Расшифровка ктг 35 недель: Расшифровка КТГ 35 неделя беременности — Гинекология — 21.06.2013

Содержание

Результаты КТГ, 35 недель — 20 ответов

У нас очень странно в ЖК устроено, на сколько я знаю в других ЖК каждый прием врача после 34 недели сопровождается КТГ…мне же пришлось выпрашивать талон у своего гинеколога, потому что мой врач(который будет принимать роды ) говорил позвонить с результатами!

Перед КТГ съела шоколадную конфету, боялась что мася будет спать!Я знала, что ктг делается либо на боку либо на спине!Меня уложили на спину, я стала переживать, потому что именно на спине мой дитенок утихает, а я очень боялась плохих показателей, не хочу ложиться в РД раньше чем отойдут воды!

Прикрепили датчики, нашли моё любимое второе сердечко, которое бьется как паравозик…сначала мне было страшно, мне казалось что стук сердца очень тревожен, а потом я привыкла к этому звуку и он стал моим родным и любимым!

Сначала она не хотела подавать признаки своей жизнедеятельности, потом очень очень вяло несколько раз пошевелилась, но совсем слегка, ну я все равно нажимала на помпу…Когда закончился сеанс я спросила у врача все ли нормально…она сказала что да, что баллов я набрала

11, что это и нужно сказать врачу! Я спросила про свое старение плаценты, она сказала, что все пока хорошо!

Ну хорошо, что все хорошо!!!!!

И вот что нашла в интернете!

КТГ плода — расшифровка: как ставятся баллы и что они обозначают, оценка и нормы Общий ликбез: что такое КТГ, зачем нужно, и когда делают

КТГ — кардиотогография — совершенно безопасный метод отслеживания состояния будущего малыша. Без всякого дискомфорта для ребенка, можно получить необходимую информацию о его сердечном ритме и сокращениях матки мамы.

КТГ обычно назначают после 26 недели беременности, так как до этого сложно однозначно расшифровать полученные данные. В обязательном порядке Вас направят на КТГ дважды в третьем триместре беременности. Если же врача что-нибудь насторожит — назначит повторное (или дополнительное) исследование КТГ.

Как происходит процедура КТГ

Процедура занимает достаточно продолжительное время — 40-60 минут. Маму укладывают на кушетку (иногда предлагают удобное кресло), на животе крепят датчик, который отправляет информацию о биении сердца и сокращениях матки в электронный блок. Все данные графически отображаются на кривой, которую затем изучает врач.

Как оценивают результаты: баллы КТГ

После исследования врач изучает ленту с показаниями (кривыми) и пишет заключение.
При КТГ оценивают:

Базальный ритм (БЧСС или ЧСС) — средняя частота сокращений сердца. Норма: 110-160 ударов в минуту в спокойном состоянии плода (130-190 при шевелении).
Вариабельность ритма — средняя высота отклонений от ЧСС. Норма: высота отклонений — 5-25 уд/мин.
Акцелерации (акселерации) — ускорение ЧСС (на графике выглядят как высокие зубчики). Норма: 2 и более акселерации за 10 минут.
Децелерации (деселерации) — замедление ЧСС (на графике выглядят как существенные впадины). Норма: отсутствуют или неглубокие и очень короткие.
Токограмма — маточная активность. Норма: маточных сокращение не более 15% от БЧСС, длительность — от 30 сек.

Для расшифровки КТГ используют 10-бальную систему, где каждый из шести критериев (базальный ритм, вариабельность (амплитуда), вариабельность (количество), акцелерации, децелерации, шевеление плода) оценивается от 0 до 2 баллов.

Оценка состояние плода по баллам:

от 9 до 12 баллов — состояние плода нормальное, рекомендуется дальнейшее наблюдение;
от 6 до 8 баллов — кислородное голодание (гипоксия) без экстренный угроз, необходим повтор процедуры КТГ;
5 баллов и менее — выраженное кислородного голодание, необходимо экстренное родоразрешение.

Расшифровка КТГ 35 недель — Вопрос гинекологу

Если вы не нашли нужной информации среди ответов на этот вопрос, или же ваша проблема немного отличается от представленной, попробуйте задать дополнительный вопрос врачу на этой же странице, если он будет по теме основного вопроса. Вы также можете задать новый вопрос, и через некоторое время наши врачи на него ответят. Это бесплатно. Также можете поискать нужную информацию в похожих вопросах на этой странице или через страницу поиска по сайту. Мы будем очень благодарны, если Вы порекомендуете нас своим друзьям в социальных сетях.

