Е.П. Дитрих и Д.К. Ньюман. 2007. Переосмысление «вторичного» метаболизма: физиологическая роль феназиновых антибиотиков. Нац. хим. биол. 2 : 71-77. [PubMed] [Google Scholar]48. Розен С. и Х. Скалецкий. 2000. Primer3 в Интернете для обычных пользователей и программистов-биологов.Методы Мол. биол. 132 : 365-386. [PubMed] [Google Scholar]

49. Sambrook, J., EF Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Молекулярное клонирование: лабораторное руководство. Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор, Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк.

50. Скиара Г., С. Г. Кендрю, А. Э. Миле, Н. Г. Марш, Л. Федеричи, Ф. Малатеста, Г. Шимперна, К. Савино и Б. Валлоне. 2003. Структура ActVA-Orf6, нового типа монооксигеназы, участвующей в биосинтезе актинородина. ЭМБО Дж.22 : 205-215. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]51. Шелдон, П. Дж., Ю. Мао, М. Хе и Д. Х. Шерман. 1999. Устойчивость к митомицину у штамма Streptomyces lavendulae включает новую систему экспорта, зависящую от белка, связывающего лекарственное средство. Дж. Бактериол. 181 : 2507-2512. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]52. Шелдон, П.Дж., Д.А. Джонсон, П.Р. Август, Х.В. Лю и Д.Х. Шерман. 1997. Характеристика митомицинсвязывающего механизма лекарственной устойчивости организма-продуцента, Streptomyces lavendulae .Дж. Бактериол. 179 : 1796-1804. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]53. Тахлан, К., С.К. Ан, А. Синг, Т.Д. Боднарук, А.Р. Виллемс, А.Р. Дэвидсон и Дж.Р. Нодвелл. 2007. Начало экспорта актинородина у Streptomyces coelicolor . Мол. микробиол. 63 : 951-961. [PubMed] [Google Scholar]54. Vining, L.C. 1992. Роль вторичных метаболитов микробов. Циба найдена. Симп. 171 : 184-194. [PubMed] [Google Scholar]55. Вестрих, Л., С. Доманн, Б. Фауст, Д. Бедфорд, Д. А. Хопвуд и А. Бехтольд. 1999. Клонирование и характеристика кластера генов из Streptomyces cyanogenus S136, вероятно, участвующих в биосинтезе ландомицина. ФЭМС микробиол. лат. 170 : 381-387. [PubMed] [Google Scholar]

Отслеживание филогенетической истории регулона Crl через геномы бактерий и архей | BMC Genomics

  • Перес-Руэда Э., Тенорио-Сальгадо С., Уэрта-Сакеро А., Бальдерас-Мартинес И.И., Морено-Хагельсиб Г.Функциональный ландшафт, связанный с факторами транскрипции Escherichia coli K-12. Компьютер Биол Хим. 2015;58:93–103.

    КАС Статья Google ученый

  • Ландини П., Эгли Т., Вольф Дж., Лакур С. sigmaS, основной игрок в реакции Escherichia coli на стрессы окружающей среды: роль, регуляция и механизмы распознавания промотора. Environ Microbiol Rep. 2014;6(1):1–13.

    КАС Статья Google ученый

  • Гама-Кастро С., Сальгадо Х., Сантос-Завалета А., Ледесма-Техейда Д., Мунис-Раскадо Л., Гарсия-Сотело Х.С., Алькисира-Эрнандес К., Мартинес-Флорес И., Паннье Л., Кастро-Мондрагон Х.А., и другие.RegulonDB версии 9.0: высокоуровневая интеграция регуляции генов, коэкспрессии, кластеризации мотивов и не только. Нуклеиновые Кислоты Res. 2016;44(Д1):Д133–43.

    КАС Статья Google ученый

  • Дюфур Ю.С., Кили П.Дж., Донохью Т.Дж. Реконструкция основных и расширенных регулонов глобальных факторов транскрипции. Генетика PLoS. 2010;6(7):e1001027.

    Артикул Google ученый

  • Лосада-Чавес I, Janga SC, Collado-Vides J.Бактериальные регуляторные сети чрезвычайно гибки в эволюции. Нуклеиновые Кислоты Res. 2006;34(12):3434–45.

    КАС Статья Google ученый

  • Monsieurs P, De Keersmaecker S, Navarre WW, Bader MW, De Smet F, McClelland M, Fang FC, De Moor B, Vanderleyden J, Marchal K. Сравнение регулона PhoPQ в Escherichia coli и Salmonella typhimurium. Дж Мол Эвол. 2005;60(4):462–74.

    КАС Статья Google ученый

  • Лю Р., Очман Х.Происхождение жгутиковых генных оперонов и вторичных жгутиковых систем. J Бактериол. 2007;189(19):7098–104.

    КАС Статья Google ученый

  • Bougdour A, Lelong C, Geiselmann J. Crl, индуцированный низкой температурой белок Escherichia coli, который напрямую связывается с сигма-субъединицей стационарной фазы РНК-полимеразы. Дж. Биол. Хим. 2004;279(19):19540–50.

    КАС Статья Google ученый

  • Арнквист А., Олсен А., Пфайфер Дж., Рассел Д.Г., Нормарк С.Белок Crl активирует криптические гены образования завитков и связывания фибронектина в Escherichia coli HB101. Мол микробиол. 1992;6(17):2443–52.

    КАС Статья Google ученый

  • Typas A, Barembruch C, Possling A, Hengge R. Реорганизация стационарной фазы механизма транскрипции Escherichia coli с помощью белка Crl, тонкой настройки активности и уровней сигм. EMBO J. 2007; 26 (6): 1569–78.

    КАС Статья Google ученый

  • Лелонг К., Агилуз К., Луче С., Кун Л., Гарин Дж., Рабийоуд Т., Гейзельманн Дж.Регулон Crl-RpoS кишечной палочки. Мол клеточная протеомика. 2007;6(4):648–59.

    КАС Статья Google ученый

  • Лелонг К., Роллан М., Луваги М., Гарин Дж., Гейзельманн Дж. Взаимная регуляция Crl и Fur в Escherichia coli W3110. Мол клеточная протеомика. 2007;6(4):660–8.

    КАС Статья Google ученый

  • Дудин О., Лакур С., Гейзельманн Дж. Динамика экспрессии RpoS/Crl-зависимых генов в Escherichia coli.Рез микробиол. 2013;164(8):838–47.

    КАС Статья Google ученый

  • Олсен А., Арнквист А., Хаммар М., Сукуполви С., Нормарк С. Сигма-фактор RpoS ослабляет H-NS-опосредованную репрессию транскрипции csgA, гена субъединицы фибронектин-связывающих завитков в Escherichia coli. Мол микробиол. 1993;7(4):523–36.

    КАС Статья Google ученый

  • Пратт Л.А., Силхави Т.Дж.Регулятор ответа SprE контролирует стабильность RpoS. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996;93(6):2488–92.

    КАС Статья Google ученый

  • Schnetz K. Для подавления действия оперона bgl Escherichia coli с помощью RpoS требуется Crl. Микробиология (Рединг, Англия). 2002; 148 (часть 8): 2573–8.

    КАС Статья Google ученый

  • Huerta AM, Collado-Vides J. Промоторы Sigma70 в Escherichia coli: специфическая транскрипция в плотных областях перекрывающихся промотоподобных сигналов.Дж Мол Биол. 2003;333(2):261–78.

    КАС Статья Google ученый

  • Саважо Массачусетс. Теория спроса на регуляцию генов. I. Количественное развитие теории. Генетика. 1998;149(4):1665–76.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Monteil V, Kolb A, D’Alayer J, Beguin P, Norel F. Идентификация консервативных аминокислотных остатков шаперона Salmonella sigmaS Crl, участвующих во взаимодействиях Crl-sigmaS.J Бактериол. 2010;192(4):1075–87.

    КАС Статья Google ученый

  • Дандекар Т., Шустер С., Снел Б., Хюйнен М., Борк П. Выравнивание путей: приложение к сравнительному анализу гликолитических ферментов. Biochem J. 1999; 343 (Pt 1): 115–24.

    КАС Статья Google ученый

  • Чен Г., Паттен К.Л., Шеллхорн Х.Е. Положительный отбор на потерю функции RpoS у Escherichia coli.Мутат рез. 2004; 554(1–2):193–203.

    КАС Статья Google ученый

  • Донг Т., Шеллхорн Х.Э. Контроль RpoS в глобальной экспрессии генов Escherichia coli в минимальных средах. Мол Ген Геномикс. 2009;281(1):19–33.

    КАС Статья Google ученый

  • Zambrano MM, Siegele DA, Almiron M, Tormo A, Kolter R. Конкуренция микробов: мутанты Escherichia coli, которые захватывают культуры в стационарной фазе.Наука. 1993; 259 (5102): 1757–60.

    КАС Статья Google ученый

  • Cavaliere P, Norel F. Недавние достижения в характеристике Crl, нетрадиционного активатора сигма-фактора стресса sigmaS/RpoS. Концепции Биомола. 2016;7(3):197–204.

    КАС пабмед Google ученый

  • Гир Л.И., Марчлер-Бауэр А., Гир Р.К., Хан Л., Хе Дж., Хе С., Лю С., Ши В., Брайант С.Х.База данных NCBI BioSystems. Нуклеиновые Кислоты Res. 2010; 38 (выпуск базы данных): D492–6.

    КАС Статья Google ученый

  • Кеселер И.М., Маки А., Сантос-Завалета А., Биллингтон Р., Бонавидес-Мартинес С., Каспи Р., Фулчер С., Гама-Кастро С., Котари А., Крумменакер М. и др. База данных EcoCyc: отражение новых знаний о Escherichia coli K-12. Нуклеиновые Кислоты Res. 2017;45(Д1):Д543–50.

    КАС Статья Google ученый

  • Шеннон П., Маркиэль А., Озьер О., Балига Н.С., Ван Дж.Т., Рэймидж Д., Амин Н., Швиковски Б., Идекер Т.Cytoscape: программная среда для интегрированных моделей сетей биомолекулярного взаимодействия. Геном Res. 2003;13(11):2498–504.

    КАС Статья Google ученый

  • Serres MH, Riley M. MultiFun, схема многофункциональной классификации продуктов гена Escherichia coli K-12. Микроб Комп Геномика. 2000;5(4):205–22.

    КАС Статья Google ученый

  • Эшбернер М., Болл К.А., Блейк Дж.А., Ботштейн Д., Батлер Х., Черри Дж.М., Дэвис А.П., Долински К., Дуайт С.С., Эппиг Дж.Т. и др.Генная онтология: инструмент для объединения биологии. Консорциум генных онтологий. Нат Жене. 2000;25(1):25–9.

    КАС Статья Google ученый

  • Thomas PD, Campbell MJ, Kejariwal A, Mi H, Karlak B, Daverman R, Diemer K, Muruganujan A, Narechania A. PANTHER: библиотека белковых семейств и подсемейств, индексированных по функциям. Геном Res. 2003;13(9):2129–41.

    КАС Статья Google ученый

  • Канехиса М., Фурумичи М., Танабэ М., Сато Ю., Морисима К.KEGG: новые взгляды на геномы, пути, болезни и лекарства. Нуклеиновые Кислоты Res. 2017;45(Д1):Д353–61.

    КАС Статья Google ученый

  • Альтшул С.Ф., Мэдден Т.Л., Шаффер А.А., Чжан Дж., Чжан З., Миллер В., Липман Д.Дж. Gapped BLAST и PSI-BLAST: новое поколение программ поиска белковых баз данных. Нуклеиновые Кислоты Res. 1997;25(17):3389–402.

    КАС Статья Google ученый

  • Эдгар РЦ.MUSCLE: множественное выравнивание последовательностей с высокой точностью и высокой пропускной способностью. Нуклеиновые Кислоты Res. 2004;32(5):1792–7.

    КАС Статья Google ученый

  • Тамура К., Стечер Г., Петерсон Д., Филипски А., Кумар С. MEGA6: молекулярно-эволюционный генетический анализ, версия 6.0. Мол Биол Эвол. 2013;30(12):2725–9.

    КАС Статья Google ученый

  • Fitch WM.Отличие гомологичных белков от аналогичных. Сист Зоол. 1970;19(2):99–113.

    КАС Статья Google ученый

  • Морено-Хагельсиб Г., Латимер К. Выбор параметров BLAST для лучшего обнаружения ортологов как взаимных лучших результатов. Биоинформатика. 2008;24(3):319–24.

    КАС Статья Google ученый

  • Хафт Д.Х., ДиКуччио М., Бадретдин А., Бровер В., Четвернин В., О’Нил К., Ли В., Читцаз Ф., Дербишир М.К., Гонсалес Н.Р. и др.RefSeq: обновленная информация об аннотации и курировании генома прокариот. Нуклеиновые Кислоты Res. 2018;46(D1):D851–60.

    КАС Статья Google ученый

  • Морено-Хагельсиб Г., Ван З., Уолш С., Эль-Шербини А. Филогеномная кластеризация для выбора неповторяющихся геномов для сравнительной геномики. Биоинформатика. 2013;29(7):947–9.

    КАС Статья Google ученый

  • Саид А.И., Бхагабати Н.К., Брайстед Дж.К., Лян В., Шаров В., Хоу Э.А., Ли Дж., Тиагараджан М., Уайт Дж.А., Квакенбуш Дж.Программный пакет для микрочипов TM4. Методы Энзимол. 2006; 411:134–93.

    КАС Статья Google ученый

  • Weber H, Polen T, Heuveling J, Wendisch VF, Hengge R. Полногеномный анализ общей сети реакции на стресс у Escherichia coli: sigmaS-зависимые гены, промоторы и селективность сигма-фактора. J Бактериол. 2005;187(5):1591–603.

    КАС Статья Google ученый

  • Пратт Л.А., Силхави Т.Дж.Crl стимулирует активность RpoS во время стационарной фазы. Мол микробиол. 1998;29(5):1225–36.

    КАС Статья Google ученый

  • Hao Y, Updegrove TB, Livingston NN, Storz G. Защита от вредных соединений азота: роль сигма-зависимых малых РНК, кодируемых рядом с sdiA. Нуклеиновые Кислоты Res. 2016;44(14):6935–48.

    КАС Статья Google ученый

  • Границы | Идентификация, функциональная характеристика и предсказание регулона регулятора поглощения цинка (zur) Bacillus anthracis — понимание гомеостаза цинка патогена

    Введение

    Цинк считается вторым по распространенности переходным элементом в живых системах после железа.Спектр функций, которые он выполняет, в том числе каталитических, структурных и регуляторных, как у бактерий, так и у высших организмов, подчеркивает его значение. Примерно 5–6% бактериальных белков проявляют зависимость от цинка (Hantke, 2005; Андрейни и др., 2006; Рахман и Карим, 2018). Металл действует как электрофил или кислота Льюиса в большинстве гидролитических реакций, тем самым катализируя их, а также включается в состав различных металлоферментов, запасных белков и факторов транскрипции (Falchuk, 1993; Coleman, 1998; Auld, 2001; Outten and O’halloran, 2001; Cerasi et al., 2013). Кроме того, он может действовать как антиоксидант, защищая сульфгидрильные группы белков от атаки свободных радикалов, и как комбатант, предотвращающий образование свободных радикалов, тем самым сохраняя структурную стабильность и функциональность некоторых белков (Bray and Bettger). , 1990). Однако цинк может быть токсичным для клеток в концентрации, превышающей норму, либо путем блокирования тиолов белков, либо путем конкурентного мисметаллирования с сайтами связывания других ионов металлов в них, что, следовательно, препятствует различным физиологическим процессам (Beard et al., 1995; Миллс и др., 2002; Имлей, 2014 г.; Чандрангсу и др., 2017).

    При инвазии патогена одной из внутренних защитных стратегий, которую запускает хозяин, является пищевой иммунитет, при котором хозяин либо воздерживается, либо отравляет патоген основными переходными элементами; цинк является одним из них, что снижает его выживаемость. Таким образом, для успешного заражения и репликации патоген должен адаптироваться к условиям гипо- или гиперцинкемии внутри хозяина (Cassat and Skaar, 2012; Hood and Skaar, 2012; Vignesh and Deepe, 2016).Кроме того, существует множество цинкзависимых факторов вирулентности, которые способствуют выживанию и патогенезу бактерий. В целом гены, участвующие в гомеостазе металлов у патогенных бактерий, проявляются как детерминанты вирулентности (Botella et al., 2011; Cheryl-lynn et al., 2015; Djoko et al., 2015).

    Из-за вышеупомянутой решающей роли, которую цинк играет в бактериях, поддержание внеклеточного и внутриклеточного гомеостаза цинка является обязательным во все времена.Для этого бактерии, а именно патогены, разработали сложные стратегии, такие как регуляция на уровне транскрипции, вызванная регуляторами чувствительности к металлам, очищение от цинка и получение из окружающей среды, а также увеличение экспрессии белков, не требующих цинка, тем самым распределяя цинк по цинкзависимые белки (Hantke, 2001, 2005; Rudolph et al., 2006; Fillat, 2014).

    Bacillus anthracis , грамположительная спорообразующая бактерия, является возбудителем сибирской язвы со смертельным исходом.По сути, это зоонозное заболевание; однако люди иногда заражаются инфекцией в непосредственной близости от инфицированных животных или зараженных продуктов животного происхождения (Mock and Fouet, 2001). Тот факт, что споры этого патогена могут оставаться жизнеспособными в течение десятилетий и могут быть легко превращены в оружие и распространяться в виде аэрозолей, увеличивает его потенциал для использования в качестве агента биологического террора или биологической войны. То же самое было продемонстрировано атакой спор через почтовую службу США в 2001 году (Hudson et al., 2008). Ключевые детерминанты вирулентности патогена кодируются плазмидой, включающей капсулу поли-γ-d-глутаминовой кислоты, и тройным токсином, состоящим из трех структурных компонентов, а именно защитного антигена (PA), летального фактора (LF) и фактора отека ( ЭФ). Бинарное сочетание ПА с ЛФ и ЭФ приводит к образованию летального (ЛТ) и отечного токсинов (ЭТ) соответственно. Поскольку LF представляет собой Zn +2 -зависимую металлопротеазу, в дополнение к физиологически важным ролям, которые играет цинк, он также необходим для активности LT B.anthracis (Klimpel et al., 1994; Duesbery et al., 1998; Bradley et al., 2001; Mock and Fouet, 2001; Scobie et al., 2003; Guichard et al., 2012). Таким образом, поддержание гомеостаза цинка становится еще более важным для патогена. Однако гомеостаз цинка в B. anthracis остается в значительной степени неизученным и, таким образом, требует тщательного изучения.

    Регулятор поглощения цинка (Zur) принадлежит к суперсемейству FUR, состоящему из регуляторов транскрипции, чувствительных к металлам, которые вызывают гомеостаз переходных металлов в бактериях за счет соответствующих изменений в экспрессии их генов.Члены этого суперсемейства широко распространены среди прокариот и, помимо Zur, включают Fur (регулятор поглощения железа) (Escolar et al., 1999; Hantke, 2002), Mur (регулятор поглощения марганца) (Diaz-Mireles et al., 2004; Platero et al., 2007), белки Nur (регулятор поглощения никеля) (Ahn et al., 2006) и Per (регулятор пероксида) (Verneuil et al., 2005; Lee and Helmann, 2006) (Fillat, 2014). ). Zur, чрезвычайно важный белок в гомеостазе цинка, был впервые обнаружен в Escherichia coli (Patzer and Hantke, 1998) и в настоящее время широко изучен в различных организмах, включая Bacillus subtilis (Gabella and Helmann, 1998; Prestel et al. др., 2015; Shin and Helmann, 2016), Streptococcus sp. (Feng et al., 2008), Listeria monocytogenes (Dalet et al., 1999), Staphylococcus aureus (Lindsay and Foster, 2001), Salmonella enterica (Lindsay and Foster, 2001). Campoy et al., 2002), Yersinia pestis (Li et al., 2009), Streptomyces coelicolor (Shin et al., 2007), Enterococcus faecalis (Latorris et al., 2015), Xanthomonas (Tang et al., 2005) , Mycobacterium tuberculosis (Maciąg et al., 2007) и Pseudomonas aeruginosa (Ellison et al., 2013). У бактерий Zur управляет колебаниями внутриклеточного и внеклеточного уровня цинка с соответствующими изменениями в транскриптоме, регулируя экспрессию генов, участвующих в гомеостазе цинка. При достаточном количестве цинка Zur существует в связанной с цинком форме, способной связываться с ДНК и поддерживать гены, участвующие в поглощении и мобилизации цинка, в подавленном состоянии. Однако эта опосредованная Zur репрессия высвобождается, когда клетка сталкивается с состоянием истощения цинка, тем самым инициируя поглощение и мобилизацию цинка (Patzer and Hantke, 1998).Чаще всего регулон Zur состоит из генов, которые кодируют низко- и высокоаффинные переносчики цинка, шаперонные белки, паралоги рибосомных белков, не связывающие цинк, и другие белки, участвующие в гомеостазе цинка (Fillat, 2014). Кроме того, было документально подтверждено, что Zur играет роль в патогенезе S. enterica (Campoy et al., 2002), X. campestris (Tang et al., 2005; Yang et al., 2007) и L. monocytogenes (Dowd et al., 2012).

    Настоящее исследование направлено на идентификацию и функциональную характеристику регулятора поглощения цинка B . anthracis , транскрипционный фактор, необходимый для поддержания гомеостаза цинка. Из трех белков семейства Fur, сосуществующих в B. anthracis , локус BAS4181 был аннотирован как ba zur с высокой точностью с использованием всестороннего анализа последовательности in silico с последующим гомологическим моделированием. Мы сообщаем о геномной организации оперона и биохимических свойствах белка BaZur, включая его склонность к димеризации и способность связываться с ДНК.Большинство генов регулона были вовлечены в поглощение, мобилизацию цинка и в качестве шаперонов металлов и отрицательно регулировались BaZur. Транскрипционная регуляция ba zur была установлена ​​на разных фазах роста B. anthracis в условиях избытка цинка и опосредованной TPEN депривации цинка. Кроме того, уровни транскриптов генов регулона также анализировали в условиях отсутствия цинка.

    Материалы и методы

    Бактериальный штамм, плазмида и условия культивирования

    Штаммы

    Escherichia coli DH5α и BL21 (λDE3) использовали в качестве хозяев для клонирования и экспрессии соответственно.Штаммы выращивали в среде Луриа-Бертани (LB), дополненной антибиотиками, ампициллином (100 мкг/мл) и канамицином (50 мкг/мл) по мере необходимости. В этом исследовании использовали авирулентный штамм B. anthracis Sterne 34F2 (pXO1 + pXO2 ) и культивировали в инфузии мозга и сердца (BHI), LB или минимальной среде (M9) в соответствии с требованиями эксперимента. . Для выяснения ростоспецифических различий в экспрессии ba zur методом qRT-PCR клетки B. anthracis выращивали в среде BHI при 37°C до температуры 0.D. 600 нм ~0,3, 0,6, 0,9 и 1,2, что соответствует ранней экспоненциальной, среднеэкспоненциальной, позднеэкспоненциальной и началу стационарной фазы, соответственно, и собраны. Для выращивания клеток B. anthracis в условиях избытка цинка вторичную культуру помещали в 100 мл LB-колбу с бульоном, используя первичную культуру, выращенную O/N, с последующей инкубацией при 37°C до ранней экспоненциальной фазы ( OD 600 нм ~0,3). В этот момент культуру разделяли таким образом, что одна часть представляла собой контроль (без экзогенного цинка), а к другим частям добавляли избыток цинка в виде градиента ZnCl 2 от 250 мкМ до 2 мМ.Все образцы были собраны, когда O.D. 600 нм контроля, т. е. клетки, выращенные без экзогенного цинка, достигали 0,6 (примерно через 45–60 мин после деления и добавления цинка). Далее, для создания условий, лишенных цинка, вторичную культуру клеток B. anthracis после достижения ранней экспоненциальной фазы (OD 600 нм ∼0,3) разделяли на контроль (без TPEN), а к другой части добавляли 50 мкМ TPEN (MP Biomedicals). Затем образцы собирали через 40 минут после добавления TPEN.

    Анализ последовательности и структуры BaZur

    BAS4181, аннотированный как специфичный для цинка регулятор транскрипции, был идентифицирован в геноме B. anthracis с использованием баз данных NCBI и KEGG (Kanehisa et al., 2017). Оперонная организация BAS4181 ( ba zur ) была предсказана с использованием баз данных DOOR (Mao et al., 2013) и ProOpDB (Taboada et al., 2011). Доменную архитектуру белка определяли с помощью CDD (NCBI) (Marchler-Bauer et al., 2014) и SMART (Letunic et al., 2014) базы данных. Затем локус ba zur сравнивали с локусом других бактерий. Консервативные остатки в BaZur были очерчены путем идентификации гомологов белка у других видов с помощью BLASTP с последующим их выравниванием с использованием сервера множественного выравнивания ClustalW (McWilliam et al., 2013).

    Подходящая матрица для моделирования гомологии BaZur была идентифицирована поиском BLASTP в PDB с использованием BaZur из 137 аминокислот (идентификатор белка NCBI: YP_030430) в качестве последовательности запроса.Трехмерная структура была смоделирована с использованием сервера I-TASSER (Yang and Zhang, 2015) с доступной кристаллической структурой Zur из S. coelicolor (ScoZur) (идентификатор PDB: 3MWM) в качестве шаблона (Shin et al. , 2011). Два сайта связывания цинка, важные для активности, также были смоделированы с помощью I-TASSER и аннотированы на основе сходства с BsuZur (Ma et al., 2011). Чтобы получить наилучшие расстояния для цинка и его координационных остатков, была проведена ограниченная минимизация модели с использованием типов атомов AMBER 7 FF02 и силового поля (Case et al., 2002). Атомам цинка был присвоен заряд +2 в версии SYBYL7.1 (Tripos, Inc., Сент-Луис, Миссури, США).

    ДНК-связывающие белки, содержащие мотив HTH, обычно связываются с ДНК, встраивая свою распознающую спираль в большую бороздку консенсусной последовательности. Существует близкое структурное сходство между несколькими комплексами HTH-ДНК, на что указывает низкое среднеквадратичное отклонение (RMSD <3,5 Å) суперпозиции (AlQuraishi et al., 2015). Это стало нашей основой для моделирования комплекса BaZur-ДНК.ДНК была смоделирована на основе кристаллической структуры комплекса IdeR-ДНК M. tuberculosis , поскольку IdeR состоит из мотива спираль-поворот-спираль (HTH), как и BaZur, а ДНК-связывающая последовательность IdeR состоит из мотив 9-1-9 (Wisedchaisri et al., 2004), такой же, как у BaZur. Мотив узнавания двухцепочечной ДНК из девяти пар оснований из 1U8R (RCSB PDB ID IdeR) был мутирован в мотив BaZur с использованием опции биополимерного мутирования, доступной в SYBYL. 7.1 (Трипос, Инк., Сент-Луис, Миссури, США). Исходная модель комплекса с BaZur была получена путем наложения спирали узнавания из 13 остатков BaZur (F53-E65) на спираль IdeR (G38-R50). Это использовали для получения оснований ДНК большой бороздки, контактирующих со спиралью распознавания BaZur, как A3, G4, C5, A6, G9 и C29, C30, C31. Экспертный интерфейс веб-сервера HADDOCK2.2 (Van Zundert et al., 2016) использовался для стыковки белок-ДНК, чтобы определить контактирующие остатки как активные остатки, а окружающие остатки как пассивные остатки как для BaZur, так и для ДНК. .Боковые цепи остатков спирали узнавания считали гибкими. В качестве модели комплекса BaZur–ДНК была взята первая и лучшая структура из самого крупного и высокорангового кластера.

    ПЦР с обратной транскрипцией

    Предсказанная оперонная организация in silico ba zur была подтверждена in vitro путем обнаружения полицистронных транскриптов с использованием ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Для этого клеток B. anthracis выращивали до экспоненциальной фазы (О.D. 600 нм ∼ 0,6) с последующей экстракцией тотальной РНК с использованием реагента TRI (Sigma-Aldrich, США). Загрязнение геномной ДНК, если оно имело место, удаляли, подвергая тотальную РНК обработке ДНКазой I (набор ДНКазы без РНКазы, QIAGEN) и подтверждая то же самое с помощью ПЦР с использованием b zur оперон-специфических праймеров (таблица 1). Затем тотальную РНК использовали в качестве матрицы для синтеза кДНК с помощью набора для обратной транскрипции кДНК высокой емкости (Life Technologies). Реакцию ОТ-ПЦР проводили с использованием пула кДНК в качестве матрицы (25 нг) с 15 пмоль указанных праймеров (таблица 1) в 25 мкл реакционной смеси.Продукты реакции анализировали электрофорезом на 1% агарозном геле с последующей визуализацией с окрашиванием бромистым этидием.

    Таблица 1. Праймеры, использованные в исследовании.

    Экспрессия и очистка BaZur

    ОРС, соответствующую ba zur , амплифицировали с использованием геномной ДНК B. anthracis и геноспецифических праймеров (табл. 1) и клонировали в вектор экспрессии pET28a+ (Novagen, США) с С-концевой 6X-His-меткой .Клетки E. coli BL21 (λDE3), несущие конструкцию pET28a- zur , выращивали до ранней логарифмической фазы (OD 600 нм ~ 0,4), индуцировали 1 мМ IPTG при 37°C и собирали через 4 ч после индукция. Затем клетки повторно суспендировали в буфере А (50 мМ Tris HCl [pH 8,0], 150 мМ NaCl, 5% глицерина), содержащем 1 мМ бензамидина, и лизировали ультразвуком на Sonics Vibra Cell TM Digital Sonicator. BaZur очищали от растворимой фракции с помощью аффинной хроматографии Ni +2 -NTA, как описано QIAGEN.Рекомбинантный BaZur элюировали буфером А, содержащим 300 мМ имидазол, в виде фракций по 500 мкл. Фракции ( > гомогенность 95%), содержащие рекомбинантный белок, объединяли и подвергали диализу в буфере А. продукты, расщепленные трипсином. Поликлональные сыворотки против BaZur получали у мышей Swiss-albino, и конечный титр определяли с помощью ELISA. Все эксперименты на мышах проводились в соответствии с рекомендациями и с одобрения Институционального комитета по этике животных Университета Джавахарлала Неру (JNU-IAEC).

    Затем с помощью SEC была установлена ​​димерная природа BaZur. Вкратце, диализованные буфером А фракции BaZur концентрировали на центрифужных устройствах Macrosep advance с MWCO 3 K (Pall Life Sciences) до конечной концентрации 10 мг/мл -1 и наносили на колонку Superdex-75 pg (16/600 HR). ; Amersham Pharmacia Biotech), предварительно уравновешенной буфером А с использованием автоматизированной системы AKTA FPLC (Amersham Pharmacia Biotech). Скорость потока поддерживали на уровне 0,5 мл/мин -1, а длину волны детектирования устанавливали на 280 нм.Стандартные кривые были получены с использованием маркерного набора для гель-фильтрации (Sigma-Aldrich) в тех же буферах и условиях, что и в экспериментальном образце. Вкратце, для стандартного опыта использовали смесь, содержащую по 3 мг альбумина (молекулярная масса 66000 Да), карбоангидразы (молекулярная масса 29000 Да) и цитохрома С (молекулярная масса 12000 Да) в 1 мл буфера А. Пики, полученные на микрофотографиях SEC, объединяли и анализировали на основе белка Rt. Молекулярную массу белковых фракций, полученных из SEC, экстраполировали с использованием соответствующих стандартов с помощью Blue Native-PAGE (BN-PAGE) и SDS-PAGE.

    Для BN-PAGE белковые фракции, полученные из SEC, смешивали с буфером для загрузки образца (100 мМ Tris-HCl [pH 8,0], 50% глицерина и 0,5% CBB G-250) и инкубировали при 4°C в течение 30 мин. Затем смесь наносили на предварительно отлитый 15% полиакриламидный градиентный гель, содержащий 200 мМ Tris-HCl [pH 8,8] и 10% глицерина. Для проведения электрофореза в качестве катодного и анодного буферов использовали 100 мМ гистидина, содержащего 0,002% CBB G-250 (pH доведен до 8,0 с использованием трис-основания) и 100 мМ Tris-HCl [pH 8,8], соответственно, в качестве катодного и анодного буферов.BSA, овальбумин (OVA) и ингибитор трипсина сои (STI) использовали в качестве нативных стандартов для PAGE. Гели запускали при 4°С и 25 В/см с добавлением свежего катодного буфера без CBB G-250 после половины цикла. Полосы визуализировали окрашиванием кумасси бриллиантовым синим (CBB).

    ПЦР в реальном времени (qRT-PCR)

    Специфические для фазы роста различия в экспрессии ba zur , профиле транскрипции ba zur и трех генов регулона, а именно rpmG , znuA и yciC в условиях избытка цинка и Депривация цинка, вызванная TPEN, была установлена ​​с помощью qRT-PCR.Тотальную РНК выделяли из каждого образца и подвергали обработке ДНКазой, как описано выше. Для qRT-PCR реакционную смесь помещали в общий объем 10 мкл, содержащий 5 мкл 2X SYBR green master mix (Life Technologies), 1 мкл разведенной 1/10 кДНК (≈5 нг) и 30 нМ геноспецифических праймеры (таблица 1), разработанные с использованием программного обеспечения Primer Express версии 2.0 (Applied Biosystems). ПЦР проводили на ABI 7500 по следующей программе: 50°С в течение 2 мин, 95°С в течение 10 мин и 40 циклов: 95°С в течение 15 с и 60°С в течение 1 мин.Кривые термической диссоциации анализировали для обнаружения любой неспецифической амплификации. Поскольку ДНК-гираза демонстрирует конститутивную экспрессию во всех тестируемых условиях, ее использовали в качестве эндогенного контроля для нормализации данных. Контрольный образец служил калибратором. Кратность изменения (RQ) в экспрессии ba zur , rpmG , znuA и yciC рассчитывали методом 2 -ΔΔCt . Было выполнено пять экспериментальных повторов, и нанесенные на график данные представляют собой среднее значение относительного количественного определения, полученного из пяти запусков с SEM.

    In silico Регулон Prediction

    Гомология между BaZur и B. subtilis Zur (BsuZur) была определена с помощью BLASTP. Благодаря высокой идентичности и сходству между ними мы можем убедительно предположить, что они могут связываться с похожей последовательностью ДНК. Консенсусную последовательность ДНК-связывания 9-1-9, Zur-box, BsuZur использовали для анализа межгенных областей генома B. anthracis с использованием инструмента поиска паттернов ДНК, доступного по адресу: http://embnet.ccg.unam.mx/rsat/dna-pattern_form.cgi, допустив несоответствие 0/1 (Nguyen et al., 2018). Однако RSAT допускает максимум одно несоответствие, тем самым ограничивая поиск. Таким образом, чтобы сделать наш поиск еще более полным, анализ BLAST был использован для определения гомологов всех тех важных генов, которые были частью регулона BsuZur и Zur других грамположительных и грамотрицательных бактерий, но не были получены в нашем поиске RSAT. , с последующей ручной проверкой этих генов на наличие коробки Zur с более чем двумя несовпадениями.Ранее Габриэль и соавт. (2008) продемонстрировали, что симметричные мутации в любом положении от 2 до 9 приводят к снижению связывания Zur. Таким образом, ни при каких обстоятельствах мы не одобряли симметричные мутации в двух полуповторах. Функциональную аннотацию генов регулонов, при необходимости, выполняли путем картирования архитектуры их доменов с использованием поиска NCBI CDD (Marchler-Bauer et al., 2014) и UniProt (Consortium, 2016). Предсказание промоторов генов регулона было выполнено с использованием PromBase (Rangannan and Bansal, 2011) и Bprom Softberry.Затем, чтобы окончательно аннотировать BAS1889 как ZnuA, последовательность белка выравнивали с гомологами ZnuA из других бактерий с использованием сервера множественного выравнивания ClustalW (Thompson et al., 2003). Наличие трансмембранных спиралей, если таковые имеются, в регулоне-кандидате YciC устанавливали с помощью графика гидрофильности Хоппа и Вудса, доступного в редакторе выравнивания последовательностей BioEdit 7.2.1 (Hopp, 1989; Hall et al., 2011) и в программном обеспечении TMHMM ( Крог и др., 2001).

    Создание логотипа последовательности

    Логотип последовательности коробок Zur для B.anthracis был создан Clustal Omega (Sievers et al., 2011) путем множественного выравнивания согласованной связывающей последовательности шести членов предполагаемого регулона BaZur с последующим вводом этого выравнивания в качестве входных данных в программу WebLogo, доступную по адресу: https ://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi (Крукс и др., 2004 г.).

    Анализ изменения электрофоретической подвижности (EMSA)

    Для EMSA рекомбинантный BaZur диализовали против 20 мМ Tris HCl [pH 8,0], 50 мМ NaCl и 5% глицерина.EMSA выполняли, как описано ранее (Gopalani et al., 2016) с модификациями. Вкратце, зонды готовили путем амплификации вышерасположенной области соответствующих генов предсказанного регулона с использованием специфических праймеров (таблица 1) с последующей очисткой амплифицированных фрагментов, мечением их с помощью полинуклеотидкиназы Т4 и [- 32 P] АТФ ( 3500 Ки/ммоль) и удаление невключенных нуклеотидов; 1–1,5 пмоль каждого меченого зонда добавляли к белку в реакционном объеме 50 мкл буфера для связывания (10 мМ Tris HCl [pH 7.5], 60 мМ NaCl, 20 мМ ДТТ, 10% глицерин, 100 мкМ ZnCl 2 , 0,5 мкг поли (dI-dC)), затем инкубировали при 25°C в течение 20 мин. Специфичность взаимодействия BaZur-ДНК тестировали с помощью анализов специфической и неспецифической конкуренции. Вкратце, для всех конкурирующих экспериментов к буферу для связывания добавляли 50—200-кратный молярный избыток немеченой специфической или неспецифической ДНК (50Х, 100Х и 200Х) перед добавлением меченого радиоактивным изотопом зонда. ДНК NZB без Zur-бокса использовали в качестве отрицательного контроля.Свободные зонды и комплексы белок-ДНК (комплексы Zur-ДНК) разделяли на 6% Native-PAGE (соотношение акриламид:бисакриламид 29:1) при напряжении 150 В в 0,5X TBE при 4°C с последующим сушка гелей в вакууме при 70°C в течение 90–120 мин, визуализация и анализ радиоактивно меченых зондов и комплексов Zur-ДНК на фосфоримагере Typhoon FLA 9500.

    Результаты и обсуждение

    Основанная на биоинформатике идентификация гена

    zur B. anthracis и картирование остатков, важных для связывания цинка и ДНК

    BAS4181, аннотированный как специфичный для цинка регулятор транскрипции, был идентифицирован в B.anthracis Sterne по базам данных NCBI и KEGG (Kanehisa et al., 2017). Архитектура домена показывает, что он принадлежит к семейству белков Ferric-регулятора поглощения (Fur) с мотивом HTH на его N-конце, что указывает на то, что он является специфичным для последовательности фактором транскрипции, связывающим ДНК. B. anthracis содержит в своем геноме три гомолога Fur, а именно BAS4001 (Fur), BAS0505 (Per) и BAS4181 (Zur). Как показал анализ BLASTP, BAS4181 имеет сходство 45 и 52% с Fur и Per соответственно (дополнительная таблица S1).Это значительное сходство последовательностей между гомологами меха потребовало дополнительного биоинформатического анализа для подтверждения подлинности аннотации BAS4181 как Zur. Для этого мы сопоставили последовательность белка BAS4181 с прототипами Zur из других грамположительных и грамотрицательных бактерий. Множественное выравнивание последовательностей показало высокую консервативность последовательностей (среднее сходство 59%) между гомологами BAS4181 и Zur (рис. 1А). Последовательность белка BAS4181 демонстрировала минимальное сходство 44% и максимальное 80% с E.coli и белков B. subtilis Zur соответственно (дополнительная таблица S2).

    Рис. 1. Анализ последовательности и структуры. (A) Множественное выравнивание последовательностей. Zur из B. anthracis (BaZur) был сопоставлен с архетипами Zur из разных видов бактерий с помощью CLUSTALW. В то время как одинаковые остатки отмечены черным цветом, похожие — серым. ( ), (:) и (.) обозначают идентичные остатки, консервативные мутации и полуконсервативные мутации соответственно.Выровнены гомологи Zur из следующих организмов – mtb : Mycobacterium tuberculosis ; sco : Streptomyces coelicolor ; летучая мышь : Bacillus anthracis ; bsu : Bacillus subtilis ; ИМО : Listeria monocytogenes ; эфа : Enterococcus faecalis ; эко : Escherichia coli ; pae: синегнойная палочка; вид: Streptococcus pneumoniae . (B) Мультяшная визуализация гомологической модели мономера BaZur (зеленый), наложенная на шаблон Zur из S. coelicolor (ScoZur) (красный). Два иона Zn +2 , изображенные в виде серых шариков, связываются с каждым мономером BaZur. Остатки, составляющие сайт связывания цинка 1 (черный) и сайт 2 (фиолетовый), нанесены на карту на модели. (C) Парное выравнивание последовательностей BaZur с BsuZur. Две белковые последовательности были выровнены с помощью CLUSTALW, и критические остатки, содержащие сайты связывания цинка 1 (), 2 () и 3 (), обозначенные в BsuZur, были нанесены на карту BaZur.Остатки в красной рамке составляют мотив ДНК-связывания спираль-поворот-спираль. Все выравнивания были отформатированы с использованием программного обеспечения Bioedit, доступного по адресу: http://en.bio-soft.net/format/BioEdit.html.

    Ранее предполагалось, что сайты связывания цинка Zur отличаются от таковых белков Per и Fur (Traoré et al., 2006). Таким образом, несмотря на то, что BaZur демонстрирует значительное общее сходство последовательностей с Per и Fur, мы выбрали четвертый лучший результат, кристаллическую структуру Zur из S.coelicolor (ScoZur) (идентификатор PDB: 3MWM) (Shin et al., 2011), полученный в ходе поиска BLASTP в PDB в качестве шаблона для моделирования гомологии (Berman et al., 2003) (дополнительный рисунок S1). Два белка имели сходство и значение E 50% и 2 × 10 -10 соответственно. Модель BaZur, наложенная на шаблон со среднеквадратичным отклонением 0,76 Å по 101 атому Cα (рис. 1B). В более раннем исследовании Ma et al. (2011) смоделировали BsuZur, используя ScoZur в качестве шаблона, и определили сайты связывания цинка.Они продемонстрировали, что очищенный Zur связывается максимум с двумя ионами Zn +2 на мономер в сайтах 1 и 2. Было показано, что сайт 1, состоящий из Cys95, Cys98, Cys132 и Cys135, является структурно важным, и любая мутация в этом сайт привел к частичной или полной утрате репрессорной активности BsuZur. Сайт 2, состоящий из Glu70, Cys84, His90 и His92, был помечен как сенсорный сайт, и мутации в этом сайте вызывают значительное снижение аффинности связывания цинка (Ma et al., 2011). Поскольку BaZur демонстрирует общее сходство с BsuZur на 80%, мы можем экстраполировать и функционально аннотировать сайты связывания цинка в BaZur, сравнивая его с BsuZur. И сайт 1, и сайт 2, состоящие из Cys95, Cys98, Cys132, Cys135 и Glu70, Cys84, His90, His92, соответственно, также могут быть картированы на BaZur (рис. 1C). Также показаны расстояния от скоординированных остатков (рис. 1В).

    Затем, чтобы получить представление о взаимодействии BaZur-ДНК и очертить предполагаемые вовлеченные остатки, был смоделирован комплекс BaZur-ДНК со спиралью распознавания HTH, занимающей большую бороздку ДНК (дополнительный рисунок S2A).Один остаток витка, т.е. Leu51, и семь остатков из спирали узнавания мотива HTH BaZur, а именно Phe53, Asp54, Tyr57, Arg58, Asn59, Thr61 и Phe63, тесно контактировали с остатками ДНК T3– T9, а также T28–T31 (дополнительный рисунок S2B). Было замечено, что длинная положительно заряженная боковая цепь Arg58 в спирали узнавания образует наибольшее количество контактов и водородных связей с основанием T31.