Медпортал 03online.com осуществляет медконсультации в режиме переписки с врачами на сайте. Здесь вы получаете ответы от реальных практикующих специалистов в своей области. В настоящий момент на сайте можно получить консультацию по 74 направлениям: специалиста COVID-19, аллерголога, анестезиолога-реаниматолога, венеролога, гастроэнтеролога, гематолога, генетика, гепатолога, гериатра, гинеколога, гинеколога-эндокринолога, гомеопата, дерматолога, детского гастроэнтеролога, детского гинеколога, детского дерматолога, детского инфекциониста, детского кардиолога, детского лора, детского невролога, детского нефролога, детского онколога, детского офтальмолога, детского психолога, детского пульмонолога, детского ревматолога, детского уролога, детского хирурга, детского эндокринолога, дефектолога, диетолога, иммунолога, инфекциониста, кардиолога, клинического психолога, косметолога, липидолога, логопеда, лора, маммолога, медицинского юриста, нарколога, невропатолога, нейрохирурга, неонатолога, нефролога, нутрициолога, онколога, онкоуролога, ортопеда-травматолога, офтальмолога, паразитолога, педиатра, пластического хирурга, подолога, проктолога, психиатра, психолога, пульмонолога, ревматолога, рентгенолога, репродуктолога, сексолога-андролога, стоматолога, трихолога, уролога, фармацевта, физиотерапевта, фитотерапевта, флеболога, фтизиатра, хирурга, эндокринолога.

Мы отвечаем на 96.87% вопросов.

Оставайтесь с нами и будьте здоровы!

Расшифровка ктг 35 неделя — Вопрос гинекологу

Если вы не нашли нужной информации среди ответов на этот вопрос, или же ваша проблема немного отличается от представленной, попробуйте задать дополнительный вопрос врачу на этой же странице, если он будет по теме основного вопроса. Вы также можете задать новый вопрос, и через некоторое время наши врачи на него ответят. Это бесплатно. Также можете поискать нужную информацию в похожих вопросах на этой странице или через страницу поиска по сайту. Мы будем очень благодарны, если Вы порекомендуете нас своим друзьям в социальных сетях.

Медпортал 03online.com осуществляет медконсультации в режиме переписки с врачами на сайте. Здесь вы получаете ответы от реальных практикующих специалистов в своей области. В настоящий момент на сайте можно получить консультацию по 74 направлениям: специалиста COVID-19, аллерголога, анестезиолога-реаниматолога, венеролога, гастроэнтеролога, гематолога, генетика, гепатолога, гериатра, гинеколога, гинеколога-эндокринолога, гомеопата, дерматолога, детского гастроэнтеролога, детского гинеколога, детского дерматолога, детского инфекциониста, детского кардиолога, детского лора, детского невролога, детского нефролога, детского онколога, детского офтальмолога, детского психолога, детского пульмонолога, детского ревматолога, детского уролога, детского хирурга, детского эндокринолога, дефектолога, диетолога, иммунолога, инфекциониста, кардиолога, клинического психолога, косметолога, липидолога, логопеда, лора, маммолога, медицинского юриста, нарколога, невропатолога, нейрохирурга, неонатолога, нефролога, нутрициолога, онколога, онкоуролога, ортопеда-травматолога, офтальмолога, паразитолога, педиатра, пластического хирурга, подолога, проктолога, психиатра, психолога, пульмонолога, ревматолога, рентгенолога, репродуктолога, сексолога-андролога, стоматолога, трихолога, уролога, фармацевта, физиотерапевта, фитотерапевта, флеболога, фтизиатра, хирурга, эндокринолога.

Мы отвечаем на 96.87% вопросов.

Оставайтесь с нами и будьте здоровы!

КГТ ребенка при беременности — профессиональная диагностика и расшифровка результатов

С какой целью проводится КТГ беременным? 

Кардиотокография плода позволяет оценить кровоснабжение плода и тонус матки на поздних сроках беременности. В исследовании фиксируется ритм сердцебиения младенца, который, в норме, учащается только при движении.

Оценка ритма сердцебиения показывает, достаточно ли кровоснабжение плода, нет ли оснований для дополнительного обследования / лечения.

В каком случае необходимо КТГ? 