    Таким образом, после картирования критических остатков ДНК и связывания цинка, характерных для белков Zur, на BAS4181, мы настоящим аннотируем BAS4181 как B.anthracis zur ( ba zur ) и соответствующую белковую последовательность как BaZur.

    ba zur экспрессируется как часть трехгенного оперона, который также кодирует компоненты системы ZnuABC

    Оперонная организация BAS4181 была предсказана базами данных DOOR (Mao et al., 2013) и PromBase (Rangannan and Bansal, 2011). В то время как промотор был предсказан выше BAS4183, петля шпильки могла быть расположена ниже BAS4181 с расчетной свободной энергией образования -16.3 ккал, что указывает на отсутствие транскрипционной связи с геном ниже ba zur . BAS4183, BAS4182 и BAS4181 кодируют белки длиной 256, 277 и 137 а.о. соответственно. BAS4183 при использовании в качестве запроса в скрининге BLASTP по неизбыточной (nr) базе данных NCBI выявил высокое сходство с АТФ-связывающим белком переносчиков металлов, точнее ZnuC. ZnuC представляет собой АТФ-связывающий белок высокоаффинного переносчика цинка ABC, ZnuABC, ответственного за обеспечение энергии для поглощения цинка (Patzer and Hantke, 1998; Hantke, 2001).Затем при скрининге BLASTP последовательности BAS4182 по базе данных NCBI nr было замечено, что она проявляет высокое сходство с пермеазой транспортера металла ABC и принадлежит к суперсемейству ZnuB (дополнительная таблица S3). ZnuB является пермеазой транспортера ZnuABC, который осуществляет транспорт цинка через мембрану (Patzer and Hantke, 1998; Hantke, 2001). Аннотация BAS4181 обсуждалась выше. Оперонная организация in silico была подтверждена с помощью ОТ-ПЦР.Три гена ориентированы в одном направлении в геноме B. anthracis и совместно транскрибируются. В локусах генома ABC, если ген B транскрибируется совместно с генами A и C, можно окончательно утверждать, что гены A, B и C являются частью одной полицистронной единицы. Амплификация областей, включающих BAS4183-BAS4182 и BAS4182-BAS4181, подтверждает, что эти три гена являются частью одного транскрипта. Для BAS4183-4182, в то время как прямой праймер охватывает 555 нуклеотидов BAS4183, обратный праймер охватывает 331 нуклеотид BAS4182, в результате чего размер ампликона составляет 886 нуклеотидов.Для BAS4182-4181 прямой и обратный праймеры охватывают 701 нуклеотид BAS4182 и 156 нуклеотидов BAS4181 соответственно, в результате чего получается ампликон размером 857 нуклеотидов (рис. 2A, B). Различия в оперонной организации zur у разных бактерий. У L. monocytogenes , S. aureus и P. aeruginosa zur является частью трехгенного оперона, а два других гена кодируют АТФ-связывающие и пермеазные белки транспортера цинка ABC, соответственно ( Линдсей и Фостер, 2001 г., Корбетт и др., 2011; Эллисон и др., 2013). У M. tuberculosis zur образует оперон с еще одним регулятором транскрипции, который, как было показано, репрессирует оперон zur цинк-зависимым образом (Maciąg et al., 2007). Однако заметно, что zur является моноцистронным у B. subtilis и Staphylococcus epidermidis (Lindsay and Foster, 2001) и S. coelicolor (Shin et al., 2007) (дополнительный рисунок S3).

    Рис. 2. Опероническая организация ба зур. (A) Геномная организация оперона ba zur . ba zur является частью трехгенного оперона. Первый ген оперона является гомологом znuC , за ним следует гомолог znuB и, наконец, zur . Кодон остановки трансляции znuC перекрывается со стартовым кодоном znuB (обозначен красным). znuB и ba zur разделены 14 нуклеотидами. Черные стрелки указывают, где происходит отжиг праймеров для ОТ-ПЦР. (B) ПЦР с обратной транскриптазой для обнаружения транскриптов znuC znuB ба zur оперона. Дорожки 3 и 4 представляют продукты ПЦР с обратной транскриптазой из кДНК B. anthracis . Продукты ПЦР из геномной ДНК B. anthracis показаны на дорожках 1 и 5. Если в качестве матрицы использовали РНК без обратной транскрипции (отрицательный контроль, дорожка 2), продукт не был получен.

    Стабильная форма BaZur представляет собой димер

    Рекомбинантный BaZur был очищен от растворимой фракции BL21 (λDE3) и проанализирован на 15% SDS-PAGE, где он мигрировал с ожидаемой молекулярной массой 17 кДа (рис. 3A).Димерную склонность рекомбинантного BaZur, очищенного с помощью аффинной хроматографии, наблюдали с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга с использованием поликлональных сывороток против BaZur (фиг. 3A, B). Это было дополнительно подтверждено анализом SEC, выполненным на колонке Superdex-75 pg 16/600 с использованием системы AKTA FPLC с последующим SDS и BN-PAGE. Эксперименты проводились в отсутствие детергентов и при низкой концентрации соли 150 мМ NaCl в буфере А. Последовательность белков, прошедших через колонку, была следующей: БСА (66 кДа, Rt 53.48), димерный BaZur (Rt 60,34), CA (29 кДа, Rt 65,02), CC (12 кДа, Rt 74,76) и мономерный BaZur (17 кДа, Rt 75,22). Анализ SEC показал, что в условиях in vitro BaZur существует преимущественно в димерном состоянии, и может быть зарегистрировано только слабое поглощение, соответствующее мономерному положению (Rt 75,22) (рис. 3C). Это подтверждается миграцией BaZur между OVA (45 кДа) и STI (21 кДа) в BN-PAGE без обнаруживаемой полосы, соответствующей мономерному BaZur (рис. 3D, E).Однако, когда фракция BaZur (Rt 60,34) была подвергнута SDS-PAGE в восстанавливающих условиях, она заметно мигрировала как мономер (17 кДа) с очень слабой полосой, соответствующей димерному BaZur (34 кДа) (рис. 3А). Наконец, BaZur, регулятор поглощения цинка B. anthracis , в основном существует в димерном состоянии и проявляет свойства, сходные с другими белками в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. На микрофотографии SEC наблюдалось общее низкое поглощение при 280 нм, соответствующее 10 мг рекомбинантного белка BaZur, загруженного в колонку (рис. 3C), вероятной причиной которого было отсутствие триптофана в белке (Anthis and Clore, 2013). ).

    Рис. 3. Очистка и SEC-анализ BaZur. (A) SDS-PAGE анализ SEC элюировал BaZur, изображая мономерные и димерные формы. (B) Иммуноблоттинг очищенного белка, зондированного поликлональной сывороткой против BaZur. Могут быть обнаружены как мономерные, так и димерные формы. (C) SEC-микрофотография BaZur (красный) сравнивали со стандартом 1 (S1, синим), содержащим альбумин (A), карбоангидразу (CA) и цитохром C (CC), полученным с помощью быстрой жидкостной хроматографии белков на калибровочная колонка Superdex-75 pg 16/600. (D) Анализ BN-PAGE. Миграцию рекомбинантного BaZur, элюированного SEC, оценивали и сравнивали со стандартом 2 (S2), содержащим альбумин (A), овальбумин (OVA) и ингибитор трипсина сои (STI). BaZur преимущественно мигрирует в виде димера. (E) SDS-PAGE анализ элюированных стандартов SEC. Точность M-Bio-Rad плюс стандарт белка TM.

    BaZur связывается с консервативной последовательностью 9-1-9, Zur Box: характеристика способности связывания ДНК BaZur

    BaZur содержит крылатый мотив HTH и действует как фактор транскрипции, связывающий ДНК, специфичный к последовательности.Существует значительная гомология между BsuZur и BaZur, на что указывает анализ BLASTP. Два белка демонстрируют идентичность и сходство на 67 и 80% соответственно. Более того, из 13 остатков, составляющих мотив HTH как в BaZur, так и в BsuZur, девять идентичны, а три сходны. Это побудило нас исследовать геномную ДНК B. anthracis с использованием Zur-бокса B. subtilis (Gabriel et al., 2008). Используя стратегии несоответствия 0/1 и ручной проверки, мы смогли найти шесть ящиков Zur в B.anthracis , который регулирует 11 генов. Вверх по течению BAS1632, BAS1633 ( YCIC ), BAS1786, BAS1889 ( ZNUA ), BAS4183 ( ZNUB ZNUC Zur Operon), а также Bas4240 ( RPMGC ) Удар минимума одного ZUR коробка (рис. 4А). Был получен логотип последовательности для коробки Zur B. anthracis (рис. 4B). Функциональная аннотация кандидатов предсказанного регулона расшифровала их роль в поглощении цинка в качестве шаперонов металла и в мобилизации цинка, что важно для поддержания гомеостаза цинка в патогене.Размер регулона Zur варьирует у разных бактерий: от девяти генов у Corynebacterium glutamicum (Schröder et al., 2010) до 17 и 30 генов у Neisseria meningitidis (Pawlik et al., 2012) и M туберкулеза ( Maciąg et al., 2007) соответственно. В исключительных случаях Zur регулирует до 154 и 121 гена в штаммах Y. pestis (Li et al., 2009) и Streptococcus suis серотипа 2 (Feng et al., 2008) соответственно. Однако среди них есть как прямые, так и косвенные цели Зура.В настоящем исследовании, используя подход in silico , косвенные цели BaZur, те, которые регулируются, несмотря на то, что им не предшествует блок Zur, могли быть упущены. Однако непрямые мишени будут идентифицированы детальным исследованием транскриптомики, включающим сверхэкспрессию ba zur , которое в настоящее время проводится нашей группой. У большинства бактерий Zur regulon состоит из генов, участвующих в поддержании гомеостаза цинка; однако в году М.tuberculosis , гены, кодирующие белки с иммунодоминантными эпитопами, такие как ранний секреторный антиген-мишень 6 (ESAT-6) кластер 3 и семейство ESAT-6/культуральный фильтрат 10 (CFP-10), также регулируются Zur (Maciąg et al., 2007). ). Кроме того, у S. coelicolor Zur регулирует кластер генов, ответственных за синтез родственного сидерофору пептида, называемого coelibactin, нарушение регуляции которого ингибирует спорообразование (Kallifidas et al., 2010). Было обнаружено, что связанные с вирулентностью гены, такие как rovA , psaEF , psaA и ail , находятся под регуляцией Zur у Y.pestis (Li et al., 2009).

    Рис. 4. Прогноз Регулона с помощью компьютерного анализа и ручной проверки. (A) Таблица, изображающая сайты связывания ДНК BaZur (коробка Zur) в восходящих областях предполагаемых регулонов-кандидатов. а – кандидаты с несовпадением 0/1 в поле Zur, полученные RSAT. б – кандидаты с большим, чем несоответствие в поле Zur, выявленные при ручной проверке. Несоответствия обозначены красным цветом. в – Zur-бокс, идентифицированный для всех перечисленных генов, присутствовал в межгенной области штамма B.антрацис хромосома. г – консенсус получен по сайтам связывания предполагаемых генов регулона. Обратите внимание, что фланкирующие остатки также демонстрируют консервацию и отмечены зеленым цветом. (B) Логотип матрицы последовательности. Сайты связывания ДНК BaZur, перечисленные в таблице, были выровнены с помощью CLUSTALW с последующим созданием логотипа последовательности с помощью программы WebLogo, доступной по адресу: https://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi. (C-G) Zur бокс, размещенный в верхних областях предполагаемых регулонов-кандидатов: yciC , ba zur оперон, rpmG , BAS1632 и znuA .Обратите внимание, что два блока Zur (красный и подчеркнутый), разделенные 29 и 33 нуклеотидами, могут быть расположены в восходящей области BAS1632 и yciC соответственно. Элементы –10 (проксимальнее стартового кодона ATG) и –35 (дистальнее стартового кодона ATG) промоторов, предсказанных с помощью биоинформатики, показаны синим цветом. ATG, отмеченный зеленым цветом, обозначает стартовый кодон трансляции соответствующего гена.

    Анализы сдвига электрофоретической подвижности выполняли путем инкубации возрастающих концентраций рекомбинантного BaZur с промоторными областями шести различных генов предсказанного регулона, содержащего Zur-бокс.Сдвиги подвижности геля увеличивались с увеличением концентрации белка, так что полный сдвиг наблюдался при 6 и 8 мкг BaZur (рис. 5A1, B1, C1, D1, E, F). Можно предположить, что увеличение концентрации увеличивает образование димеров и полимеров более высокого порядка, что приводит к связыванию нескольких молекул BaZur с боксом Zur. Постепенное увеличение замедления ДНК-мишени в результате включения возрастающего градиента Zn +2 в реакционные смеси, оптимум составляет 100 мкМ (рис. 5G).Это наблюдение согласуется с предыдущими исследованиями, демонстрирующими важность цинка в ДНК-связывающей активности Zur (Maciąg et al., 2007; Shin et al., 2007; Ellison et al., 2013). Однако мы могли наблюдать замедление ДНК-мишени даже в отсутствие цинка; вероятной причиной этого могло быть загрязнение любых двухвалентных катионов в реакциях связывания или очищенный рекомбинантный BaZur, уже содержащий некоторое количество связанного с ним Zn +2 . В экспериментах по конкуренции, хотя добавление немеченой ДНК специфического конкурента постепенно отменяло сдвиг, не было влияния на сдвиг при добавлении неспецифического немеченого зонда конкурента (фиг. 5A2, B2, C2, D2).Кроме того, Zur не проявлял никакого связывания с зондом NZB; фрагмент промотора оперона BAS0540-BAS0541 B. anthracis (Gopalani et al., 2016), в котором отсутствует блок Zur (рис. 5H, I). Следовательно, связывание BaZur с промотором генов предсказанного регулона было специфическим.

    Рис. 5. ДНК-связывающая способность BaZur. Способность BaZur связываться с ДНК была установлена ​​с помощью EMSA, для чего увеличивающееся количество очищенного белка инкубировали с вышестоящими областями предполагаемых регулонов-кандидатов, содержащих Zur-бокс. (A1,B1,C1,D1,E,F) Повышение концентрации BaZur (0,05–0,47 нмоль) при инкубации с радиоактивно мечеными зондами (области Zur-бокса генов регулона) rpmG , znuA , znuC znuB ba zur оперон , yciC , BAS1632 и BAS1786. (A2,B2,C2,D2) Конкуренция с молярным избытком (50X, 100X и 200X) немеченого специфического зонда (SC) и с 200-кратным молярным избытком немеченого неспецифического зонда (NSC). (G) Влияние увеличения концентрации цинка на связывание ДНК.Увеличение замедления ДНК-мишени наблюдали при увеличении Zn +2 от 0 до 100 мкМ. (H) Графическое изображение восходящей области оперона BAS0540-BAS0541, в которой отсутствует блок Zur. Черные стрелки указывают на праймеры, используемые для амплификации этой восходящей области. (I) BaZur, инкубированный с зондом NZB, фрагментом ДНК размером 200 п.н., лишенным Zur-бокса. Сдвига не наблюдалось даже при самой высокой концентрации BaZur. Все реакции связывания проводили при комнатной температуре, а продукты разделяли на нативных 6% полиакриламидных гелях в 0.5X ТВЕ при 4°C. Затем гели подвергали вакуумной сушке при 70°С в течение 90–120 мин. Зонды с радиоактивной меткой и комплексы белок-ДНК визуализировали с помощью накопительного люминесцентного экрана и анализировали на люминофоре Typhoon FLA 9500. Хотя BaZur мог связываться со всеми тестируемыми зондами, он не проявлял никакого связывания с зондом NZB, что указывает на специфичность взаимодействий BaZur-ДНК.

    гена, участвующих в гомеостазе цинка, регулируются BaZur

    При ручной проверке коробка Zur может быть расположена в восходящей области BAS1889.Прямое связывание наблюдали, когда очищенный BaZur инкубировали с вышерасположенной областью BAS1889 (фиг. 5B). Было обнаружено, что блок Zur граничит с элементом -35 промотора in silico, предсказанного (рис. 4G), что свидетельствует о негативной регуляции BAS1889 с помощью BaZur.

    BAS1889 указан в базе данных KEGG как белок, связывающий субстрат транспортера цинка ABC (SBP). После тщательного биоинформатического анализа мы смогли аннотировать BAS1889 как BaZnuA. BAS1889 показал 25% идентичность с E.coli ZnuA и общее среднее сходство 46% с другими гомологами ZnuA (дополнительная фигура S4A). Более того, три консервативных гистидина; H 69 , H 148 и H 202 , а также богатая гистидином растяжка белков ZnuA могут быть выделены в BAS1889 (дополнительная фигура S4B) (Banerjee et al., 2003; Li and Jogl, 2007). ; Loisel et al., 2008; Yatsunyk et al., 2008; Ilari et al., 2011). ZnuA, впервые идентифицированный в E. coli как SBP высокоаффинной системы получения цинка ZnuABC, связывается с ионами Zn +2 , облегчая его транспортировку через мембрану (Patzer and Hantke, 1998).Потеря этой системы, а точнее ZnuA, привела к дефектам роста и ослаблению вирулентности у многих патогенов (Lewis et al., 1999; Campoy et al., 2002; Kim et al., 2004; Yang et al., 2006; Ammendola et al., 2007; Davis et al., 2009; Desrosiers et al., 2010). Обычное расположение генов транспортеров АВС заключается в наличии трансмембранного гена пермеазы и гена, кодирующего АТФазу, расположенных рядом с SBP, т.е. три гена znuA , znuB и znuC совместно транскрибируются.Однако у B. anthracis расположение отклоняется от парадигмы, и хотя znuA присутствует в виде одного гена, znuB и znuC образуют полицистронные транскрипты с ba zur . Аналогичные виды генной договоренности также видят в P. aeruginosa , Y. Pestis , Haemophilus Phangeenza и Haemophilus ducreyi , в котором ZNUA не переанастроне с Znub и ZNUC ( Льюис и др., 1999; Дерозье и др., 2010; Педерик и др., 2015).

    Затем, при ручном осмотре, мы смогли обнаружить блок Zur ниже по течению от элемента -35 биоинформатически предсказанного промотора оперона ba zur-znuB-znuC , что указывает на отрицательную ауторегуляцию (рис. 4D). Мы продемонстрировали прямое связывание между BaZur и промоторной областью оперона, содержащей блок Zur (рис. 5C). Ранее Панина и соавт. (2003), используя подходы in silico , предсказали авторепрессию zur в B.сибирская язва . Однако Zur-опосредованная ауторегуляция — явление скорее непарадигматическое. Подобно B. anthracis , Zur действует как ауторепрессор у E. faecalis , P. aeruginosa и L. monocytogenes (Corbett et al., 2011; Ellison et al., 2013; Latorre. , 2015). Напротив, ауторегуляция не наблюдалась у E. coli , B. subtilis , M. tuberculosis и S. coelicolor (Maciąg et al., 2007; Шин и др., 2007 г.; Престель и др., 2015). Таким образом, BaZur одновременно оказывает негативную регуляцию на все гены высокоаффинной системы поглощения цинка ZnuABC B. anthracis . Опосредованная Zur регуляция высокоаффинной системы поглощения цинка ZnuABC или ее гомологов также наблюдалась у ряда бактерий, таких как P. aeruginosa , L. monocytogenes , E. coli , B. subtilis и Y. pestis (Patzer and Hantke, 1998; Desrosiers et al., 2010; Корбетт и др., 2011; Педерик и др., 2015 г.; Престель и др., 2015).

    Кроме того, мы смогли найти блок Zur ниже по течению от элемента -35 биоинформатически предсказанного промотора BAS4240, аннотированного как rpmG , который кодирует рибосомный белок L33 (рис. 4E). Прямое связывание BaZur с вышестоящей областью BAS4240 было показано EMSA, что указывает на негативную регуляцию, осуществляемую BaZur на транскрипцию rpmG (рис. 5A1). В базе данных DOOR BAS4240 указан как часть двухгенного оперона.

    Некоторые из рибосомных белков, таких как L31, L33, L36 и S14, дублируются в ряде бактериальных геномов и часто называются паралогическими белками, которые отличаются друг от друга наличием мотива связывания цинка, состоящего из двух пар консервативных CXXC протяжение. В то время как один, несущий этот мотив, обладает способностью связываться с цинком и обозначается как форма С + , другой, лишенный этого мотива, называется формой С (Макарова и др., 2001). Наш анализ in silico выявил существование трех паралогов rpmG в B.anthracis , а именно BAS4168, BAS0094 и BAS4240, которые были идентифицированы как гомологи rpmGA , rpmGB и rpmGC соответственно, на основании сходства последовательностей с белками B. subtilis , Bacillus licheniformis и Bacillus amyloliquifaciens (Zeigler et al., 2008; Gabriel and Helmann, 2009). Проверка последовательности всех трех членов семейства rpmG из B. anthracis показала, что, хотя RpmGB содержит все четыре консервативных цистеина, т.е.е., неповрежденный мотив связывания цинка, RpmGC и RpmGA содержат только два цистеина, несовершенный мотив, неспособный к связыванию цинка (дополнительная фигура S5A). Наш вывод о том, что BaZur оказывает негативное влияние на форму C рибосомного белка L33 B. anthracis , основанный на анализе EMSA и in silico , подтверждается более ранними исследованиями, в которых сообщалось, что Zur подавляет C . − форм различных рибосомных белков (Nanamiya et al., 2004; Akanuma et al., 2006; Maciąg и др., 2007; Шин и др., 2007 г.; Габриэль и Хелманн, 2009 г.; Ли и др., 2009).

    Помимо своей роли в трансляции, рибосомы также служат хранилищем цинка в клетке (Panina et al., 2003; Moore and Helmann, 2005). Бактерии разработали механизмы для стратегического использования этого репертуара цинка. В условиях дефицита цинка высвобождается опосредованная Zur репрессия генов, кодирующих формы C рибосомных белков. Эти формы C затем замещают соответствующие формы C + из рибосом, что приводит к освобождению цинка, который затем может использоваться другими металлопротеинами.Эта мобилизация гарантирует, что даже при недостатке цинка важнейшие процессы и функции белков, проявляющих зависимость от цинка, не остановятся (Moore et al., 2005; Akanuma et al., 2006).

    Затем мы смогли обнаружить два Zur-бокса, разделенных 33 нуклеотидами, в восходящей области BAS1633, гомолога YciC B. subtilis , из которых один почти перекрывает элемент -35 промотора in silico , предсказанного in silico , в то время как другой расположен ниже по течению от этого элемента, что указывает на негативную регуляцию, наложенную BaZur на BAS1633 (рис. 4С).Прямое связывание BaZur с вышерасположенной областью BAS1633, содержащей оба блока Zur, было продемонстрировано с помощью EMSA (рис. 5D1). Аналогично, восходящая область bsu yciC также содержала два ящика Zur, через которые BsuZur мог опосредовать репрессию. YciC из B. subtilis (BsuYciC) является наиболее изученным членом подсемейства COG0523 1. COG0523, разделенный на 15 подсемейств, принадлежит к семейству G3E ГТФаз P-петли, которые функционируют либо как инсертазы, управляемые энергией, либо как металлошапероны, либо как в некоторых случаях и то, и другое (Leipe et al., 2002; Хаас и др., 2009). Сообщается, что многие белки COG0523 регулируются Zur и участвуют в гомеостазе цинка (Gaballa and Helmann, 1998; Panina et al., 2003; Haas et al., 2009; Schröder et al., 2010; Napolitano et al., 2012). ). Попарное выравнивание BsuYciC и BAS1633 привело к разграничению мотива Walker A, Walker B и связывающего металл мотива CXCC в последнем, что характерно для белков COG0523 (дополнительная фигура S5B) (Leipe et al., 2002; Haas et al. др., 2009). Таким образом, мы аннотируем BAS1633 как YciC of B . сибирской язвы (BaYciC). Гомологи YciC были также идентифицированы у Staphylococcus sp и E. faecalis (Panina et al., 2003).

    YciC в B. subtilis действует как шаперон цинка, который доставляет металл к YciA, резервному ферменту для синтеза фолата, используемого клеткой в ​​условиях истощения цинка. Введение мутации yciC в штамм с дефицитом транспортера цинка усугубляло дефект роста в условиях дефицита цинка (Gabella and Helmann, 1998; Lee and Helmann, 2007; Gabriel et al., 2008). В отличие от BsuYciC, обитающего в мембране, BaYciC является локализованным в цитоплазме белком. На это указывала высокая гидрофильность белка, определенная анализом гидрофильности Хоппа и Вуда (дополнительная фигура S5C). Кроме того, в BaYciC не было пронизывающих мембрану спиралей, как это было предсказано TMHMM (Hopp, 1989; Krogh et al., 2001).

    Затем мы продемонстрировали прямое связывание BaZur с вышерасположенной областью BAS1786, содержащей блок Zur ниже по течению от элемента -35 промотора , предсказанного in silico , что свидетельствует об отрицательной регуляции (рис. 5F).Архитектура домена BAS1786, установленная базой данных SMART и поиском CDD, доступным в NCBI, показала, что это металлошапероновый белок COG0523 с доменами, специфичными для членов подсемейства CobW_C. Это подсемейство 12 получило свое название от белка CobW, первого представителя, который был описан и показан для участия в биосинтезе кобаламина (Crouzet et al., 1991; Blanche et al., 1995; Rodionov et al., 2003; Heldt et al. ., 2005). Однако не все белки этого подсемейства являются истинными белками CobW, многие из них регулируются Zur и участвуют в реакции на дефицит цинка (Haas et al., 2009). Так, B. anthracis имеет два регулируемых по Zur паралога COG0523, аналогичных Pseudomonas putida (Haas et al., 2009).

    Кроме того, мы можем обнаружить два блока Zur выше по течению от оперона BAS1632, другого кандидата предполагаемого регулона BaZur. Прямое связывание было продемонстрировано между BaZur и восходящей областью BAS1632, содержащей два блока Zur, с помощью EMSA (рис. 5E). Оба блока были расположены выше элемента -35 промотора in silico, предсказанного , что свидетельствует о положительной регуляции с помощью BaZur (рис. 4F).Из анализа доменной архитектуры BAS1632 мало что можно сделать, за исключением того, что это пермеаза неизвестной специфичности и принадлежит к надсемейству Arsp_1. Он проявляет сходство с субъединицей SMU_747c двухкомпонентного мембранно-пермеазного комплекса Streptococcus mutans , участвующей в выживании при низком pH, образовании биопленки и ацидогенезе.

    Следовательно, мы предлагаем модель поглощения и мобилизации цинка, в которой, когда B. anthracis сталкивается с нехваткой цинка, опосредованная BaZur репрессия генов, кодирующих систему ZnuABC, металлошапероны, такие как YciC и BAS1786 и RpmGC, ослабевает, активируя их экспрессию.Это приводит к транспортировке цинка в клетку, внутриклеточному перемещению, перемещению и мобилизации цинка внутри клетки, таким образом доставляя его к тем цинк-зависимым белкам и ферментам, которые более важны для клеточной функции. Кроме того, ауторегуляция ba zur может рассматриваться как механизм для удержания уровней Zur под жестким контролем и строгого поддержания гомеостаза цинка в клетке в любое время. Более того, ауторегуляция становится еще более существенной, когда zur образуют оперон с генами переносчиков цинка.

    Затем, чтобы добавить достоверности нашей предложенной модели, мы исследовали экспрессию некоторых из важнейших генов регулонов в условиях истощения цинка, опосредованных TPEN. В то время как экспрессия rpmGC увеличивалась в семь раз при индукции истощения цинка, наблюдалось заметное увеличение в 11 раз уровней транскриптов ba yciC и 10-кратное повышение экспрессии транскриптов znuA (рис. 6B). ). Это наблюдение указывает на роль этих генов в реагировании на гипоцинкемические состояния и борьбе с ними.

    Рисунок 6. Цинк-зависимая регуляция транскрипции ba zur , yciC, znuA и rpmG . qRT-PCR для количественной оценки количества транскриптов (A) ba zur в условиях избытка цинка, что выражается в виде кратности изменения между обработанными и контрольными образцами. Снижение экспрессии bazur наблюдалось в условиях избытка цинка. (B) ba zur , yciC , znuA , rpmG в условиях истощения цинка, индуцированного TPEN, что выражается как кратное изменение между обработанными и контрольными образцами.Наблюдалась активация экспрессии. Показано среднее значение с SEM из пяти независимых запусков, выполненных в трех повторностях. Статистическую значимость определяли на основе порогового значения p , равного 0,05, с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующими множественными сравнениями. ∗∗∗∗ p < 0,0001.

    Цинк-зависимая регуляция

    ba zur Оперон и другие гены регулона

    Интригует разная экспрессия zur в условиях дефицита цинка у разных организмов.Следовательно, мы исследовали этот аспект у B. anthracis . Для этого кДНК, полученная из клеток B. anthracis , подвергнутых воздействию 50 мкМ TPEN, внутриклеточного хелатора цинка, в течение 40 минут, использовали в качестве матрицы в qRT-PCR. Экспрессия ba zur повышалась в 28 раз при индукции истощения цинка с помощью TPEN (фиг. 6B).

    И наоборот, мы также количественно определили транскрипты ba zur в условиях избытка цинка. Для этого использовали кДНК, полученную из клеток, подвергшихся воздействию возрастающей концентрации цинка в диапазоне от 250 мкМ до 1.5 мМ использовали в качестве матрицы в qRT-PCR. При 1,5 мМ и более высоких концентрациях Zn +2 рост почти подавлялся, что делало выделение РНК трудной задачей. Экспрессия ba zur снижалась в 2, 2,5 и 3,5 раза при воздействии 250 мкМ, 500 мкМ и 1,0 мМ соответственно экзогенного цинка, за пределами которого кратное изменение не могло быть определено (рис. 6А). Понижение/повышение регуляции считалось значимым только тогда, когда оно было > в два раза, а значение p было <0.05.

    Кроме того, зависящие от фазы роста колебания экспрессии bazur также подтверждаются приведенными выше наблюдениями. Кривая роста B. anthracis отслеживалась и четыре точки роста соответствовали ранней экспоненциальной (OD 600 нм ∼ 0,3), среднеэкспоненциальной (OD 600 нм ∼ 0,6), поздней экспоненциальной (OD 600 нм ~ 0,9) и начало стационарной (OD 600 нм ~ 1,2) фазы соответственно были выбраны (дополнительный рисунок S6A).Наблюдалось непостоянство в экспрессии транскриптов ba zur по мере того, как клетки проходили через выбранные точки роста, с увеличением до поздней экспоненциальной фазы с последующим снижением в стационарной фазе (дополнительная фигура S6B). Это колебание может быть связано с зависящим от фазы роста изменением концентрации цинка в клетках B. anthracis , которое уменьшается, когда клетка вступает в позднюю экспоненциальную фазу, и снова начинает расти, когда клетка входит в стационарную фазу. фаза (Арора и др., 2013). Эти внутриклеточные колебания экспрессии ba zur , зависящие от цинка, можно рассматривать как механизм, обеспечивающий внутриклеточный гомеостаз цинка.

    При воздействии на бактерии TPEN или экзогенного цинка экспрессия zur проявляет заметное разнообразие в разных организмах. В то время как у некоторых бактерий он проявляет положительную регуляцию, у других он либо подавляется, либо не показывает никаких изменений в экспрессии. Существует зависимое от цинка подавление zur в E.faecalis и P. aeruginosa (Ellison et al., 2013; Latorre et al., 2015). Противоположно у S. coelicolor и M. tuberculosis происходит зависимая от цинка индукция экспрессии zur (Milano et al., 2004; Canneva et al., 2005; Shin et al., 2007). Однако на экспрессию zur в условиях избытка/истощения цинка в B. subtilis влияния не оказывается. Зависимая от цинка индукция или подавление zur происходит либо из-за прямой ауторегуляции самим Zur, либо из-за косвенной регуляции, осуществляемой каким-либо другим регулятором.У E. faecalis и P. aeruginosa Zur демонстрирует отрицательную ауторегуляцию (Ellison et al., 2013; Latorre et al., 2015). Однако у M. tuberculosis цинк-зависимая индукция zur осуществляется регулятором семейства SmtB/ArsR, который совместно транскрибируется с самим zur (Milano et al., 2004; Canneva et al., 2005; Maciąg и др., 2007). Соответственно, у S. coelicolor не было Zur-бокса, расположенного внутри или рядом с промотором zur , и, таким образом, предполагалось, что цинк-зависимая положительная регуляция вызывается каким-то другим неопознанным регулятором (Shin et al., 2007). У B. anthracis зависимое от цинка подавление zur можно отнести к негативной ауторегуляции оперона zur . Таким образом, мы предлагаем модель; при этом в условиях избытка цинка BaZur существует в связанной с цинком форме, тем самым подавляя собственную экспрессию. Эта BaZur-опосредованная репрессия высвобождается, когда концентрация цинка снижается, что приводит к существованию не связанной с цинком формы BaZur (апо-BaZur), которая либо обладает ослабленной способностью связывания ДНК, либо вообще не имеет ее (рис. 7).Эту негативную ауторегуляцию оперона znuB znuC ba zur с помощью BaZur можно рассматривать как дополнительный механизм контроля для жесткой регуляции экспрессии генов, участвующих в гомеостазе цинка у патогена.

    Рисунок 7. Графическая модель, иллюстрирующая механизм BaZur-зависимой регуляции генов регулонов в условиях дефицита цинка и избытка цинка.

    Заключение

    Благодаря многогранной роли цинка в бактериях, как внутриклеточный, так и внеклеточный гомеостаз цинка имеет решающее значение для их выживания.Цур — белок, незаменимый для поддержания гомеостаза цинка. Наше исследование представляет собой глубокое исследование ранее неизученного Zur B. anthracis и его роли в поддержании гомеостаза цинка в патогене. В заключение мы предлагаем модель, в которой в условиях пиршества цинка BaZur связывается с цинком и репрессирует экспрессию его генов регулона. Однако в условиях дефицита цинка BaZur преимущественно существует в не содержащей цинка форме, апо-BaZur, которая либо неспособна, либо ослаблена для связывания с ДНК.Таким образом, репрессия, опосредованная BaZur, прерывается, что приводит к экспрессии генов, кодирующих компоненты высокоаффинной системы поглощения цинка, форму С рибосомного белка и металлические шапероны, действующие как депо цинка, тем самым активируя адаптивный ответ на гипоцинкемические условия (рис. 7). Кроме того, негативная ауторегуляция, вызываемая BaZur, обеспечивает дополнительный уровень контроля Zur-опосредованной транскриптомной перестройки у B. anthracis .

    Вклад авторов

    RB и DK разработали концепцию исследования. RB, DK и MoG спланировали и провели все эксперименты и проанализировали данные. DK и MoG в основном написали рукопись, а RB и SB внесли интеллектуальный вклад. СБ провел моделирование гомологии BaZur и комплекса BaZur-ДНК. MaG выполнила SEC-анализ BaZur. HJ активно участвовал в пересмотре рукописи, проведя несколько важных экспериментов.

    Финансирование

    DK (наградное письмо № DBT/JRF/AL/417) и MoG являются получателями стипендии Департамента биотехнологии (DBT) Индии.

    Заявление о конфликте интересов

    Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

    Благодарности

    Г-н Ашок Кумар Саху из AIRF JNU получил признание за техническую помощь в экспериментах по конфокальной микроскопии.

    Дополнительный материал

    Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2018.03314/full#supplementary-material

    Сокращения

    а.о., аминокислоты; АР, щелочная фосфатаза; ba zur , Bacillus anthracis ген регулятора поглощения цинка; BaZur, Bacillus anthracis белок-регулятор усвоения цинка; BCIP, 5-бром-4-хлор-3′-индолифосфат; BN-PAGE, электрофорез в нативном синем полиакриламидном геле; ELISA, твердофазный иммуноферментный анализ; EMSA, анализ сдвига электрофоретической подвижности; HRP, пероксидаза хрена; NBT, нитро-синий тетразолий; Rt — время удерживания; SEC, эксклюзионная хроматография; TPEN, N, N, N’, N’-тетракис(2-пиридилметил)этилендиамин.

    Сноски

    1. http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=bpromandgroup=programsandsubgroup=gfinb
    2. www.wwpdb.org

    Каталожные номера

    Ан, Б.Е., Ча, Дж., Ли, Э.Дж., Хан, А.Р., Томпсон, С.Дж., и Роу, Дж.Х. (2006). Nur, никель-чувствительный регулятор семейства Fur, регулирует супероксиддисмутазы и транспорт никеля у Streptomyces coelicolor . Мол. микробиол. 59, 1848–1858 гг.doi: 10.1111/j.1365-2958.2006.05065.x

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Аканума Г., Нанамия Х., Натори Ю., Номура Н. и Кавамура Ф. (2006). Высвобождение цинксодержащего L31 (RpmE) из рибосом с помощью продукта его паралогичного гена, YtiA, в Bacillus subtilis . J. Бактериол. 188, 2715–2720. doi: 10.1128/JB.188.7.2715-2720.2006

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Аль-Курайши, М., Тан С. и Ся С. (2015). База данных аффинной структуры спираль-поворот-спираль: комплексы ДНК с универсальной системой координат. Биоинформатика BMC 16:390. doi: 10.1186/s12859-015-0819-2

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Аммендола С., Паскуали П., Пистойя К., Петруччи П., Петрарка П., Ротилио Г. и др. (2007). Высокоаффинная система поглощения Zn 2+ ZnuABC необходима для бактериального гомеостаза цинка во внутриклеточной среде и способствует вирулентности Salmonella enterica . Заразить. Иммун. 75, 5867–5876. doi: 10.1128/IAI.00559-07

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Антис, Нью-Джерси, и Клор, Г.М. (2013). Специфическое для последовательности определение концентрации белков и пептидов по поглощению при 205 нм. Науки о белках. 22, 851–858. doi: 10.1002/pro.2253

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Арора Г., Саджид А., Арулананд М. Д., Мишра Р., Сингхал А., Кумар С., и другие. (2013). Цинк регулирует активность пары киназа-фосфатаза (BasPrkC/BasPrpC) в Bacillus anthracis . Биометаллы 26, 715–730. doi: 10.1007/s10534-013-9646-y

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Олд, Д. С. (2001). «Координационная сфера цинка в биохимических центрах цинка», в Zinc Biochemistry, Physiology and Homeostasis , ed. В. Марет (Берлин: Springer), 85–127. дои: 10.1007/978-94-017-3728-9_6

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    Банерджи, С., Вей, Б., Бхаттачария-Пакраси, М., Пакраси, Х.Б., и Смит, Т.Дж. (2003). Структурные детерминанты металлоспецифичности белка транспорта цинка ZnuA из Synechocystis 6803. J. Mol. биол. 333, 1061–1069. doi: 10.1016/j.jmb.2003.09.008

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Берд, С.Дж., Хьюз, М.Н., и Пул, Р.К. (1995). Ингибирование системы NADH-оксидазы с концевым цитохромом bd в Escherichia coli K-12 катионами двухвалентных металлов. FEMS Microbiol. лат. 131, 205–210. doi: 10.1111/j.1574-6968.1995.tb07778.x

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Бланш, Ф., Кэмерон, Б., Крузе, Дж., Дебюше, Л., Тибо, Д., Вуилхорн, М., и соавт. (1995). Витамин В12: как решалась проблема его биосинтеза. Анжю. хим. Междунар. Эд. англ. 34, 383–411. doi: 10.1007/s00277-010-1144-5

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Ботелла, Х., Peyron, P., Levillain, F., Poincloux, R., Poquet, Y., Brandli, I., et al. (2011). Микобактериальные АТФазы P1-типа опосредуют устойчивость макрофагов человека к отравлению цинком. Клеточный микроб-хозяин 10, 248–259. doi: 10.1074/jbc.M112.448175

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Брей, Т. М., и Беттгер, В. Дж. (1990). Физиологическая роль цинка как антиоксиданта. Свободный рад. биол. Мед. 8, 281–291. дои: 10.1016/0891-5849(90)-U

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    Кампой, С., Хара, М., Бускетс, Н., де Розас, А.М.П., ​​Бадиола, И., и Барбе, Дж. (2002). Роль высокоаффинной системы поглощения цинка znuABC в вирулентности Salmonella enterica serovar typhimurium. Заразить. Иммун. 70, 4721–4725. doi: 10.1128/IAI.70.8.4721-4725.2002

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Каннева Ф., Бранцони М., Риккарди Г., Провведи Р. и Милано А. (2005). Rv2358 и FurB: два регулятора транскрипции из Mycobacterium tuberculosis , которые реагируют на цинк. J. Бактериол. 187, 5837–5840. doi: 10.1128/JB.187.16.5837-5840.2005

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Кейс Д., Перлман Д., Колдуэлл Дж., Читэм Т. III, Ван Дж., Росс В. и др. (2002). ЯНТАРЬ 7: 2002 . Сан-Франциско, Калифорния: Калифорнийский университет, Сан-Франциско.

    Академия Google

    Кассат, Дж. Э., и Скаар, Э. П. (2012). Приобретение ионов металлов золотистым стафилококком: преодоление пищевого иммунитета , Vol.34. Берлин: Springer, 215–235. doi: 10.1007/s00281-011-0294-4

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Сераси, М., Аммендола, С., и Баттистони, А. (2013). Конкуренция за связывание цинка при взаимодействии хозяин-патоген. Фронт. Клетка. Заразить. микробиол. 3:108. doi: 10.3389/fcimb.2013.00108

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    Шерил-линн, Ю. О., Уокер, М. Дж., и Макьюэн, А. Г. (2015). Цинк нарушает центральный углеродный обмен и биосинтез капсулы Streptococcus pyogenes . науч. Респ. 5:10799. дои: 10.1038/srep10799

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Корбетт, Д., Ван, Дж., Шулер, С., Лопес-Кастехон, Г., Гленн, С., Бро, Д., и другие. (2011). Две системы поглощения цинка способствуют полной вирулентности Listeria monocytogenes во время роста in vitro и in vivo. Заразить. Иммун. 80, 14–21. doi: 10.1128/IAI.05904-11

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Крузе, Дж., Леви-Шил, С., Кэмерон, Б., Кошуа, Л., Риго, С., Руйез, М., и соавт. (1991). Нуклеотидная последовательность и генетический анализ фрагмента ДНК Pseudomonas denitrificans размером 13,1 килобаз, содержащего пять генов cob, и идентификация структурных генов, кодирующих Cob (I) аламинаденозилтрансферазу, кобировую кислотную синтазу и бифункциональную кобинамидкиназу-кобинамидфосфатгуанилилтрансферазу. J. Бактериол. 173, 6074–6087. doi: 10.1128/jb.173.19.6074-6087.1991

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Далет, К., Gouin, E., Cenatiempo, Y., Cossart, P., and Héchard, Y. (1999). Характеристика нового оперона, кодирующего Zur-подобный белок и ассоциированную пермеазу цинка ABC у Listeria monocytogenes . FEMS Microbiol. лат. 174, 111–116. doi: 10.1111/j.1574-6968.1999.tb13556.x

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Дэвис, Л. М., Какуда, Т., и ДиРита, В. Дж. (2009). Ортолог Campylobacter jejuni znuA необходим для роста в средах с низким содержанием цинка и колонизации цыплят. J. Бактериол. 191, 1631–1640. doi: 10.1128/JB.01394-08

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Desrosiers, D.C., Bearden, S.W., Mier, I., Abney, J., Paulley, J.T., Fetherston, J.D., et al. (2010). Znu является преобладающим импортером цинка у Yersinia pestis во время роста in vitro, но не имеет существенного значения для вирулентности. Заразить. Иммун. 78, 5163–5177. doi: 10.1128/IAI.00732-10

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Диас-Мирелес, Э., Wexler, M., Sawers, G., Bellini, D., Todd, J. и Johnston, A. (2004). Fur-подобный белок Mur Rhizobium leguminosarum является Mn2+-чувствительным регулятором транскрипции. Микробиология 150, 1447–1456. doi: 10.1099/мик.0.26961-0

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Джоко, К.Ю., Шерил-линн, Ю.О., Уокер, М.Дж., и Макьюэн, А.Г. (2015). Токсичность меди и цинка и ее роль во врожденной иммунной защите от бактериальных патогенов. J. Biol. хим. 290, 18954–18961. doi: 10.1074/jbc.R115.647099

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Дауд, Г. К., Кейси, П. Г., Бегли, М., Хилл, К., и Гаан, К. Г. (2012). Изучение роли ZurR в физиологии и патогенезе Listeria monocytogenes . FEMS Microbiol. лат. 327, 118–125. doi: 10.1111/j.1574-6968.2011.02472.x

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Дьюсбери, Н.S., Webb, C.P., Leppla, S.H., Gordon, V.M., Klimpel, K.R., Copeland, T.D., et al. (1998). Протеолитическая инактивация MAP-киназы-киназы летальным фактором сибирской язвы. Наука 280, 734–737. doi: 10.1126/наука.280.5364.734

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    Эллисон М.Л. III, Фэрроу Дж. М., Пэрриш В., Данелл А. С. и Пеши Э. К. (2013). Регулятор транскрипции Np20 является регулятором поглощения цинка у Pseudomonas aeruginosa . PLoS One 8:e75389.doi: 10.1371/journal.pone.0075389

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Эсколар, Л., Перес-Мартин, Дж., и Де Лоренцо, В. (1999). Открытие железного ящика: металлорегуляция транскрипции белком Fur. J. Бактериол. 181,6223–6229.