Планово КТГ проводится всем беременным на каждом приеме, начиная с 30 недель до родов. 

Внепланово КТГ проводится при гипертонусе матки, слишком сильной или, наоборот, малой активности движений плода. 

ВНИМАНИЮ БЕРЕМЕННЫХ! Если малыш ведет себя нехарактерно, обратитесь к врачу акушеру-гинекологу — возможно, требуется проведение кардиотокографии! 

Как проходит исследование? 

Длительность процедуры составляет около 30 минут. Процедура не требует предварительной подготовки. Беременная женщина лежит на кушетке с накожными датчиками, нажатием на кнопку отмечает движения плода. Оценка КТГ — расшифровка результатов проводиться врачом. 

Достоинства исследования 

  • высокая доступность исследования: не требуется специальная подготовка; проводится в любое время;
  • не инвазивный и безболезненный метод исследования;
  • безопасность исследования: отсутствие лучевой нагрузки;
  • информативность, позволяющая уточнить состояние плода и матки. 

КТГ в Семейной клинике  «КОСМА» проводят высококвалифицированные специалисты отделения акушерства и гинекологии, имеющие специализированный опыт снятия и расшифровки кардиотокографии плода. Исследование проводится в комфортной обстановке. Результаты выдаются в день приема. Исследование могут пройти как пациентки, наблюдающиеся в клинике, так и беременные женщины, обратившиеся только для проведения данной процедуры. 

Заключительные недели беременности — время, требующее особой заботы о будущей маме и малыше. Мы рады помочь сохранить Ваше здоровье и гармонию в этот важный период!

В клинике  «КОСМА» Вас ждет комплекс необходимых приемов и обследований, необходимый для высокквалифицированного ведения беременности, комфорт и забота о каждой будущей маме!

SEC.gov | Порог частоты запросов превысил

Чтобы обеспечить равный доступ для всех пользователей, SEC оставляет за собой право ограничивать запросы, исходящие от необъявленных автоматических инструментов. Ваш запрос был идентифицирован как часть сети автоматизированных инструментов, выходящих за рамки допустимой политики, и будет управляться до тех пор, пока не будут предприняты действия по объявлению вашего трафика.

Пожалуйста, заявите о своем трафике, обновив свой пользовательский агент, включив в него информацию о компании.

Для получения рекомендаций по эффективной загрузке информации из SEC.gov, включая последние документы EDGAR, посетите страницу sec.gov/developer. Вы также можете подписаться на получение по электронной почте обновлений программы открытых данных SEC, включая передовые методы, которые делают загрузку данных более эффективной, и улучшения SEC.gov, которые могут повлиять на процессы загрузки по сценарию. Для получения дополнительной информации обращайтесь по адресу [email protected]

Для получения дополнительной информации см. Политику конфиденциальности и безопасности веб-сайта SEC. Благодарим вас за интерес, проявленный к Комиссии по ценным бумагам и биржам США.

Идентификатор ссылки: 0.67fd733e.1647659306.3b14817

Дополнительная информация

Политика интернет-безопасности

Используя этот сайт, вы соглашаетесь на мониторинг и аудит безопасности. В целях безопасности и для обеспечения того, чтобы общедоступные услуги оставались доступными для пользователей, эта правительственная компьютерная система использует программы для мониторинга сетевого трафика для выявления несанкционированных попыток загрузить или изменить информацию или иным образом нанести ущерб, включая попытки отказать в обслуживании пользователям.

Несанкционированные попытки загрузки информации и/или изменения информации в любой части этого сайта строго запрещены и подлежат судебному преследованию в соответствии с Законом о компьютерном мошенничестве и злоупотреблениях от 1986 года и Законом о защите национальной информационной инфраструктуры от 1996 года (см.S.C. §§ 1001 и 1030).

Чтобы гарантировать, что наш веб-сайт хорошо работает для всех пользователей, SEC отслеживает частоту запросов контента SEC.gov, чтобы гарантировать, что автоматический поиск не повлияет на способность других получать доступ к контенту SEC.gov. Мы оставляем за собой право блокировать IP-адреса, отправляющие чрезмерные запросы. Текущие правила ограничивают количество пользователей до 10 запросов в секунду, независимо от количества компьютеров, используемых для отправки запросов.

Если пользователь или приложение отправляет более 10 запросов в секунду, дальнейшие запросы с IP-адреса(ов) могут быть ограничены на короткий период.Как только количество запросов упадет ниже порогового значения на 10 минут, пользователь может возобновить доступ к контенту на SEC.gov. Эта практика SEC предназначена для ограничения чрезмерных автоматических поисков на SEC.gov и не предназначена и не предназначена для воздействия на отдельных лиц, просматривающих веб-сайт SEC.gov.

Обратите внимание, что эта политика может измениться, поскольку SEC управляет SEC.gov, чтобы обеспечить эффективную работу веб-сайта и его доступность для всех пользователей.

Примечание: Мы не предлагаем техническую поддержку для разработки или отладки процессов загрузки по сценарию.

КТГ плода – это норма. КТГ плода 36 недель. Как расшифровать КТГ плода

Абсолютно каждую женщину во время беременности волнует, как развивается ее ребенок, все ли в порядке. На сегодняшний день существуют методы, позволяющие достаточно достоверно оценить состояние плода. Одним из таких методов является кардиотокография (КТГ), выявляющая связь между шевелениями плода и частотой сердечных сокращений. Из этой статьи вы узнаете, что такое КТГ, какие характеристики она оценивает, какие показатели КТГ плода являются нормой и что влияет на результаты исследования.

Что такое КТГ?

Кардиотокография основана на регистрации частоты сердечных сокращений плода и ее изменений в зависимости от действия внешних раздражителей или активности плода.

Диагностику проводят с помощью двух ультразвуковых датчиков, один из которых укрепляют на животе беременной, предварительно определив зону хорошей слышимости сердцебиения ребенка.

Предназначен для регистрации сердечной деятельности плода. Датчик улавливает ультразвуковой сигнал, отраженный от сердца ребенка, который затем преобразуется электронной системой в мгновенную частоту сердечных сокращений.Второй датчик прикрепляют к животу в области дна матки. Он регистрирует сокращения матки. Для улучшения прохождения ультразвуковых волн датчики обработаны специальным гелем. Также современные приборы оснащены пультом дистанционного управления, нажатием кнопки которого беременная женщина может отмечать движения плода.

Результаты отображаются на бумажной ленте в виде графика. Там же отображаются сокращения матки и движения плода. По полученным данным можно судить, прежде всего, о состоянии нервной системы малыша, о его защитно-приспособительных реакциях.Если показатели КТГ плода — норма, значит, малыш чувствует себя комфортно, и его развитие идет по срокам.

Что требуется для КТГ

Осмотр беременной в кабинете акушера-гинеколога включает также прослушивание сердцебиения ребенка с помощью стетоскопа. Отклонение от нормы частоты сердечных сокращений (ЧСС) в большую или меньшую сторону свидетельствует о том, что ребенок испытывает дискомфорт. В этом случае врач направляет будущую маму на более тщательное исследование сердечно-сосудистой системы плода – КТГ.

Существует четкая связь между самочувствием беременной и плода. Так, если беременность протекала спокойно, без внутриутробной инфекции, угрозы прерывания, гестоза, результаты КТГ, скорее всего, будут в норме. Если при хорошем самочувствии беременной наблюдаются подозрительные результаты КТГ, необходимо повторно провести обследование через неделю.

При наличии у беременной серьезных изменений в самочувствии необходимо как можно чаще проводить КТГ, чтобы вовремя предупредить возникновение патологий в развитии плода и принять необходимые меры.

Особенности исследования

Назначают КТГ обычно после 32 недель беременности, так как только к этому времени происходит созревание нервно-мышечной импульсации, и метод становится наиболее информативным.

Например, для КТГ плода норма 33 недели -Наличие на графике более двух акселераций. К этому времени они обусловлены реакцией нервной системы на шевеления плода или на внешние факторы. На более ранних сроках акселерации могут быть связаны с условиями внутриутробного существования плода, поэтому исследования могут привести к ложным результатам.

Также к этому сроку плод имеет цикл активности и покоя, что имеет большое значение для данного исследования. При проведении КТГ в период покоя плода результаты всегда будут положительными, даже если на самом деле имеет место высокая степень гипоксии. Именно поэтому исследование должно проводиться не менее 40 минут. За это время у плода обязательно повысится двигательная активность, что позволит зарегистрировать изменение частоты сердечных сокращений при его движении.