    Реферат PubMed | Академия Google

    Фальчук, К. Х. (1993). Цинк в биологии развития: роль металлозависимой регуляции транскрипции. Прог. клин. биол. Рез. 380:91.

    Академия Google

    Feng, Y., Li, M., Zhang, H., Zheng, B., Han, H., Wang, C., et al. (2008). Функциональное определение и глобальная регуляция Zur, регулятора поглощения цинка в штамме Streptococcus suis серотипа 2, вызывающем синдром стрептококкового токсического шока. J. Бактериол. 190, 7567–7578. doi: 10.1128/JB.01532-07

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Fillat, MF (2014). Суперсемейство FUR (регулятор поглощения железа): разнообразие и универсальность ключевых регуляторов транскрипции. Арх. Биохим. Биофиз. 546, 41–52. doi: 10.1016/j.abb.2014.01.029

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Габалла, А., и Хелманн, Дж. Д. (1998). Идентификация специфического для цинка металлорегуляторного белка Zur, контролирующего опероны транспорта цинка в Bacillus subtilis . J. Бактериол. 180, 5815–5821.

    Реферат PubMed | Академия Google

    Габриэль, С.Э., и Хелманн, Дж.Д. (2009). Вклад Zur-контролируемых рибосомных белков в рост в условиях цинкового голодания. J. Бактериол. 191, 6116–6122. doi: 10.1128/JB.00802-09

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Габриэль, С.Э., Мияги, Ф., Габалла, А., и Хельманн, Дж.Д. (2008). Регуляция гена Bacillus subtilis yciC и понимание специфичности ДНК-связывания металлорегулятора Zur, чувствительного к цинку. J. Бактериол. 190, 3482–3488. doi: 10.1128/JB.01978-07

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Гопалани, М., Дхиман А., Рахи А., Кандари Д. и Бхатнагар Р. (2016). Идентификация, функциональная характеристика и предсказание регулона новой двухкомпонентной системы, включающей BAS0540-BAS0541 из Bacillus anthracis . PLoS One 11:e0158895. doi: 10.1371/journal.pone.0158895

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Гишар, А., Низе, В., и Бир, Э. (2012). Новое понимание биологических эффектов токсинов сибирской язвы: связь клеточных и организменных реакций. Заражение микробами. 14, 97–118. doi: 10.1016/j.micinf.2011.08.016

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Хаас, К.Э., Родионов, Д.А., Кропат, Дж., Маласарн, Д., Мерчант, С.С., и де Креси-Лагар, В. (2009). Подмножество разнообразного семейства предполагаемых шаперонов металлов COG0523 связано с гомеостазом цинка во всех царствах жизни. BMC Genomics 10:470. дои: 10.1186/1471-2164-10-470

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Холл, Т., Биологические науки, И., и Карлсбад, К. (2011). BioEdit: важное программное обеспечение для молекулярной биологии. ГЕРФ Бык. Бионауч. 2, 60–61.

    Академия Google

    Хантке, К. (2001). Регуляция железа и металлов в бактериях. Курс. мнение микробиол. 4, 172–177. doi: 10.1016/S1369-5274(00)00184-3

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    Хантке, К. (2002). Члены семейства белков Fur регулируют транспорт железа и цинка в E. coli и характеристики регулируемого Fur белка fhuF. Дж. Мол. микробиол. Биотехнолог. 4, 217–222.

    Реферат PubMed | Академия Google

    Heldt, D., Lawrence, A., Lindenmeyer, M., Deery, E., Heathcote, P., Rigby, S., et al. (2005). Аэробный синтез витамина B12: сокращение кольца и хелатирование кобальта . Лондон: Портленд Пресс Лимитед.

    Академия Google

    Хопп, Т. П. (1989). Использование процедур построения графика гидрофильности для идентификации белковых антигенных сегментов и других сайтов взаимодействия. Методы Фермент. 178, 571–585. дои: 10.1016/0076-6879(89)78040-X

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Хадсон, М.Дж., Бейер, В., Бём, Р., Фасанелла, А., Гарофоло, Г., Голински, Р., и соавт. (2008). Bacillus anthracis : баланс невинных исследований с потенциалом двойного назначения. Междунар. Дж. Мед. микробиол. 298, 345–364. doi: 10.1016/j.ijmm.2007.09.007

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Илари, А., Алалеона Ф., Петрарка П., Баттистони А. и Чианконе Э. (2011). Рентгеновская структура переносчика цинка ZnuA из Salmonella enterica раскрывает уникальную триаду гистидинов, координирующих цинк. Дж. Мол. биол. 409, 630–641. doi: 10.1016/j.jmb.2011.04.036

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Каллифидас, Д., Паско, Б., Оуэн, Г. А., Штрейн-Дамерелл, К. М., Хонг, Х.-Дж., и Пэджет, М. С. (2010). Чувствительный к цинку регулятор Zur контролирует экспрессию кластера генов целомибактина в Streptomyces coelicolor . J. Бактериол. 192, 608–611. doi: 10.1128/JB.01022-09

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Канехиса М., Фурумичи М., Танабэ М., Сато Ю. и Моришима К. (2017). KEGG: новые взгляды на геномы, пути, болезни и лекарства. Рез. нуклеиновых кислот. 45, Д353–Д361. дои: 10.1093/нар/gkw1092

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Ким С., Ватанабэ К., Ширахата Т. и Ватарай М.(2004). Система поглощения цинка (локус znuA) Brucella abortus необходима для внутриклеточного выживания и вирулентности у мышей. Дж. Вет. Мед. науч. 66, 1059–1063. doi: 10.1292/jvms.66.1059

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Климпель, К.Р., Арора, Н., и Леппла, С.Х. (1994). Летальный фактор токсина сибирской язвы содержит консенсусную последовательность металлопротеазы цинка, которая необходима для активности летального токсина. Мол. микробиол. 13, 1093–1100.doi: 10.1111/j.1365-2958.1994.tb00500.x

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Крог, А., Ларссон, Б., фон Хейне, Г., и Зоннхаммер, Э. Л. (2001). Прогнозирование топологии трансмембранных белков с помощью скрытой марковской модели: приложение к полным геномам. Дж. Мол. биол. 305, 567–580. дои: 10.1006/jmbi.2000.4315

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Латорре М., Лоу М., Гарате Э., Рейес-Хара А., Мюррей Б.Э., Камбиазо В. и др. (2015). Взаимодействие между гомеостазом меди и цинка через регулятор транскрипции Zur в Enterococcus faecalis . Металломика 7,1137–1145. дои: 10.1039/c5mt00043b

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Лейпе, Д. Д., Вольф, Ю. И., Кунин, Е. В., и Аравинд, Л. (2002). Классификация и эволюция ГТФаз P-петли и родственных АТФаз1. Дж. Мол. биол. 317, 41–72. дои: 10.1006/jmbi.2001.5378

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Льюис, Д. А., Клесни-Тейт, Дж., Ламбли, С. Р., Уорд, С. К., Латимер, Дж. Л., Изон, С. А., и соавт. (1999). Идентификация кодируемого znuA периплазматического транспортного белка цинка Haemophilus ducreyi . Заразить. Иммун. 67, 5060–5068.

    Реферат PubMed | Академия Google

    Ли, Х., и Джогл, Г. (2007). Кристаллическая структура цинксвязывающего транспортного белка ZnuA из Escherichia coli обнаруживает неожиданное изменение в координации металлов. Дж. Мол. биол. 368, 1358–1366. doi: 10.1016/j.jmb.2007.02.107

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Li, Y., Qiu, Y., Gao, H., Guo, Z., Han, Y., Song, Y., et al. (2009). Характеристика Zur-зависимых генов и прямых мишеней Zur у Yersinia pestis . ВМС микробиол. 9:128. дои: 10.1186/1471-2180-9-128

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Луазель, Э., Жакуаме, Л., Serre, L., Bauvois, C., Ferrer, J.L., Vernet, T., et al. (2008). AdcAII, новый пневмококковый Zn-связывающий белок, гомологичный переносчикам ABC: биохимический и структурный анализ. Дж. Мол. биол. 381, 594–606. doi: 10.1016/j.jmb.2008.05.068

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Maciąg, A., Dainese, E., Rodriguez, G.M., Milano, A., Provvedi, R., Pasca, M.R., et al. (2007). Общий анализ регулона Mycobacterium tuberculosis Zur (FurB). J. Бактериол. 189, 730–740. doi: 10.1128/JB.01190-06

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Макарова К.С., Пономарев В.А., Кунин Е.В. (2001). Два C или не два C: периодические разрывы Zn-лент, дупликация генов, специфическая для линии потеря генов и горизонтальный перенос генов в эволюции бактериальных рибосомных белков. Геном Биол. 2:ИССЛЕДОВАНИЕ0033.

    Академия Google

    Мао, X., Ма, Q., Чжоу, C., Chen, X., Zhang, H., Yang, J., et al. (2013). DOOR 2.0: представление оперонов и их функций в динамических и интегрированных представлениях. Рез. нуклеиновых кислот. 42, Д654–Д659. doi: 10.1093/nar/gkt1048

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Марчлер-Бауэр, А., Дербишир, М.К., Гонсалес, Н.Р., Лу, С., Читсаз, Ф., Гир, Л.Ю., и соавт. (2014). CDD: сохраненная база данных доменов NCBI. Рез. нуклеиновых кислот. 43, Д222–Д226. doi: 10.1093/nar/gku1221

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Маквильям, Х., Li, W., Uludag, M., Squizzato, S., Park, Y.M., Buso, N., et al. (2013). Веб-сервисы инструментов анализа из EMBL-EBI. Рез. нуклеиновых кислот. 41, W597–W600. doi: 10.1093/nar/gkt376

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Милано А., Бранцони М., Каннева Ф., Профумо А. и Риккарди Г. (2004). Оперон mycobacterium tuberculosis rv2358-furb индуцируется цинком. Рез. микробиол. 155, 192–200. doi: 10.1016/j.resmic.2003.11.009

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Миллс, Д. А., Шмидт, Б., Хизер, К., Уэстли, Э., и Фергюсон-Миллер, С. (2002). Ингибирование цитохром с-оксидазы цинком, контролируемое мембранным потенциалом. J. Biol. хим. 277, 14894–14901. doi: 10.1074/jbc.M1110

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Мур, К.М., Габалла, А., Хуэй, М., Йе, Р.В., и Хелманн, Дж.Д. (2005). Генетические и физиологические реакции Bacillus subtilis на стресс, вызванный ионами металлов. Мол. микробиол. 57, 27–40. doi: 10.1111/j.1365-2958.2005.04642.x

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Нанамия Х., Аканума Г., Натори Ю., Мураяма Р., Косоно С., Кудо Т. и др. (2004). Цинк является ключевым фактором, контролирующим чередование двух типов белка L31 в рибосоме Bacillus subtilis . Мол. микробиол. 52, 273–283. doi: 10.1111/j.1365-2958.2003.03972.x

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Наполитано, М., Рубио, М.А., Сантамария-Гомес, Дж., Олмедо-Верд, Э., Робинсон, Н.Дж., и Луке, И. (2012). Характеристика реакции на дефицит цинка у цианобактерий Anabaena sp. PCC 7120. J. Bacteriol. 194, 2426–2436. doi: 10.1128/JB.00090-12

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Nguyen, N.T.T., Contreras-Moreira, B., Castro-Mondragon, J.A., Santana-Garcia, W., Ossio, R., Robles-Espinoza, C.D., et al. (2018). RSAT 2018: 20-летие инструментов анализа регуляторных последовательностей. Рез. нуклеиновых кислот. 46, W209–W214. doi: 10.1093/nar/gky317

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Оуттен, К.Э., и О’Халлоран, Т.В. (2001). Фемтомолярная чувствительность металлорегуляторных белков, контролирующих гомеостаз цинка. Наука 292, 2488–2492. doi: 10.1126/наука.1060331

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Панина Е.М., Миронов А.А., Гельфанд М.С. (2003). Сравнительная геномика бактериальных регулонов цинка: усиленный ионный транспорт, патогенез и перестройка рибосомных белков. Проц. Натл. акад. науч. 100, 9912–9917. doi: 10.1073/pnas.17336

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Патцер С.И. и Хантке К. (1998). Система высокоаффинного поглощения цинка ZnuABC и ее регулятор zur в Escherichia coli . Мол. микробиол. 28, 1199–1210. doi: 10.1046/j.1365-2958.1998.00883.x

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Павлик, М.-К., Хьюберт, К., Джозеф, Б., Клаус, Х., Шон, К., и Фогель, У. (2012). Чувствительный к цинку регулон Neisseria meningitidis включает семнадцать генов, находящихся под контролем элемента Zur. J. Бактериол. 194, 6594–6603. doi: 10.1128/JB.01091-12

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Педерик, В.Г., Эйкелькамп, Б.А., Бегг, С.Л., Уин, М.П., ​​Макаллистер, Л.Дж., Патон, Дж.К., и соавт. (2015). ZnuA и гомеостаз цинка у Pseudomonas aeruginosa . науч. Респ. 5:13139. дои: 10.1038/srep13139

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Платеро Р., де Лоренцо В., Гарат Б. и Фабиано Э. (2007). Белок Sinorhizobium meliloti, подобный меху (Mur), связывает мех-бокс-подобную последовательность, присутствующую в промоторе mntA, чувствительным к марганцу образом. Заяв. Окружающая среда. микробиол. 73, 4832–4838. doi: 10.1128/AEM.00686-07

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Престель, Э., Нуаро П. и Огер С. (2015). Полногеномная идентификация Bacillus subtilis сайтов связывания Zur, связанных с боксом Zur, расширяет его известную регуляторную сеть. ВМС микробиол. 15:13. doi: 10.1186/s12866-015-0345-4

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Рахман, М.Т., и Карим, М.М. (2018). Металлотионеин: потенциальное звено в регуляции цинка в пищевом иммунитете. биол. Трейс Элем. Рез. 182, 1–13.doi: 10.1007/s12011-017-1061-8

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Ранганнан, В., и Бансал, М. (2011). PromBase: веб-ресурс для различных геномных особенностей и предполагаемых промоторов в геномах прокариот. BMC Рез. Примечания 4:257. дои: 10.1186/1756-0500-4-257

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Родионов Д. А., Витрещак А. Г., Миронов А. А. и Гельфанд М. С. (2003). Сравнительная геномика метаболизма и регуляции витамина B12 у прокариот. J. Biol. хим. 278, 41148–41159. doi: 10.1074/jbc.M305837200

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Рудольф Г., Хеннеке Х. и Фишер Х.-М. (2006). За пределами парадигмы меха: экспрессия генов, контролируемая железом, у ризобий. FEMS Microbiol. Ред. 30, 631–648. doi: 10.1111/j.1574-6976.2006.00030.x

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Скоби, Х. М., Рейни, Г. Дж. А., Брэдли, К. А.и Янг, Дж. А. (2003). Белок 2 капиллярного морфогенеза человека функционирует как рецептор токсина сибирской язвы. Проц. Натл. акад. науч. 100, 5170–5174. doi: 10.1073/pnas.0431098100

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Шин, Дж.-Х., Юнг, Х.Дж., Ан, Ю.Дж., Чо, Ю.-Б., Ча, С.-С., и Роу, Дж.-Х. (2011). Ступенчатая экспрессия генов, чувствительных к цинку, через два регуляторных сайта связывания цинка в Zur. Проц. Натл. акад. науч. 108, 5045–5050.doi: 10.1073/pnas.1017744108

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Шин, Дж.-Х., О, С.-Ю., Ким, С.-Дж., и Роу, Дж.-Х. (2007). Чувствительный к цинку регулятор Zur контролирует систему поглощения цинка и некоторые рибосомные белки в Streptomyces coelicolor A3 (2). J. Бактериол. 189, 4070–4077. doi: 10.1128/JB.01851-06

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Сиверс Ф., Уилм А., Динин Д., Гибсон Т.Дж., Карплюс К., Ли В. и соавт. (2011). Быстрое, масштабируемое создание высококачественных множественных выравниваний белков с использованием Clustal Omega. Мол. Сист. биол. 7:539. doi: 10.1038/msb.2011.75

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Тан, Д.-Дж., Ли, X.-Дж., Хе, Ю.-К., Фэн, Дж.-Х., Чен, Б., и Тан, Дж.-Л. (2005). Регулятор поглощения цинка Zur необходим для полной вирулентности Xanthomonas campestris pv. кампестрис . Мол. Взаимодействие растительных микробов. 18, 652–658. doi: 10.1094/MPMI-18-0652

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Томпсон, Дж. Д., Гибсон, Т. Дж., и Хиггинс, Д. Г. (2003). Выравнивание нескольких последовательностей с использованием ClustalW и ClustalX. Курс. протокол Биоинформ. 1, 2.3.1–2.3.22. дои: 10.1002/0471250953.bi0203s00

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Траоре, Д. А., Эль Газуани, А., Иланго, С., Dupuy, J., Jacquamet, L., Ferrer, J.L., et al. (2006). Кристаллическая структура белка апо-PerR-Zn из Bacillus subtilis . Мол. микробиол. 61, 1211–1219. doi: 10.1111/j.1365-2958.2006.05313.x

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Van Zundert, G., Rodrigues, J., Trellet, M., Schmitz, C., Kastritis, P., Karaca, E., et al. (2016). ХАДДОК2. 2 веб-сервер: удобное интегративное моделирование биомолекулярных комплексов. Дж.Мол. биол. 428, 720–725. doi: 10.1016/j.jmb.2015.09.014

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Verneuil, N., Rincé, A., Sanguinetti, M., Posteraro, B., Fadda, G., Auffray, Y., et al. (2005). Вклад PerR-подобного регулятора в ответ на окислительный стресс и вирулентность Enterococcus faecalis . Микробиология 151, 3997–4004. doi: 10.1099/мик.0.28325-0

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Вигнеш, К.С. и Дип, Г. С. младший (2016). Иммунологическая оркестровка гомеостаза цинка: битва между механизмами хозяина и защитой от патогенов. Арх. Биохим. Биофиз. 611, 66–78. doi: 10.1016/j.abb.2016.02.020

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Wisedchaisri, G., Holmes, R.K., and Hol, W.G. (2004). Кристаллическая структура комплекса IdeR-ДНК выявляет конформационные изменения в активированном IdeR для основано-специфических взаимодействий. Дж. Мол. биол. 342, 1155–1169. doi: 10.1016/j.jmb.2004.07.083

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Yang, W., Liu, Y., Chen, L., Gao, T., Hu, B., Zhang, D., et al. (2007). Ген регулятора поглощения цинка (zur), участвующий в гомеостазе цинка и вирулентности Xanthomonas oryzae pv. oryzae в рисе. Курс. микробиол. 54, 307–314. doi: 10.1007/s00284-006-0485-8

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Ян, X., Беккер Т., Уолтерс Н. и Паскуаль Д. В. (2006). Делеция фактора вирулентности znuA ослабляет Brucella abortus и обеспечивает защиту от заражения диким типом. Заразить. Иммун. 74, 3874–3879. doi: 10.1128/IAI.01957-05

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Яцуник, Л. А., Истон, Дж. А., Ким, Л. Р., Шугарбейкер, С. А., Беннетт, Б., Брис, Р. М., и соавт. (2008). Структура и свойства связывания металлов ZnuA, периплазматического переносчика цинка из Escherichia coli . JBIC J. Biol. Неорган. хим. 13, 271–288. doi: 10.1007/s00775-007-0320-0

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Zeigler, D.R., Prágai, Z., Rodriguez, S., Chevreux, B., Muffler, A., Albert, T., et al. (2008). Происхождение 168, W23 и других унаследованных штаммов Bacillus subtilis . J. Бактериол. 190, 6983–6995. doi: 10.1128/JB.00722-08

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Сравнительный геномный подход к прогнозированию новых членов регулонов

    1. Кай Тан1,
    2. Габриэль Морено-Хагельзиб2,
    3. Хулио Колладо-Видес2 и
    4. Гэри Д.Стормо1,3
    1. 1 Факультет генетики, Медицинский факультет Вашингтонского университета, Сент-Луис, Миссури 63110-8232, США; 2 Programa de Biolı́ogía Molecular Computacional, Centro de Investigacion Sobre Fijacion de Nitrogeno-UNAM, Cuernavaca, Morelos 62100, Мексика

    Аннотация

    Идентификация полной сети регуляции транскрипции для организма является серьезной проблемой.Для каждого регуляторного белка мы хотим знать все гены, которые он регулирует, то есть его регулон. Примеры известных сайтов связывания можно использовать для оценки специфичность связывания белка и предсказание других сайтов связывания. Однако предсказания сайта связывания могут быть ненадежными. потому что определение истинной специфичности белка затруднено из-за значительной изменчивости сайтов связывания. Поскольку регуляторные системы, как правило, сохраняются в процессе эволюции, мы можем использовать сравнения между видами, чтобы увеличить надежность предсказаний сайта связывания.В этой статье представлен подход к оценке вычислительных прогнозов нормативных сайтов. Мы объединяем предсказание единиц транскрипции, имеющих ортологичные гены, с предсказанием транскрипции. сайты связывания факторов на основе вероятностных моделей. Мы увеличиваем наборы генов в Escherichia coli , которые, как ожидается, будут регулироваться двумя факторами транскрипции, белком рецептора цАМФ и восстановлением фумарата и нитрата. регуляторный белок путем сравнения с геномом Haemophilus influenzae .В то же время мы узнали больше о регуляторных сетях H. influenzae , вида с гораздо меньшими экспериментальными знаниями, чем E. coli . Изучая ортологичные гены, регулируемые одним и тем же фактором транскрипции, мы также получили представление о эволюция всей системы регулирования.