Очень важно, чтобы во время исследования женщина чувствовала себя спокойно и комфортно.Неудобное положение или яркие эмоции могут вызвать более активное шевеление плода, что приведет к ложным результатам. Обычно во время процедуры женщина сидит в удобном кресле или лежит на кушетке на боку.

Для того, чтобы понять, как расшифровать КТГ плода, разберем подробно, по каким параметрам она оценивается.

Базальная частота сердечных сокращений

Базальная частота сердечных сокращений – это средняя частота сердечных сокращений плода, рассчитанная за 10-20 минут. Определяют его при отсутствии движений плода между сокращениями матки без внешних раздражителей, без учета ускорений и замедлений.

На КТГ плода норма ГССР 110-160 уд/мин. Тахикардия, то есть превышение нормы базальной частоты сердечных сокращений, может наблюдаться при гипоксии плода, анемии, пороках развития и сердечной недостаточности плода, а также при лихорадочном состоянии беременной, наличии внутриутробной инфекции, и функции щитовидной железы. Прием препаратов, оказывающих кардиостимулирующее действие, может привести к учащению сердцебиения плода.

Снижение базального уровня ниже нормы (брадикардия) может быть обусловлено гипоксией, пороками сердца плода, а также снижением артериального давления матери, гипоксемией, длительным сдавлением пуповины, наличием у беременной цитомегаловирусной инфекции.

Вариабельность сердечного ритма

Этот параметр характеризуется наличием мгновенных колебаний — отклонений частоты сердечных сокращений от базального уровня. При анализе КТГ обычно исследуют амплитуду мгновенных колебаний, в характере которых выделяют низкие колебания (отклонение менее трех уд/мин), средние колебания (3-6 уд/мин), высокие (амплитуда более более 6 уд/мин).

Для КТГ плода норма 36 недель — высокие осцилляции, свидетельствующие о благополучии плода.Наличие низких колебаний свидетельствует о патологиях в его развитии.

Особое внимание при анализе кардиотокограммы уделяют медленным колебаниям. В зависимости от их амплитуды различают монотонный тип, для которого характерна малая амплитуда колебаний (от 0 до 5 уд/мин), переходный тип с амплитудой от 6 до 10 уд/мин, волнообразный (от 11 до 25 уд/мин) ) и прыжкового типа (амплитуда выше 25 уд/мин). Увеличение амплитуды колебаний может быть связано с умеренной гипоксией плода, а также с влиянием внешних раздражителей, возбуждающих его нервную систему.Снижение амплитуды колебаний может быть вызвано выраженной гипоксией, которая приводит к угнетению функции нервной системы плода, приемом наркотических средств, транквилизаторов.

Ускорения

Ускорения – это временное увеличение частоты сердечных сокращений не менее чем на 15 уд/мин по сравнению с базальным уровнем и продолжительностью более 15 секунд. На кардиотокограмме они выглядят как высокие зубчики. Ускорения являются ответной реакцией на внешние раздражители, сокращения матки, на шевеления ребенка.Их наличие на КТГ плода является нормой.

Замедление

Замедлением называют снижение частоты ЧСС плода не менее 15 уд/мин продолжительностью более 15 секунд. Диаграмма показывает, насколько значительными являются полости. Различают ранние, поздние и переменные замедления. Кроме того, они классифицируются по амплитуде как легкие со снижением частоты сердечных сокращений до 30 уд/мин, умеренные — 30 — 45 уд/мин и тяжелые — от 45 уд/мин. Снижение частоты сердечных сокращений может возникать в результате нарушения плацентарного кровотока, гипоксии миокарда, сдавления пуповины.

КТГ плода. Норма показателей

Для оценки состояния плода Всемирной организацией здравоохранения разработаны рекомендации, в которых указаны минимально и максимально допустимые значения каждого из параметров. Согласно этим рекомендациям КТГ плода (норма в 33 недели) должна иметь следующие значения:

  • Базальный уровень сердцебиения: 110-160 уд/мин.
  • Вариабельность частоты сердечных сокращений в пределах 5-25 уд/мин.
  • Два или более ускорения в течение 10 минут.
  • Отсутствие глубоких торможений.

Стоит отметить, что для КТГ плода норма в 35 недель и более такая же, как и в 33 недели.