    Число полных последовательностей микробного генома увеличивается с беспрецедентной скоростью.На сегодняшний день известно 29 бактериальных геномов. определены, еще 11 находятся в стадии аннотации, а 83 находятся в процессе. Этот всплеск информации о последовательности дает огромное объем данных для сравнительного геномного анализа. На ранней стадии геномного анализа большая часть усилий была посвящена к анализу белок-кодирующих участков, потому что в ходе эволюции белок-кодирующие последовательности изменяются гораздо медленнее, чем некодирующие последовательности (Koonin et al.1997, 1998). Эти сравнительные исследования геномики оказались очень информативными, позволив определить функциональное назначение многих предполагаемых белков. у малоизученных организмов (Overbeek et al., 1999). Одним из неожиданных результатов этих анализов было отсутствие длительного сохранения порядка генов в бактериальных геномах. исключение видов внутри одного рода (Татусов и др., 1996; Химмельрайх и др., 1997). Для видов промежуточного филогенетического расстояния, таких как Escherichia coli и Haemophilus influenzae , многие кластеры консервативны, но их порядки менее консервативны (Dandekar et al.1998). Однако более недавнее исследование показывает явную консервацию пар ортологов генов внутри оперона, в отличие от гены на границах единиц транскрипции (ТЕ) (G.Moreno-Hagelsieb et al. 2001).

    Помимо знания функций отдельных белков, необходимым условием является знание регуляторной сети транскрипции. для адекватного понимания клеточных функций. Компьютерная идентификация регуляторных белков бактериального последовательность генома более надежна, учитывая ограниченное количество семейств факторов транскрипции и сохранение схемы спираль-поворот-спираль. мотив у бактерий (Perez-Rueda and Collado-Vides 2000).Для набора регуляторных белков мы хотим знать весь набор генов, экспрессия которых регулируется каждым из этих белков. регуляторы, его регулон (Salgado et al. 2000a). Первым шагом в этом направлении является идентификация сайтов связывания факторов транскрипции, которые затем могут помочь предсказать единицы транскрипции, регулируемые этими белками. Хотя проблема предсказания регуляторных сайтов изучалась более 20 лет, она все еще далека от решения (Gelfand 1995; Thieffry et al.1998а). Основными причинами этого являются небольшой размер обучающей выборки (часто <20 последовательностей) и плохое понимание биофизики взаимодействие белок-ДНК, что очень затрудняет вывод правильного набора правил для алгоритмов распознавания образов.

    Помимо идентификации регуляторных сайтов, другим ключом к предсказанию новых членов регулона является хорошая оценка транскрипции. единиц в данном геноме. Однако даже для такого широко изученного организма, как E.coli набор известных TU далеко не полный (Salgado et al. 2000a). Кроме того, прогнозирование TU является нетривиальной задачей, которая широко не изучалась. Недавно три группы опубликовали новые методы прогнозирования TU (Яда и др., 1999; Крейвен и др., 2000; Сальгадо и др., 2000b). Эти исследования представляют собой многообещающий первый шаг к более точному прогнозированию ТЕ. В этой статье транскрипция единицы определяются как наборы генов (один или несколько), которые совместно транскрибируются.Опероны определяются как полицистронное подмножество (подробнее чем один ген) всех единиц транскрипции.

    Мы приняли комбинированный подход к выявлению новых представителей регулонов. Мы обнаружили, что высокая оценка соответствует шаблонам связывания поскольку факторы транскрипции, вероятно, представляют собой настоящие регуляторные сайты, основываясь на распределении таких сайтов. Предсказания участков с более низкой оценкой менее надежны, поэтому мы добавляем данные сравнительного анализа с другими видами, основанные на предпосылка, что регулоны имеют тенденцию быть законсервированными.Если мы обнаружим, что ортологичные гены у двух или более видов кажутся контролируемыми тем же фактором, который обеспечивает дополнительную уверенность в предсказании даже сайтов с более низкими баллами. Однако, поскольку многие прокариотические гены транскрибируются как опероны, области контроля транскрипции могут быть далеко удалены от конкретного гена. Следовательно, анализ TU необходим для идентификации пар ортологичных генов, принадлежащих к общим регулонам.Таким образом, общий подход сочетает в себе предсказание TU у каждого вида, идентификацию ортологичных генов и предсказание сайтов связывания факторов транскрипции на основе вероятностных моделей, таких как весовые матрицы.

    В этой статье мы прогнозируем появление новых представителей белка рецептора цАМФ (CRP) и белка, регулирующего восстановление фумаратов и нитратов. (FNR) регулоны в E. coli и H.гриппа . Мы выбрали эти два генома, потому что регуляция транскрипции E. coli , безусловно, лучше всего изучена среди всех видов бактерий, а H. influenzae является единственным полным геномом (на момент написания этой статьи), который достаточно близок, чтобы многие TU законсервированный. CRP и FNR два глобальных регулятора транскрипции, встречающиеся у многих бактерий. Регулируемые ими гены (регулоны CRP и FNR) имеют широкий спектр функций. Наша общая стратегия показана на рисунке 1.Вкратце, образцы связывания, полученные из известных последовательностей связывания CRP и FNR E. coli , используются для предсказания новых сайтов связывания для этих двух белков. Предсказанные сайты связывания в сочетании с нашими знаниями об ортологичных генах и предсказаниями TU в обоих геномах. Эта объединенная информация используется для предсказания новых членов регулонов CRP и FNR.

    Фигура 1.

    Блок-схема, изображающая нашу общую стратегию прогнозирования дополнительных членов регулонов CRP и FNR. Подход разделен на три стадии. На первом этапе (I) необработанные наборы данных из RegulonDB фильтруются по сайтам сильного связывания и взвешиваются. генерируются матрицы на основе этих сильных сайтов. В этой части диаграммы показаны две пары чисел; первая пара представляет собой данные CRP и данные второй пары FNR.В каждой паре чисел первое число — это количество ЕП, регулируемых конкретным фактора транскрипции, а второе число — количество сайтов связывания фактора транскрипции. На втором этапе (II) регуляторная область (от -400 до +50 п.н.) каждой ORF в обоих геномах (4289 в E. coli и 1709 в H. influenzae ) исследуются с помощью PATSER на предмет потенциальных сайтов связывания факторов транскрипции. Пороговые значения для сильного (17 для СРБ и 20 для FNR) и слабого (10 для СРБ) и 14 для FNR) выбирают сайты связывания.Для дальнейшего анализа используются только предсказанные сайты с баллами выше отсечки слабых сайтов. Для обоих геномов показаны числа предсказанных сайтов связывания CRP и FNR, превышающие пороговые значения. Первая пара чисел представляют сайты CRP и вторые сайты FNR. На третьей стадии (III) транскрипционные единицы после предсказанных сайтов связывания предсказаны, и определены ортологические отношения между генами в E. coli и H. influenzae единиц транскрипции.Наконец, оценки сайта и информация об ортологии используются вместе для классификации наших прогнозов. TU, единица транскрипции; ТФ – фактор транскрипции.

    Другие группы ранее использовали сравнительный анализ для прогнозирования новых наборов регулируемых генов. Макгуайр и др. (2000) недавно исследовали 17 полностью секвенированных микробных геномов, чтобы идентифицировать регуляторные сайты для групп родственных генов.Они использовали подход обнаружения шаблонов для поиска предполагаемых сайтов, а затем использовали различные методы фильтрации, чтобы уменьшить количество ложных предсказаний. Они использовали известные регулоны E. coli в качестве положительных контролей и показали, что метод хорошо работает для идентификации известных сайтов. Они даже показали, что метод может применяться к видам архебактерий, как в другой статье Gelfand et al. (2000). Однако они не использовали шаблоны для E.coli , чтобы расширить набор генов, которые, вероятно, будут регулироваться специфическими факторами, что является основной целью этого исследования. статья. Миронов и др. (1999) также использовали сравнительный анализ для предсказания регуляторных участков у других видов для нескольких регулонов в E. coli . Кроме того, они предсказали несколько новых сайтов в E. coli для регуляторных белков PurR и ArgR. Наш подход в этом исследовании был аналогичным, но путем включения прогнозирования TU и используя два хорошо изученных регулона, мы смогли предсказать гораздо больше новых членов регулонов CRP и FNR.

    РЕЗУЛЬТАТЫ

    Сохраненные паттерны распознавания с помощью CRP и FNR в обоих геномах

    Сокристаллическая структура комплекса E. coli CRP-ДНК была решена с разрешением 2,5 Å (Parkinson et al. 1996). Основные взаимодействия, придающие специфичность, — это взаимодействия между первыми двумя остатками спирали узнавания, R180. и E181, а также две пары G : C в предполагаемом консенсусном половинном сайте TGTGA (Ebright et al.1989 год; Гунасекера и др. 1992). Остаток R185 в спирали узнавания также вносит вклад в специфичность связывания, хотя и в меньшей степени (рис. 2). Мы выровняли 10 ортологов CRP из различных бактериальных геномов (рис. 3). Первые два остатка мотива, придающего специфичность, RE-R на 100% консервативны у разных видов. Третий остаток в мотиве сохраняется, за исключением CRP_MTB, в котором второй аргинин заменен лизином. Этот высокий уровень сохранения в ДНК-связывающем домене подразумевает паттерн связывания CRP, аналогичный таковому у E.палочка . CRP также существует в этих бактериальных геномах с родственным белком CRP.

    Фигура 2. Рис. CRP, белок рецептора цАМФ; FNR, восстановление фумаратов и нитратов регуляторный белок.

    Рисунок 3.

    Множественное выравнивание последовательностей белков CRP и FNR из различных бактериальных геномов. Только последовательности вокруг второй спирали мотива спираль-поворот-спираль. Границы второй спирали отмечены сплошной линией.Высоко консервативный Мотив RE-R в белке CRP и мотив E-SR в белке FNR заштрихованы. FNR_AAC, FNR_COC и FNR_HAH — производные частичные последовательности от гомологического клонирования (Хаттори и др., 1996). (ААС) Actinobacillus actinomycetemcomitans ; (БСУ) Bacillus subtilis ; (КОС) Capnocytophaga ochracea ; (ЭКО) Escherichia coli ; (HAH) Haemophilus aphrophilus ; (HIN) Haemophilus influenzae ; (HSO) Haemophilus somnus ; (КАЕ) Klebsiella aerogenes ; (КПН) Klebsiella pneumoniae ; (MTB) Mycobacterium tuberculosis ; (PHA) Pasteurella haemophilus серотип 1; (PMU) Pasteurella multocida ; (SDY) Shigella dysenteriae ; (СТМ) Salmonella typhimurium ; (ВЧ) Холерный вибрион .CRP, белок рецептора цАМФ; FNR, белок, регулирующий восстановление фумаратов и нитратов.

    И CRP, и FNR принадлежат к надсемейству факторов транскрипции CRP/FNR спираль-поворот-спираль. В E. coli два белка идентичны на 23% и похожи на 36%, при этом консервативность сосредоточена в домене, содержащем HTH. мотив, в котором они имеют 27% идентичности и 43% сходства (с использованием BLAST и BestFit ).Консенсусный мотив полусайта FNR (Spiro et al. 1990), TTGAT, аналогичен мотиву полусайта CRP (TGTGA). Фактически, сообщалось об общем сайте, который может связывать как FNR, так и CRP. (Дженнингс и Бичем, 1993). В E. coli предполагаемые взаимодействия, придающие специфичность для FNR, — это взаимодействия между E209 и парой оснований GC, общей для обоих ядер. мотивов и дискриминационное взаимодействие между S212 и первой парой оснований TA в сайте FNR, которое заменяет взаимодействие между R180 и общая пара оснований GC в сайте CRP.Другое консервативное взаимодействие включает R213 и общую пару оснований GC. (рис.2). Из множественного выравнивания восьми ортологов FNR (рис. 3) мы видим, что первый и третий остатки мотива, придающего специфичность, E-SR, абсолютно консервативны по всему гену. видов, тогда как второй остаток в высокой степени, но не абсолютно консервативен. Опять же, эта высокая степень сохранения последовательности подразумевает консервативный паттерн распознавания для связывания FNR со своими операторами.

    Весовые матрицы CRP и FNR, полученные путем выравнивания охарактеризованных последовательностей связывания в

    E. coli

    С помощью программы CONSENSUS (Герц и Стормо, 1999) мы согласовали последовательности обучающих наборов для создания весовых матриц, используемых программой PATSER . В частности, мононуклеотидную матрицу использовали для представления специфичности связывания фактора транскрипции.Предположение Использование такой матрицы заключается в том, что вклад в специфичность связывания является аддитивным во всех положениях сайта. Мы протестировали это предположение с помощью программы MIXY (Gutell et al. 1992), которая может идентифицировать ковариацию (ковариации) между любыми двумя позициями в сайтах связывания. Значимой ковариации не наблюдалось между позициями для CRP и FNR. Таким образом, мы считаем, что мононуклеотидная матрица является действительным представлением связывания особенности СРБ и ФНР.

    CONSENSUS вычисляет значение P для множественного выравнивания без пропусков, что позволяет сравнивать различные выравнивания и определять наиболее важное из них. (Герц и Стормо, 1999). Для каждого белка мы сравнили длину сайтов от 14 до 28 нуклеотидов и сравнили симметричные модели с асимметричными. те. Симметричные модели явно более значимы, чем асимметричные, с ожидаемыми значениями как минимум в 10 2 раз ниже при всех тестируемых четных длинах.Ожидаемые значения для разных длин не сильно отличались на протяжении всего периода. диапазон проверенных длин, соответствующий белкам, имеющим консервативную область ядра 16 или 14 п.н., для CPR и FNR, соответственно, окружены более слабо консервативными последовательностями. Мы использовали 22 нуклеотида для длины сайта связывания каждого белка на основе на предыдущей работе (Kolb et al. 1993) и на согласованность с предыдущим анализом (Salgado et al. 2000a).Белок CRP имеет консенсус половинного сайта TGTGA с разделением на шесть нуклеотидов между двумя половинными сайтами. Белок FNR имеет консенсус половинного сайта TTGAT с разделением четырех нуклеотидов между половинными сайтами (рис. 4; таблица 1).

    Рисунок 4.

    Логотипы последовательностей для CRP- и FNR-связывающих мотивов.Он был создан на основе множественных выравниваний последовательностей CONSENSUS с использованием обучающих последовательностей. (горизонтальная ось) Положение в мотиве переплета; (вертикальная ось) содержание информации в биты. Высота каждой буквы пропорциональна ее преобладанию в данной позиции.

    Таблица 1.

    Матрицы позиционного веса для мотивов связывания CRP и FNR

    Определение пороговых значений для участков CRP и FNR 

    Чтобы определить соответствующую матрицу весов для каждого транскрипционного фактора и предельные баллы, которые будут использоваться для сильных и слабых предсказанных сайтов, нам нужно было определить доверенный набор сайтов-примеров и распределение оценок для этих сайтов, а также потенциальные сайты в геноме.Одна из трудностей возникает из-за того, что факторы транскрипции могут совместно связываться с ДНК. так что конкретный экспериментально определенный сайт на самом деле не был бы сайтом с высоким сродством к фактору в другом контекст без соседнего сайта. Чтобы устранить такие потенциальные артефакты, мы выбрали только сайт с наивысшей оценкой для каждого единица транскрипции (см. Методы), предполагая, что по крайней мере один из сайтов должен обладать высокой аффинностью сам по себе.Это еще может привести к нескольким сайтам с изначально низким сходством в нашей обучающей выборке, но это число должно быть сведено к минимуму. Затем устанавливаем пороги для сайтов с высокими баллами на основе баллов обучающих наборов и с учетом распределения баллов в фоновая (то есть геномная) последовательность.

    Чтобы определить пороговые значения для сайтов CRP, мы использовали следующую процедуру.Во-первых, мы определили диапазон и средний балл для следующие два набора последовательностей: (1) обучающие последовательности; и (2) все 22 мера в геноме E. coli . Как показано в Таблице 2, обучающие последовательности набрали от 8,77 до 20,62 бита со средним значением 14,4 бита и стандартным отклонением 3,6 бита. средний балл и стандартное отклонение всех 22 меров в геноме E. coli составляли -15,84 и 8,53 бита соответственно. Ожидается такой отрицательный средний балл, потому что большая часть геномной последовательности не содержит сайтов связывания CRP.Затем для каждого сайта с оценкой от 7 до 23 битов при сканировании всего генома мы определили его расположение относительно TU ниже по течению от него или вокруг него. Функциональные регуляторные сайты обычно располагаются выше по течению. ТЕ (в регионе регулирования), хотя известно несколько случаев, когда сайты расположены в пределах ТЕ (8 из 361 в РегулонДБ). Учитывая это наблюдение, мы можем аппроксимировать частоту ложных срабатываний наших прогнозов сайта на основе доли предсказанных сайтов, расположенных в единицах транскрипции.На рис. 5а показана доля сайтов связывания CRP, расположенных либо выше, либо внутри TU в геноме E. coli . При низких пороговых значениях почти все сайты расположены в пределах единиц транскрипции, что указывает на высокий уровень ложноположительных результатов. Размер всех восходящих областей составляет ~1,23 Мб, ~27% от размера генома E. coli (4,63 Мб). Таким образом, сайты со случайной локализацией встречаются в пределах TU примерно 73% времени. Повышение порогового балла снижает часть предсказанных сайтов, расположенных в пределах TU, и, таким образом, снижает количество ложноположительных результатов.Используя отсечку 17 бит, только 6% всех сайтов расположены в пределах единиц транскрипции, что указывает на низкий уровень ложноположительных результатов при этом пороговом значении. Таким образом, мы использовали 17 как предельная оценка для сильных сайтов. Чтобы повысить чувствительность нашего поиска, мы также выбрали пороговую оценку для слабых сайтов. Мы решили использовать отсечку, при которой более половины всех сайтов расположены выше по течению от TU. Как показано на рисунке 5а, при отсечке 10 бит 56% всех сайтов расположены вверх по течению от TU, а не внутри них.Таким образом, мы выбрали 10 в качестве отсечки. Оценка для слабых сайтов. Используя это отсечение слабого сайта, мы пропустили только две обучающие последовательности (glnALG и rpoS; таблица 3).

    Таблица 2.

    Распределение результатов обучающих последовательностей и всех 22-меров в обоих геномах, просканированное с помощью PATSER

    Рисунок 5.

    Доля участков, расположенных выше или внутри TU в E. coli . Все участки в геноме E. coli выше определенного порога делятся на две группы в зависимости от их расположения относительно ТЕ: выше или внутри. ( a ) сайты CRP; ( b ) Сайты FNR. ТУ, единица транскрипции.

    Таблица 3.

    Учебный набор TU, регулируемый CRP

    Мы применили те же самые критерии, описанные выше, для определения пороговых значений для сайтов связывания FNR. Тренировочные последовательности имел диапазон оценок от 12 до 25,84 бит и среднее значение 19,8 бит со стандартным отклонением 4,5 бит (таблица 2). Основываясь на рисунке 5b, мы выбрали 20 в качестве порога для сильных сайтов.На этом пороге только 9% всех сайтов расположены в пределах TU. Что касается слабых отсечения участков, мы выбрали 14, потому что при этом отсечении более половины всех участков (57%) расположены выше по течению, а не внутри ТУ (рис. 5б). Используя отсечение слабого сайта, мы пропустили только одну обучающую последовательность (dmsA; таблица 4).

    Таблица 4.

    Тренировочный набор ТУ в Escherichia coli Регулируется FNR

    Новые члены CRP Regulon

    Наборы восходящих последовательностей из обоих геномов были просканированы с помощью PATSER с использованием весовой матрицы CRP.Предполагаемые сайты были отфильтрованы с использованием двух пороговых значений для сайтов CRP, описанных выше. Для каждого Сайт CRP набрал выше 10 бит, мы предсказали TU ниже по течению от него. Ортологи (если таковые имеются) ко всем генам в прогнозируемой TU были идентифицировано. Основываясь на двух пороговых значениях для сайтов связывания СРБ, мы сначала разделили наши прогнозы на следующие две категории: (1) TU, имеющие хотя бы один сильный сайт; и (2) TU, имеющие только слабые сайты. Потому что порог для сильных сайтов равен 2.6 биты выше среднего балла обучающих последовательностей и, вероятно, будут иметь несколько ложноположительных результатов (рис. 5а), мы были уверены в этих предсказаниях категории I даже без информации об ортологии. Прогнозы в категории II имеют только слабые сайты связывания и менее надежны, чем сайты категории I. Однако для некоторых прогнозов категории II требуются дополнительные существуют доказательства, подтверждающие их. Первый тип доказательств – это ортологическая информация.Если TU категории II имеет общие ортологические член(ы) с TU из другого генома, и последний также имеет сайт(ы) связывания CRP (слабый или сильный), мы помещаем такие ТУ категории IIA. Второй тип доказательств — наличие двух или более слабых сайтов связывания в регуляторной области. ТУ. Вероятность того, что два или более сайтов случайно окажутся в непосредственной близости друг от друга, довольно мала. Мы исследовали все слабые CRP сайты в E.геном coli . Для всех сайтов, расположенных выше TU, 12% находятся в пределах 100 нуклеотидов друг от друга. И наоборот, только 2% всех сайтов, расположенных внутри TU находятся в пределах 100 нуклеотидов друг от друга. Таким образом, близко расположенные тандемные сайты в регуляторной области более вероятны. быть истинными сайтами связывания, чем один слабый сайт в регуляторной области. Мы ставим все предсказания категории II с двумя или больше сайтов, но без информации об ортологии в категории IIB.Остальные прогнозы категории II, TU, имеющие только один слабый место связывания и отсутствие информации об ортологии, относятся к категории IIC. Эта категория имеет наименьшее количество доказательств, подтверждающих их. Таким образом, мы ожидаем высокий уровень ложноположительных результатов среди прогнозов категории IIC.

    Для ясности 46 ТЕ обучающей выборки и ТЕ H. influenzae , имеющих ортологи генов в обучающей выборке, были помещены в отдельную категорию.Для 46 ТЕ E. coli наши прогнозы сайтов связывания СРБ в значительной степени совпали с данными в RegulonDB, за исключением нескольких случаев, когда наш метод предсказанные дополнительные сайты связывания (таблица 3). Мы идентифицировали 23 TU H. influenzae , которые имеют ортологи генов в TU обучающей выборки. Из этих 23 TU только семь содержат сайты связывания СРБ в своей структуре. вышележащие районы (рис. 6; табл. 5)

    Рисунок 6.