Оценка состояния плода по баллам

Расшифровать результаты КТГ по 10-балльной системе, оценив каждый критерий от 0 до 2 баллов. Для КТГ плода норма в 36 недель, как и в течение всего третьего триместра, составляет 9-10 баллов, если сумма баллов от 6 до 8, это свидетельствует о кислородном голодании (гипоксии) без угроз экстренной помощи, это необходимо повторить процедуру КТГ через неделю;

если 5 баллов и меньше — значит ребенок испытывает сильнейшее кислородное голодание, что может привести к серьезным неврологическим проблемам, необходимо принимать экстренные меры.

Следует помнить, что даже если КТГ плода 8 баллов или чуть ниже, не нужно пугаться раньше срока. В этом виде исследования, как и во многих других, существуют факторы, влияющие на информативность показаний. Результаты сильно зависят, например, от того, спит ребенок или бодрствует. Опытные врачи при расшифровке кардиотокограмм учитывают такие факторы, как погодные условия, настроение беременной, уровень глюкозы в крови женщины.Если данные КТГ не соответствуют норме, врач назначит дополнительное обследование. Обычно кардиотокографию проводят дважды в третьем триместре беременности, но в некоторых случаях и больше, например, при многоплодной беременности, повышенном артериальном давлении, инфекциях, сахарном диабете, неудовлетворительных результатах УЗИ, кровотечениях, преждевременных родах.

Возможные ошибки в интерпретации данных КТГ

  1. Ребенок в утробе матери находится в постоянном движении. Иногда он может сдавливать головку пуповины, из-за чего на короткое время нарушается кровоток в сосудах пуповины, что отражается на результатах КТГ.В этом случае кардиотокограмма будет патологической при хорошем состоянии плода.
  2. Иногда при кислородном голодании у плода включаются защитные реакции: снижение потребления кислорода тканями и повышение устойчивости к гипоксии. В таких случаях страдает ребенок, но на КТГ это не отражается.
  3. При развитии патологии может снижаться способность тканей воспринимать кислород при нормальном его содержании в крови, из-за чего плод не реагирует, и КТГ будет в норме, хотя и страдает от недостатка кислорода.

Учитывая все вышеизложенное, нужно понимать, что КТГ плода при беременности является очень важным методом диагностики, но для получения полной картины происходящего данные КТГ необходимо сопоставлять с другими исследованиями. На сегодняшний день широко применяется ультразвуковая диагностика и доплерография.

Где можно сделать КТГ плода

КТГ делается бесплатно во всех женских консультациях. Можно проводить исследования в частных медицинских центрах, но уже на платной основе.

В родильных домах также проводят кардиотокографию в процессе родов. Это помогает оценить самочувствие ребенка в родах и сокращении матки, проверить эффективность лечения и тактику родов.

Некоторые будущие мамы опасаются проводить разного рода исследования во время беременности, считая, что они могут нанести вред здоровью будущего малыша. Кардиотокография абсолютно безопасна, и ее можно делать сколько угодно раз, без риска для здоровья.К тому же он безболезненный, не вызывает никаких неприятных ощущений.

Желаем легкой беременности и крепкого здоровья!

р>>

PROTAC: большие возможности для научных кругов и промышленности

AHR

Рецептор арильных углеводородов (AHR) представляет собой активируемый лигандом транскрипционный фактор, принадлежащий к семейству bHLH/PAS (базовая спираль-петля-спираль/Per-Arnt-Sim). хемосенсоров. 106,107 Он опосредует многие токсические и канцерогенные эффекты канцерогенов окружающей среды, включая хлоракне, истощение, тератогенность, иммунотоксичность, стимулирование роста опухолей и канцерогенность.AHR связывает свой лиганд, как полициклический ароматический углеводород, и инициирует ферменты, метаболизирующие ксенобиотики, такие как цитохром P450, с последующим образованием аддуктов ДНК. Хотя физиологическим расстройствам, связанным с AHR, уделяется большое внимание, роль AHR в этих патологических процессах еще предстоит четко изучить из-за отсутствия мощных химических зондов. 108

Группа Ким недавно обнаружила, что апигенин, натуральный продукт, содержащийся во фруктах, растениях и меде, напрямую взаимодействует с AHR (рис.5). Затем они предположили, что PROTAC на основе апигенина могут быть полезными молекулярными зондами для изучения биологии AHR. 108 Для разработки PROTAC, нацеленных на AHR, они сначала выбрали положение на апигенине для присоединения лиганда VHL. После модификации свободных гидроксильных групп ацетильными было обнаружено, что все апигенины сохраняют способность ингибировать AHR после ацетилирования. Они связали пентапептидный фрагмент, полученный из фактора, индуцирующего гипоксию (HIF)-1α, лиганда VHL, с апигенином или бензилированным апигенином.Api-Protac-II эффективно индуцировал деградацию AHR, в то время как деградация не наблюдалась с Api-Protac-I. Они также исследовали деградацию усиленного зеленого флуоресцентного белка (eGFP), слитого с AHR. Их результаты показали, что Api-Protac-II можно использовать в качестве зонда для изучения биологии AHR.