    TU обучающей выборки, регулируемые CRP и FNR, и TU H. influenzae , содержащие ортологи генов в обучающей выборке. Гены в TU представлены прямоугольными прямоугольниками. Сайты связывания представлен квадратными прямоугольниками с серым прямоугольником, представляющим слабый сайт, и черным прямоугольником, представляющим сильный сайт. Расстояние между сайтом связывания и началом трансляции пропорционально реальному расстоянию в геномной последовательности.Генные ящики и расстояния между генами не пропорциональны. Отношения ортологии обозначены сплошной линией между двумя генами. вовлеченный. (+ и -) Цепь единицы транскрипции. ЕС, Е. coli ; HI, Н. influenzae; CRP, белок рецептора цАМФ; FNR, белок, регулирующий восстановление фумаратов и нитратов.

    Таблица 5.

    Haemophilus influenzae ТЕ, предположительно принадлежащие CRP регулону

    В категории I мы прогнозировали 62 и 49 ТЕ у E. coli и H. influenzae соответственно. В категории IIA мы предсказали 30 и 21 TU в E.coli и H. influenzae соответственно. Для обеих категорий прогнозируемые сайты CRP, их оценки и расположение относительно начала транскрипции приведены в Таблице 6 ( E. coli ) и Таблице 5 ( H. influenzae ). Категория IIB содержит 25 и 12 ТЕ в E. coli и H. influenzae соответственно. Это в общей сложности 117 и 82 новых ТЕ в штаммах E. coli и H. influenzae соответственно, которые, как мы достаточно уверены, относятся к регулону CRP.Категория IIC содержит 319 и 150 ТЕ в штаммах E. coli и H. influenzae соответственно. Эти прогнозы менее надежны, но, вероятно, содержат некоторые истинные регулируемые TU. Из-за ограничения пространства, мы не можем отобразить результаты в категориях IIB и IIC в этой статье. Эти данные доступны в качестве дополнительного материала на http://www.genome.org.

    Таблица 6.

    Escherichia coli ТЕ, предположительно принадлежащие к CRP Регулону

    На рисунке 7 мы изображаем структуры предсказанных TU, которые имеют общие ортологичные члены. Они из категорий I и IIA в обоих геномах. Сайты сильного и слабого связывания представлены черными и серыми квадратами соответственно.Таким образом, можно определить категорию которому принадлежит ТП по цветам квадратов узла привязки.

    Рисунок 7.

    Ортологичные пары TU категорий I и IIA, которые, по прогнозам, регулируются CRP и FNR. Показаны TU, регулируемые CRP. сначала следуют TU, регулируемые FNR. Обозначения и схемы рисунков соответствуют рисунку 6.CRP, белок рецептора цАМФ; FNR, белок, регулирующий восстановление фумаратов и нитратов.

    Новые члены ФНР Регулон

    Для выявления новые члены регулона ФНР.У нас есть девять обучающих наборов TU (таблица 4) и четыре H. influenzae TU, которые имеют ортогоны к генам в обучающем наборе. Среди этих четырех TU H. influenzae только одна все еще поддерживает регуляцию FNR (рис. 6; таблица 7). Остальные пять ТЕ E. coli не имеют обнаруживаемых ортологов в H. influenzae .

    Таблица 7.

    Haemophilus influenzae ТЕ, предположительно принадлежащие FNR Regulon

    Категория I содержит 10 и восемь ТЕ в Е.coli и H. influenzae соответственно, каждый из которых имеет по крайней мере один сильный сайт. Категория IIA содержит 0 и 2 ТЕ в штаммах E. coli и H. influenzae соответственно. Для обеих категорий прогнозируемые сайты FNR, их оценки и расстояния относительно начала транскрипции приведены в Таблице 7 ( H. influenzae ) и Таблице 8 ( E. coli ). Мы не обнаружили ТУ категории IIB в E. coli . В H. influenzae категории IIB содержится 2 ТЕ.Таким образом, это в общей сложности 10 и 12 новых ТЕ в E. coli и H. influenzae соответственно, которые, как мы достаточно уверены, относятся к регулону FNR. В категории IIC мы предсказали 70 E. coli и 79 H. influenzae TU, все из которых имеют только один сайт слабого связывания и не имеют информации об ортологии. Категории IIB и IIC доступны как дополнительные материал на http://www.genome.org. Опять же, структуры предсказанных TU, которые имеют общие ортологичные элементы, изображены на рисунке 7.

    Таблица 8.

    Escherichia coli ТЕ, предположительно принадлежащие FNR Regulon

    ОБСУЖДЕНИЕ

    Мы описали метод систематического поиска дополнительных членов бактериальных регулонов на основе информации как внутренние и внешние для данного генома.Внутренняя информация состоит из сайтов и структур связывания факторов транскрипции. нижестоящих TU. Внешняя информация представляет собой ортологическую связь между TU, полученную путем сравнения соответствующих полные наборы генных продуктов. Наш сравнительный подход состоит из следующих трех основных шагов: (1) получение распознавания ДНК паттерн для данного регуляторного белка; в этом исследовании мы использовали весовые матрицы для представления паттернов сайтов связывания; (2) предсказание сайтов связывания факторов транскрипции с использованием паттерна распознавания, полученного на первом этапе; и (3) предсказание TU в нисходящем направлении от сайтов связывания со второго шага и идентификации любых ортологов до членов предсказанных TU.При низких порогах транскрипция Ожидается, что предсказания сайта связывания фактора с помощью любого современного компьютерного алгоритма будут иметь относительно высокий уровень ложноположительных результатов. скорость из-за небольшого размера обучающей выборки и плохого сохранения некодирующих последовательностей. Однако включение ортопедической информации на третьем этапе повышает надежность наших выводов. Еще одним подкреплением предсказания регуляторных сайтов является использование информации о ТП.Соответствие между предсказанными ТЕ и назначением предполагаемых регуляторных участков будет помочь установить другие средства для оценки прогнозов и сделать их более надежными. Конечно, у нас нет статистики. модель для оценки того, насколько увеличивается вероятность сайта, когда сайт находится перед ортологичными TU. Однако, качественно, наша уверенность возрастает при наличии ортологической информации. Таким образом, мы, по крайней мере, уверены что прогнозы в категориях IIA и IIB имеют более низкий уровень ложноположительных результатов по сравнению с прогнозами в категории IIC.

    Чувствительность и специфичность наших прогнозов трудно определить, потому что мы не знаем полного набора генов которые регулируются CRP и FNR у любого вида. В E. coli у нас есть набор генов, которые, как известно, регулируются каждым белком на основе генетических и биохимических критериев, но это комплект конечно неполный. Для большинства генов мы просто не знаем, регулируются ли они CRP или FNR, и первичный Цель этой статьи состояла в том, чтобы выявить новые ТЕ, которые, вероятно, будут регулироваться этими факторами.Мы можем оценить чувствительность и измерения специфичности с использованием как известного набора регулируемых генов, так и некоторых предположений о распределении сайтов. с различными баллами. Например, мы знаем, что функциональные регуляторные сайты обычно находятся в области, которую мы определили как восходящая область, между -400 и +50 п.н. начала трансляции первого гена в TU. Редко, хотя изредка, функциональные сайты расположены либо выше, либо внутри TU.Мы также предполагаем, что если сайт связывания регуляторного белок находится в этой вышерасположенной области, тогда он, скорее всего, участвует в регуляции соседней TU. Мы установить порог, основанный на этих предположениях, для сильных сайтов таким образом, чтобы > 90% сайтов находились в регионах вверх по течению, и поэтому мы ожидаем очень мало ложноположительных предсказаний категории I. Это дает нам уверенность в новом предсказанном CRP-регулируемые TU категории I, 62 и 49 в E coli и H.influenzae соответственно, даже без дополнительных доказательств. Новые предсказания категории I для FNR: 10 и 8. Однако из известных TU E. coli , регулируемых этими белками, только 9 и 6 имеют сильные сайты, поэтому чувствительность, основанная только на пороговых значениях сильных сайтов, ниже. только 16,1% и 46,2% для СРБ и ФНР соответственно.

    Пороговое значение для слабых сайтов было выбрано таким, чтобы > 50% приходилось на области выше по течению.Помните, что даже эти слабые сайты имеют гораздо более высокие баллы, чем средний фоновый сайт (таблица 2), и что в большинстве регионов вверх по течению их нет, а любые случайно выбранные сайты встречаются только в 27% случаев в восходящие области, основанные на размерах двух наборов последовательностей. Следовательно, даже такие слабые сайты, предсказания категории II, вероятно, содержит много функциональных сайтов, но, несомненно, содержит и ложноположительные результаты. Поэтому ищем дополнительные доказательств, прежде чем считать их достоверными.Одним из дополнительных доказательств является то, что TU в H. influenzae , которые содержат ортологичные гены, также, по-видимому, регулируются фактором с сильным или слабым сайтом, который мы называем категория IIА. Другой тип — это два слабых сайта рядом друг с другом, которые мы называем категорией IIB. Мы знаем, что CRP может связываются кооперативно, поэтому близлежащие слабые сайты могут иметь комбинированную аффинность, сравнимую с отдельными сильными сайтами. Кроме того, поблизости пары слабых сайтов редко встречаются внутри TU, но относительно часто в восходящих регионах, как и ожидается от функциональных регулирующие сайты.Комбинируя категории IIA и IIB, мы прогнозируем 55 и 33 новых регулируемых СРБ TU в E. coli и H. influenzae . Дополнительные 319 и 150 ТЕ относятся к категории IIC, некоторые из которых, вероятно, настоящие, а некоторые — ложные. Для FNR мы прогнозируем 0 и 4 новых ТЕ в E. coli и H. influenzae из категорий IIA и IIB, а также имеются дополнительные 70 и 79 ТЕ категории IIC.

    Мы можем оценить чувствительность нашего подхода, подсчитывая известные ТЕ для каждого регулона.Для 56 ТЕ в регулоне CRP которые мы извлекли из RegulonDB, только девять из них относятся к категории I. Еще 41 имеют слабые сайты и поэтому относят к категории II, что дает общую чувствительность 89,3% (50/56). Однако среди 41 ТП только со слабыми сайтами только 16 относятся к категориям IIA и IIB (шесть и 10 соответственно), а остальные 25 относятся к категории IIC. Поэтому наша уверенная прогнозы, объединяющие категории I, IIA и IIB, учитывают только 25 известных сайтов, чувствительность всего 44.6%. Если же пропорции существуют во всем геноме, тогда многие сайты категории IIC будут функциональными регуляторными сайтами CRP; Однако, мы не можем определить, какие из них верны, а какие нет, исходя из текущих данных. Аналогичные результаты получаются для ФНР, в котором категории I и II вместе составляют 11 из 13 известных ТЕ с чувствительностью 84,6%, но пять из них относятся к категории ИИК.

    Конечным результатом нашего анализа является предсказание 116 и 10 новых CRP и FNR TU в E.coli , которые мы считаем очень надежными, поскольку они относятся к категориям I, IIA и IIB. Это явно не все гены. регулируется этими факторами, потому что в таких прогнозах отсутствуют некоторые из известных ТЕ. Функциональные сайты могут быть упущены потому что эти факторы взаимодействуют с каким-то другим фактором, не включенным в анализ, или потому что вес матрица не является достаточно хорошим дескриптором специфичности связывания белков, чтобы получить все функциональные сайты.Многие из отсутствующие сайты можно найти в прогнозах категории IIC, но эти прогнозы, вероятно, также содержат много ложных прогнозов, и мы не включаем их в наш надежный набор. Тем не менее, вычислительный подход, который мы применили в этой статье, значительно увеличил набор TU, которые, вероятно, будут регулироваться этими факторами в E. coli с высокой, но не идеальной чувствительностью. Кроме того, мы делаем 82 и 12 надежных прогнозов TU, регулируемых CRP и FNR. в Х.influenzae , большинство из которых ранее не были идентифицированы как члены этих регулонов.

    Интересно, что в RegulonDB существует один экспериментально подтвержденный сайт CRP для E. coli оперона glpABC. Однако это слабый сайт (6,2 бита). В этом исследовании мы обнаружили еще один сильный сайт CRP для этого оперона. (17,25 бит; таблица 6). Другим интересным случаем является оперон fucAO E. coli .До этого исследования существовали только генетические данные, подтверждающие регуляцию этого оперона с помощью CRP. В нашем исследовании мы идентифицировали три сайта связывания CRP выше fucA (рис. 7; таблица 6), что является дополнительным доказательством предыдущих наблюдений.

    В E. coli ген ansB находится под двойной регуляцией CRP и FNR (Scott et al. 1995). Эта совместная регуляция обоими факторами транскрипции может быть важна для достижения оптимальной экспрессии генов.На основе Согласно нашему анализу, ansB может регулироваться только CRP в H. influenzae , поскольку сайт FNR с наивысшим баллом в регуляторной области ansB H. influenzae составлял всего 9,74 бита. Это намного ниже порога слабого сайта для FNR, но все же может быть функциональным сайтом. Два других TUs, ung и yfiD (его ортологом в H. influenzae является HI0017), по-видимому, регулируются дважды в обоих геномах. Интересно, что для обоих TU сайт CRP совпадает с сайтом FNR. в обоих геномах с E.coli TU, имеющих дополнительный сайт FNR. Возможно, эти сайты верны только одному из регуляторов и являются ложноположительными. для другого регулятора. И наоборот, мы не можем исключить возможность того, что эти сайты действительно признаны обоими регулирующими органами. потому что некоторые сайты, которые могут связывать CRP, также могут связывать FNR (Sawers et al. 1997).

    Отрицательная ауторегуляция весьма преобладает у E.coli , и его можно рассматривать как играющего гомеостатическую роль для регуляторных генов (Thieffry et al. 1998b). Основываясь на наших результатах, CRP, по-видимому, не регулируется самостоятельно у H. influenzae (сайт CRP с наивысшей оценкой имел оценку 4,6 бита). И наоборот, FNR, по-видимому, ауторегулируется у H. influenzae.

    На основании сравнительного анализа регулонов CRP и FNR в двух геномах мы заметили три типа структурных изменений. в оперонах, которые подчиняются одному и тому же способу регуляции.Первый тип включает вставку или удаление отдельных генов. в консервативных оперонах. Примеры в E. coli включают опероны glpTQ (glpT в H. influenzae , рис. 6), fnr (fnr-HI1426 в H. influenzae , рис. 6) и b2736-b2737 (HI1010-HI1011- HI1012-HI1013 в H. influenzae , рис. 7.).

    Второй тип изменений заключается в распаде одного оперона в одном геноме на несколько более мелких в другом геноме.Не все более мелких оперонов сохраняют свою регуляцию одним и тем же регулятором. Например, оперон xylFGHR E. coli разбит в H. influenzae на два оперона, xylFGH и xylR (фиг. 7). Только xylFGH поддерживает регуляцию CRP у H. influenzae . Белковые продукты генов xylF, G и H составляют высокоаффинную транспортную систему ксилозы в обоих геномах. xylR кодирует регуляторный белок (Sumiya et al.1995). В E. coli xylR действует как активатор транскрипции для оперона xylFGHR, и его экспрессия регулируется CRP (Song and Park 1997). В H. influenzae регуляция xylR может осуществляться другим регулятором. В качестве альтернативы, это может быть авторегулирование. Если это В данном случае это еще один пример несвязанной и связанной регуляции транскрипции у двух бактерий. различные динамические последствия (Hlavacek and Savageau, 1996).Другой пример этого второго типа изменений включает оперон E. coli galETKM. Тот же самый оперон разделен на две части в H. influenzae : galE и galTKM (рис. 6). Опять же, только galTKM все еще регулируется CRP в H. influenzae .

    В-третьих, также наиболее распространенным типом изменений в ходе эволюции регулона является потеря членов регулона E. coli в геноме H. influenzae .Примеры включают опероны caiTABCDE, malEFG и narGHJI. Tatusov et al. (1996) предположили, что общий предок E. coli и H. infuenzae мог иметь геном промежуточного размера. Последующая эволюция могла идти в противоположных направлениях — в сторону редукции размера генома за счет делеции генов и целых единиц транскрипции в линии Haemophilus и диверсификации регуляторных и транспортных функций за счет дупликации генов в линии E.coli (Татусов и др., 1996). В результате снижение членов регулона CRP и FNR может быть результатом дегенеративной эволюции H. influenzae. Паразитический образ жизни H. influenzae может потребовать менее сложного метаболизма, чтобы справиться с изменениями окружающей среды. Однако как часть общего числа генов оба вида, по-видимому, имеют регулоны одинакового размера.

    Расположение регуляторных сайтов вдоль генома оказывает явное влияние на то, как происходит регуляция посредством этих сайтов (Gralla and Collado-Vides 1996).Интересен вопрос, имеют ли регуляторные сайты ортологичных генов идентичные или близкие положения, т.е. заключается в том, остается ли расстояние между регуляторными сайтами и их регулируемыми промоторами более или менее неизменным между бактериальными разновидность. Чтобы получить такую ​​информацию, нам потребуется достаточно точный метод предсказания промоторов в этих организмах. К сожалению, современные методы предсказания промотора в этом отношении неудовлетворительны.Для решения этой проблемы необходима дальнейшая работа очень интересный вопрос.

    Мы заметили, что некоторые из предсказанных нами TU имеют довольно дистальные сайты связывания. Потому что мы сообщаем положение сайта привязки по отношению к началу трансляции первого нижестоящего гена, эти большие расстояния могут быть просто результатом существования длинной 5′-нетранслируемой области. И наоборот, они могли бы быть истинными дистальными участками, даже если бы наши измерения были основаны на транскрипции. Начало.Из-за глобального характера регулирующих функций TU, регулируемые CRP и FNR, часто имеют еще один локальный, выделенный регулятор, такой как LacI для оперона lac и GalR для оперона gal. Таким образом, мы подозреваем предсказанные здесь TU с дистальными участками. продемонстрирует регуляцию дополнительными белками.

    Подход, который мы использовали в этой статье, выявил множество новых генов, которые, как мы предполагаем, регулируются белками CRP и FNR. в Э.coli и H. influenzae . Совокупность данных, полученных на основе оценок сайтов и сравнительного анализа, дает нам высокую уверенность во многих из этих прогнозов. Но это явно только первый шаг. Можно включить больше видов бактерий и изучить гораздо больше регулонов, хотя регулоны с несколькими известными членами более проблематичны из-за небольшого размера выборки. Точное предсказание единиц транскрипции имеет решающее значение для успеха такого подхода, так как опероны часто перестраиваются в ходе эволюции, а общие регуляторные сайты могут располагаться на больших и переменных расстояниях от ортологичных пар генов.В этой работе многие этапы выполнялись вручную, в этом тщательное изучение некоторых результатов использовалось для ограничения дальнейшего анализа. Опыт, полученный в ходе этой работы, позволяют нам разрабатывать более полностью автоматизированные процедуры, которые можно применять к большему количеству регуляторных систем у большего количества видов в кратчайшие сроки. и надежный подход.

    МЕТОДЫ

    Данные последовательности и программы

    Экспериментально охарактеризовано (в основном методом ДНК-футпринтинга) E.coli CRP- и FNR-связывающие последовательности были извлечены из базы данных RegulonDB (Salgado et al. 2000a). Полные последовательности генома E. coli и H. influenzae были загружены из GenBank (Benson et al. 1999). Матрицы весов были построены с помощью CONSENSUS (Hertz and Stormo 1999), который генерирует оптимальное множественное выравнивание последовательностей без пропусков с заданной шириной. Кроме того, программа сообщает о статистическая значимость сгенерированного множественного выравнивания последовательностей.Учитывая матрицу весов, ищет фактор транскрипции сайты связывания определяли с использованием PATSER (Hertz et al. 1990). PATSER оценивает каждое возможное положение сайта связывания в последовательности, используя назначенную матрицу весов, и возвращает баллы и позиции всех сайтов выше заданного пользователем порога. Множественные выравнивания белковых последовательностей были построены с использованием программа CLUSTALX (Thompson et al.1997). Поиски в базе данных белковых последовательностей проводились с использованием программы BLASTP с пробелами (Altschul et al. 1997). Все поиски проводились в базе данных неизбыточных белковых последовательностей Национального центра биотехнологической информации. Сравнения последовательностей между E. coli CRP и FNR проводили с использованием программы BestFit (Wisconsin Package Version 10.0; Genetics Computer Group). Логотипы Sequence были созданы с использованием веб-интерфейса. (С.E. Brenner, http://www.bio.cam.ac.uk/cgi-bin/seqlogo/logo.cgi) к программе MAKELOGO Шнайдера (Schneider and Stephens 1990). Остальная часть анализа была выполнена с использованием специальных сценариев PERL (Wall et al., 1996).

    Подготовка тренировочного набора последовательностей

    Текущая версия базы данных RegulonDB (версия 3.0) содержит 80 экспериментально проверенных E.coli CRP-связывающие последовательности из 56 TU (поскольку некоторые из этих 56 TU имеют несколько сайтов связывания CRP, количество сайтов превышает количество ТП). Мы ожидаем, что некоторые из этих 80 сайтов являются слабыми сайтами связывания CRP. Предположительно, СРБ связывает эти слабые сайты. благодаря взаимодействию с другими регуляторными белками. Слабые сайты были отфильтрованы из нашей обучающей выборки с помощью следующего процедуры. На первом этапе мы запустили CONSENSUS на 80 последовательностях связывания и создали исходную матрицу весов.Затем PATSER использовали для подсчета исходных 80 последовательностей связывания с использованием весовой матрицы, созданной на первом этапе. После этого начального Шаг, мы выбрали только последовательность с наивысшей оценкой из каждой TU для дальнейшей обработки. Это дало нам 48 сайтов, представляющих 53 ТЕ (все сайты из трех из 56 ТЕ были отклонены КОНСЕНСУСОМ и, следовательно, не включены). Из-за существования расходящихся TU количество сайтов меньше, чем количество TU. среднее значение и стандартное отклонение оценок этих 48 сайтов составляли 13,1 и 3,6 бита соответственно. Для нашего последнего тренировочного набора мы исключили из 48 сайтов все сайты с оценками, которые более чем на одно стандартное отклонение ниже среднего, то есть 9,5. биты. В итоге мы получили 42 последовательности в обучающем наборе, представляющие 46 TU.

    Текущая версия базы данных RegulonDB содержит 17 экспериментально проверенных E.coli FNR-связывающие последовательности из 13 ТЕ. Мы применили те же процедуры к этим 17 последовательностям, чтобы создать обучающую выборку. Мы закончили с девятью последовательностями в нашей обучающей выборке, представляющей девять TU. Среднее значение и стандартное отклонение этих девяти последовательностей были 19,8 и 4,5 бит соответственно.

    Прогнозирование мест связывания факторов транскрипции

    На первом этапе нашего анализа весовые матрицы для сайтов связывания CRP и FNR были созданы с помощью CONSENSUS с использованием последовательностей нашего обучающего набора (42 для CRP и девять для FNR).Впоследствии опубликованы аннотации всех открытых Рамки считывания (ORF) в E. coli (Blattner et al. 1997) и H. influenzae (Fleischmann et al. 1995) были использованы для создания двух наборов предполагаемых регуляторных последовательностей (по одному для каждого генома), охватывающих 400 nt перед и 50 nt вниз по течению от начала каждого ORF. Эта длина была выбрана из известного распределения большой коллекции регуляторные сайты в промоторах ς 70 (Gralla and Collado-Vides 1996).Затем PATSER использовали для сканирования наборов регуляторных последовательностей для идентификации потенциальных сайтов связывания с использованием сгенерированных весовых матриц. на первом этапе (Герц и Стормо, 1999; Герц и др., 1990). Сообщалось о потенциальных сайтах связывания, оценка которых превышала выбранные пороговые значения. В конце концов, информация о сайте привязки была объединена с ортологическими отношениями между TU для прогнозирования новых членов регулонов CRP и FNR. Мы классифицировали сайты связывания на две категории, основанные на их расположении по отношению к ТЕ ниже по течению или вокруг него (1) участки, расположенные в регулятивных регион ТУ; и (2) сайты, расположенные в пределах TU.Последняя категория включает два случая: внутри генов ТЕ и внутри восходящая область внутреннего гена.

    Определение ортологии между

    E. coli и H. influenzae   Гены

    Fitch впервые ввело термин «ортолог» для генов, полученных в результате видообразования (Fitch, 1970).В настоящее время не существует простого и совершенного метода определения ортологических отношений из-за сложности событий. во время эволюции генома, таких как дупликация генов, потеря генов и горизонтальный перенос генов (Huynen and Bork 1998). Для нашего исследования мы использовали минимальное определение ортологии, описанное Huynen and Bork (1998): (1) ортологичные ORF между двумя сравниваемыми геномами должны быть взаимно наиболее похожими ORF; (2) сходство последовательностей между ОРС должны быть статистически значимыми.В этой статье сходство последовательностей было рассчитано с помощью программы BLASTP (версия 2.0; Altschul et al., 1997). Любое выравнивание со значением E 1e-15 считалось важным для нашей цели. и (3) сходство последовательностей распространяется по крайней мере на 60% одного из гены.

    Прогнозирование единиц транскрипции

    Прогноз TU описан для E.coli от Salgado et al. (2000б). Метод основан на различиях между парами соседних генов в оперонах и парами соседних генов на границах ТУ. Изучаемые различия касались расстояний между генами и их функциональных взаимосвязей, причем последние являлись обновление функциональной классификации, описанной Моникой Райли (Riley 1993; Riley and Labedan 1996). Здесь, чтобы применить метод к H. influenzae , мы унаследовали функциональную классификацию для E.coli , а затем применил метод предсказания ко всему геному H. influenzae , разделив его на предполагаемые ТЕ. Таким образом, мы получили наборы ТЕ, которые можно сравнивать между организмами при регуляторный сайт был обнаружен рядом с ортологичными генами, которые, в свою очередь, могут лежать внутри аналогичных TU.

    Благодарности

    Мы благодарим сотрудников лабораторий Stormo и Collado-Vides за полезные обсуждения.Мы благодарим трех анонимных рецензентов за их Комментарии. Эта работа была поддержана грантом HG-00249 от Национального института здравоохранения (GDS), грантом 0028 от Conacyt (JC-V.), и Грант DE-FG02-98ER62558 Министерства энергетики США (J.C.-V.).

    Затраты на публикацию этой статьи были частично покрыты за счет оплаты страниц. Таким образом, эта статья должна быть настоящим помечены как «реклама» в соответствии с разделом 1734 18 USC исключительно для обозначения этого факта.

    Сноски

    • ↵3 Автор, ответственный за переписку.

    • ЭЛЕКТРОННАЯ ПОЧТА stormo{at}ural.wustl.edu; ФАКС (314) 362-7855.

    • Статья и публикация находятся на сайте www.genome.org/cgi/doi/10.1101/gr.149301.

      • Поступила в редакцию 24 мая 2000 г.
      • Принят 8 февраля 2001 г.
    • Лабораторный пресс Cold Spring Harbour

    Задержка менструации | Пациент

    Бывают случаи, когда некоторые женщины хотят отсрочить менструацию.Например, менструация может наступить в неудобное для них время, например, когда они собираются в отпуск, на экзамен и т. д.

    Женщины, принимающие комбинированные оральные контрацептивы

    Если вы принимаете комбинированные оральные контрацептивы (КОК) с фиксированной дозой (часто называемые просто «таблетками»), просто начните принимать следующую упаковку без обычного семидневного перерыва. Принимать две пачки подряд таким образом безопасно, если делать это время от времени. Вам по-прежнему нужен только семидневный перерыв в конце этих двух пакетов.

    Если вы принимаете трехфазные или двухфазные таблетки, вам нужно будет принять последнюю фазу таблеток из второй упаковки сразу после окончания приема первой упаковки. В качестве альтернативы вы можете перейти на таблетку с фиксированной дозой.

    Если вы не уверены, какую таблетку принимаете, обратитесь к врачу, медсестре или фармацевту. Чаще всего используются таблетки с фиксированной дозой. Если он трехфазный или двухфазный, обычно цвет таблетки или упаковки не будет одинаковым в течение месяца.

    Как это работает?

    У женщин, принимающих «таблетки», не бывает нормальных менструаций. Скорее, это кровотечение отмены, которое возникает, когда эстроген в таблетке не принимается. Гормоны в таблетках помогают поддерживать слизистую оболочку матки (матки). Кровотечение отмены обычно не возникает до тех пор, пока прием таблетки не будет остановлен и уровень гормона в организме не упадет (обычно раз в месяц в семидневный перерыв между упаковками таблеток).

    Если вы еще не принимаете «таблетки», вы можете подумать о том, чтобы начать их принимать, если в будущем они могут стать для вас подходящим противозачаточным средством.Вам нужно будет начать его за несколько недель до отпуска, чтобы убедиться, что у вас не будет менструации, когда вы будете в отъезде.

    Женщины, не принимающие комбинированные оральные контрацептивы

    Если вы не принимаете КОК («таблетки»), вам могут назначить гормональную таблетку (прогестаген), норэтистерон. Доза составляет одну таблетку (5 мг) три раза в сутки. Вы начинаете за три дня до начала менструации. Его можно продолжать до тех пор, пока у вас не возникнет менструация. Ваш период обычно начинается через 2-3 дня после его остановки.При необходимости его можно принимать до 3-4 недель. Это только для использования время от времени для особых мероприятий, а не для регулярного приема.

    Обычно принимать норэтистерон безопасно. Однако, если у вас есть повышенный риск тромбоза глубоких вен (ТГВ), этот метод может вам не подойти. Ваш врач сможет обсудить это с вами. У некоторых женщин наблюдаются побочные эффекты, такие как вздутие живота, расстройство желудка, дискомфорт в груди и снижение полового влечения (либидо).

    Вместо норэтистерона может быть рекомендован другой гормональный (прогестагенный) препарат, называемый медроксипрогестероном, поскольку он имеет меньший риск вызвать ТГВ.

    Как это работает?

    Норэтистерон является гормоном прогестагена. Прогестагены — это гормоны, поддерживающие слизистую оболочку матки (матки). В норме перед менструацией в организме падает уровень прогестагенного гормона. Когда он падает ниже определенного уровня, слизистая оболочка матки отторгается в виде менструального цикла. Принимая таблетки норэтистерона (прогестаген), слизистая оболочка матки поддерживается до тех пор, пока таблетка не будет остановлена. Примечание : норэтистерон, принятый таким образом, не является противозачаточным средством.

    Streptococcus mutans справляется с тепловым стрессом за счет множественных регулонов транскрипции, модулирующих вирулентность и энергетический метаболизм к ксилиту и сахарозе. Int J Oral Sci. 6(4):195–204 (2014).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Лемос, Дж.A., Quivey, R.G., Jr., Koo, H. & Abranches, J. Streptococcus mutans: новая грамположительная парадигма? Микробиология. 159, 436–445 (2013).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Лемос, Дж. А., Абранчес, Дж. и Берне, Р. А. Реакция кариесогенных стрептококков на стрессы окружающей среды. Curr выпускает Mol Biol. 7, 95–107 (2005).

    ПабМед Google ученый

  • Нарберхаус, Ф.Трансляционный контроль генов теплового шока и вирулентности бактерий с помощью чувствительных к температуре мРНК. РНК биол. 7, 84–89 (2010).

    КАС пабмед Google ученый

  • Котте О., Заугг Дж. Б. и Хайнеманн М. Бактериальная адаптация посредством распределенного восприятия метаболических потоков. Мол Сист Биол. 6, 355 (2010).

    ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

  • Херроу, Дж., Rotskoff, G., Luo, Y., Roux, B. & Crosson, S. Структурная основа белкового переключателя-партнера, который регулирует общую реакцию альфа-протеобактерий на стресс. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E1415–1423 (2012).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Лим Б. и др. Фактор транскрипции теплового шока sigma(32) кооптирует частицу распознавания сигнала для регуляции белкового гомеостаза в E. coli .PLoS биол. 11, e1001735, (2013).

    ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

  • Elsholz, A.K., Michalik, S., Zulke, D., Hecker, M. & Gerth, U. CtsR, главный грамположительный регулятор контроля качества белка, чувствует тепло. EMBO J. 29, 3621–3629 (2010).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Грисволд, А. Р., Джеймсон-Ли, М.и Берне, Р. А. Регуляция и физиологическое значение системы агматиндезиминазы Streptococcus mutans UA159. J Бактериол. 188, 834–841 (2006).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Sheng, J. & Marquis, R. E. Повышенная кислотоустойчивость оральных стрептококков при летальных значениях pH, связанная с кислотоустойчивым катаболизмом и активностью АТФ-синтазы. FEMS Microbiol Lett. 262, 93–98 (2006).

    КАС пабмед Google ученый

  • Fozo, E. M. & Quivey, R. G., Jr. Изменения в профиле жирных кислот мембраны Streptococcus mutans повышают выживаемость в кислой среде. Appl Environ Microbiol. 70, 929–936 (2004).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Сюй, П. и др. Геном условно-патогенного микроорганизма Streptococcus sanguinis.J Бактериол. 189, 3166–3175 (2007).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Смит Э. Г. и Спатафора Г. А. Регуляция генов у S. mutans: комплексный контроль в сложной среде. Джей Дент Рез. 91, 133–141 (2012).

    КАС пабмед Google ученый

  • Айдич, Д. и др. Последовательность генома Streptococcus mutans UA159, кариесогенного стоматологического патогена.Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14434–14439 (2002).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Лян В.Д. и др. Профилирование экспрессии генов Clostridium botulinum в условиях теплового шока. Биомед Рез Инт. 2013, 760904 (2013).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Новичков П.С. и др. RegPrecise 3.0 — ресурс для исследования регуляции транскрипции у бактерий в масштабе генома.Геномика ВМС. 14, 745 (2013).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Xue, X. L., Tomasch, J., Sztajer, H. & Wagner-Dobler, I. Дельта-субъединица РНК-полимеразы, RpoE, является глобальным модулятором адаптации Streptococcus mutans к окружающей среде. J Бактериол. 192, 5081–5092 (2010).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Леунг, В., Ajdic, D., Koyanagi, S. & Levesque, C.M. На образование персистеров Streptococcus mutans, индуцированное феромоном пептида, чувствительного к кворуму, влияет регулятор LexA. J Бактериол. 197, 1083–1094 (2015).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Ву, К. и др. Регуляция экспрессии оперона ciaXRH и идентификация регулона CiaR у Streptococcus mutans. J Бактериол. 192, 4669–4679 (2010).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Jayaraman, G.C., Penders, J.E. & Burne, R.A. Транскрипционный анализ генов Streptococcus mutans hrcA, grpE и dnaK и регуляция экспрессии в ответ на тепловой шок и подкисление окружающей среды. Мол микробиол. 25, 329–341 (1997).

    КАС пабмед Google ученый

  • Лемос, Дж.А. и Берне, Р. А. Регуляция и физиологическое значение ClpC и ClpP у Streptococcus mutans. J Бактериол. 184, 6357–6366 (2002).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Лемос, Дж. А., Чен, Ю. Ю. и Берне, Р. А. Генетический и физиологический анализ оперона groE и роли репрессора HrcA в регуляции гена стресса и толерантности к кислоте у Streptococcus mutans. J Бактериол. 183, 6074–6084 (2001).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Лемос, Дж. А., Лузардо, Ю. и Берне, Р. А. Физиологические эффекты принудительного подавления экспрессии dnaK и groEL у Streptococcus mutans. J Бактериол. 189, 1582–1588 (2007).

    КАС пабмед Google ученый

  • Хоу, X. Х., Чжан, Дж. К., Сонг, X. Ю., Ма, X. B. и Чжан, С. Ю. Вклад ClpP в устойчивость к стрессу и свойства вирулентности Streptococcus mutans.J Основная микробиол. 54, 1222–1232 (2014).

    КАС пабмед Google ученый

  • Свенсатер Г., Шогрин Б. и Гамильтон И. Р. Множественные реакции на стресс у Streptococcus mutans и индукция общих и стресс-специфических белков. Микробиология. 146, 107–117 (2000).

    КАС пабмед Google ученый

  • Тремблей, Ю. Д., Ло, Х., Ли, Ю. Х., Гальперин, С.А. и Ли, С.Ф. Экспрессия двухкомпонентной регуляторной системы Streptococcus mutans VicRK зависит от pH и фазы роста и контролируется трехкомпонентной регуляторной системой LiaFSR. Микробиология. 155, 2856–2865 (2009).

    КАС пабмед Google ученый

  • Senadheera, M.D. et al. Система передачи сигнала VicRK у Streptococcus mutans влияет на экспрессию gtfBCD, gbpB и ftf, формирование биопленки и развитие генетической компетентности.J Бактериол. 187, 4064–4076 (2005).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Sudhakar, P. et al. Построение и проверка сети транскрипционного регуляторного ответа Streptococcus mutans при лечении ингибитором биопленки каролактоном. Геномика ВМС. 15, 739 (2014).

    Центральный пабмед Google ученый

  • Канехиса М.и другие. От геномики к химической геномике: новые разработки KEGG. Нуклеиновые Кислоты Res. 34, Д354–357 (2006 г.). Доступно по адресу: http://www.genome.jp/kegg/. (Доступ: 74.0, апрель 2015 г.).

    КАС пабмед Google ученый

  • Vadeboncoeur, C. & Pelletier, M. Система фосфоенолпируват:сахар-фосфотрансфераза пероральных стрептококков и ее роль в контроле метаболизма сахара. FEMS Microbiol Rev. 19, 187–207 (1997).

    КАС пабмед Google ученый

  • Айдич, Д.& Chen, Z. Новая фосфотрансферазная система Streptococcus mutans отвечает за транспорт углеводов с -1,3-связью. Мол Оральный микробиол. 28, 114–128 (2013).

    КАС пабмед Google ученый

  • Дос Сантос, Н. Взаимосвязь между составом зубного налета, ежедневным воздействием сахара и кариесом молочных зубов. Кариес рез. 37, 236–236 (2003).

    Google ученый

  • Боуэн, В.Х. и Ку, Х. Биология глюкозилтрансфераз, полученных из Streptococcus mutans: роль в формировании внеклеточного матрикса кариесогенных биопленок. Кариес рез. 45, 69–86 (2011).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Лоо, С.Ю., Митракул, К., Восс, И.Б., Хьюз, С.В. и Ганешкумар, Н. Участие индуцибельного оперона фруктозофосфотрансферазы в формировании биопленки Streptococcus gordonii. J Бактериол.185(21), 6241–54 (2003).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Baker, J. L. et al. NADH-оксидаза Streptococcus mutans находится на пересечении перекрывающихся регулонов, контролируемых уровнями кислорода и NAD(+). J Бактериол. 196, 2166–2177 (2014).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Митчелл, А. и др. Адаптивное прогнозирование изменений окружающей среды микроорганизмами.Природа. 460, 220–224 (2009).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед Google ученый

  • Шенхар Ю., Расули А., Биран Д. и Рон Э. З. Адаптация кишечной палочки к повышенным температурам включает изменение стабильности транскриптов генов теплового шока. Окружающая среда микробиол. 11, 2989–2997 (2009).

    КАС пабмед Google ученый

  • Юзефчук С. и др.Метаболомный и транскриптомный стресс-ответ Escherichia coli. Мол Сист Биол. 6, 364 (2010).

    ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

  • Чакраборти А., Мукерджи С., Чаттопадхай Р., Рой С. и Чакрабарти С. Конформационная адаптация белка сигма 32 E. coli в ответ на тепловой шок. J Phys Chem B. 118, 4793–4802 (2014).

    КАС пабмед Google ученый

  • Редер А., Pother, DC, Gerth, U. & Hecker, M. Модулятор общей реакции на стресс, MgsR, Bacillus subtilis подвергается многочисленным и сложным механизмам контроля. Окружающая среда микробиол. 14, 2838–2850 (2012).

    КАС пабмед Google ученый

  • Казмерчак, М. Дж., Видманн, М. и Бур, К. Дж. Альтернативные сигма-факторы и их роль в вирулентности бактерий. Microbiol Mol Biol Rev. 69, 527–543 (2005).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Сонг, Л.и другие. Полногеномное исследование двухкомпонентных систем передачи сигнала в восьми недавно секвенированных штаммах мутантных стрептококков. Геномика ВМС. 13, 128 (2012).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • van Die, I.M., Bergmans, H.E. & Hoekstra, WP. Transformation in Escherichia coli: исследования роли теплового шока в индукции компетентности. J Gen Microbiol. 129, 663–670 (1983).

    КАС пабмед Google ученый

  • Мерфи, М.E. Семейство HSP70 и рак. Канцерогенез. 34, 1181–1188, (2013).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Фризен, Дж. А., де Брюйн, Ф. Дж. и Нуссляйн, К. Реакция ризобий на высыхание в связи с осмотическим стрессом, кислородом и температурой. Appl Environ Microbiol. 73, 3451–3459 (2007).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Тао, Л., Чатторадж П. и Бисвас И. Регуляция CtsR у грамположительных бактерий с дефицитом mcsAB. J Бактериол. 194, 1361–1368 (2012).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Дэн, Д. М., тен Кейт, Дж. М. и Криелаард, В. Адаптивная реакция Streptococcus mutans на продукты для ухода за полостью рта: участие сериновой протеазы ClpP. Eur J Oral Sci. 115, 363–370, (2007).

    КАС пабмед Google ученый

  • Флери, Б.и другие. Транскриптомные и метаболические реакции золотистого стафилококка на воздействие сверхфизиологических температур. БМС микробиол. 9, 76, (2009).

    ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

  • Nobbs, A.H., Lamont, R.J. & Jenkinson, H.F. Прилипание и колонизация Streptococcus. Microbiol Mol Biol Rev. 73, 407–450 (2009).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Ку, Х., Xiao, J. & Klein, MI. Матрикс внеклеточных полисахаридов — часто забываемый фактор вирулентности в исследованиях пероральной биопленки. Int J Oral Sci. 1, 229–234 (2009).

    ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

  • Ку Х., Фальсетта М. Л. и Кляйн М. И. Экзополисахаридная матрица: детерминанта вирулентности кариесогенной биопленки. Джей Дент Рез. 92, 1065–1073 (2013).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Лю, К.и другие. Гиперосмотическая реакция Streptococcus mutans: от микроскопической физиологии к транскриптомному профилю. БМС микробиол. 13, 275 (2013).

    ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

  • Хонг, Ф. и др. RankProd: пакет биокондукторов для обнаружения дифференциально экспрессируемых генов в метаанализе. Биоинформатика. 22, 2825–2827, (2006).

    КАС пабмед Google ученый

  • Субраманиан, А., Kuehn, H., Gould, J., Tamayo, P. & Mesirov, JP. GSEA-P: настольное приложение для анализа обогащения набора генов. Биоинформатика. 23, 3251–3253 (2007).

    КАС пабмед Google ученый

  • Ли, М.Ю., Хуанг, Р.Дж., Чжоу, X.Д. и Грегори, Р.Л. Роль сортазы в Streptococcus mutans под действием никотина. Int J Oral Sci. 5, 206–211 (2013).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Табоада, Б., Verde, C. & Merino, E. Высокоточный метод прогнозирования оперонов, основанный на оценках базы данных STRING. Нуклеиновые Кислоты Res. 38, e130 (2010).

    ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

  • Xu, X., Zhou, X.D. & Wu, C.D. Чайный катехин эпигаллокатехин галлат подавляет кариесогенные факторы вирулентности Streptococcus mutans. Противомикробные агенты Chemother. 55, 1229–1236 (2011).

    КАС пабмед Google ученый

  • Ченг Л.и другие. Антибактериальные нанокомпозиты аморфного фосфата кальция с диметакрилатом четвертичного аммония и наночастицами серебра. Дент Матер. 28, 561–572, (2012).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Ляо, С. и др. Внеклеточная ДНК Streptococcus mutans активируется во время роста в биопленках, активно высвобождается через мембранные везикулы и находится под влиянием компонентов механизма секреции белка.J Бактериол. 196, 2355–2366 (2014).

    ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

  • Xu, X., Zhou, X.D. & Wu, C.D. Галлат эпигаллокатехина катехина чая ингибирует образование биопленки Streptococcus mutans путем подавления генов gtf. Arch Oral Biol. 57, 678–683 (2012).

    КАС пабмед Google ученый

  • Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


    Настройка браузера на прием файлов cookie

    Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:

    • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
    • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файл cookie.
    • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
    • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
    • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

    Почему этому сайту требуются файлы cookie?

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


    Что сохраняется в файле cookie?

    Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

    Как правило, в файле cookie может храниться только та информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.

    2022 © Все права защищены.