Рис. 5

Представитель PROTAC компании AHR.

ALK

Киназа анапластической лимфомы (ALK) представляет собой тирозинкиназу подсемейства киназ рецептора инсулина (IR). 109 Онкогенная активация ALK тесно связана с возникновением и развитием многих видов рака человека, включая диффузную крупноклеточную B-клеточную лимфому (DLBCL), анапластическую крупноклеточную неходжкинскую лимфому (ALCL), плоскоклеточный рак пищевода (ESCC), воспалительная миофибробластная опухоль (IMT), немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), почечно-клеточный рак (RCC), нейробластома, рак щитовидной железы, рак яичников, карцинома толстой кишки и рак молочной железы. 110,111,112,113,114,115 ALK активируется в основном тремя различными механизмами, и хромосомные транслокации являются наиболее распространенными генетическими изменениями. Было идентифицировано около 30 различных типов слитого белка ALK, и среди них слитые формы NPM-ALK, EML4-ALK, KIF5B-ALK и TGF-ALK обычно обнаруживаются при различных типах рака, включая ALCL. НМРЛ и ДВККЛ. 116 Мутации замещения являются вторым механизмом активации ALK, а точечные мутации в киназном домене (F1174L и R1275Q) наиболее часто наблюдаются при нейробластоме. 117 Амплификация и сверхэкспрессия генов — это третий механизм активации ALK, о котором также сообщалось при многих типах рака человека. 118,119 На сегодняшний день пять ингибиторов ALK, включая алектиниб, бригатиниб, церитиниб, кризотиниб и лорлатиниб, были одобрены FDA для терапии ALK-положительного НМРЛ. 120 Несмотря на первоначальный ответ на эти ингибиторы, у большинства пациентов в течение 1–2 лет наблюдается лекарственная устойчивость. 120,121 Таким образом, срочно необходимы новые терапевтические подходы для преодоления лекарственной устойчивости.

В 2018 году группа Натанаэля С. Грея разработала два ALK PROTAC (TL13–12 и TL13–112). Эти два PROTAC были конъюгированы с ингибиторами ALK (церитиниб и ТАЕ684) и помалидомидом с помощью лайкеров полиэтиленгликоля (ПЭГ) разной длины (рис. 6). 122 Эти PROTAC индуцировали мощный нокдаун ALK в клетках НМРЛ h4122 (EML4-ALK), клетках ALCL Karpas 299 (NPM-ALK), клетках ALCL SU-DHL-1 (NPM-ALK) и клетках NB (F1174L/R1275Q). ALK), которые в то же время поддерживали ингибирование нисходящей передачи сигналов ALK.Кроме того, эти PROTAC способствовали деградации других киназ (FAK, Aurora A, FER и RSK1) согласно анализу протеомного профилирования.

Рис. 6

Репрезентативные PROTAC компании ALK.

В том же году Jian Jin и соавторы сообщили о двух PROTAC, нацеленных на ALK, MS4077 и MS4078, путем соединения церитиниба и помалидомида с двумя разными линкерами (рис. 6). 123 Помимо деградации NPM-ALK и EML4-ALK, MS4077 и MS4078 могут ингибировать фосфорилирование ALK и STAT3 зависимым от концентрации и времени образом как в SU-DHL-1 (клетки ALCL, несущие NPM-ALK), так и в NCI- клетки h3228 (клетки НМРЛ, содержащие EML4-ALK).Кроме того, MS4077 и MS4078 проявляли мощную антипролиферативную активность в клетках SU-DHL-1. Кроме того, MS4078 продемонстрировал хорошую экспозицию в плазме в фармакокинетическом исследовании на мышах, и испытуемые мыши хорошо переносили дозу 50 mpk (мг/кг).

Впоследствии Jong Yeon Hwang и его коллеги сообщили о TD-004, который состоял из церитиниба и лиганда лигазы VHL E3 (рис. 6). 40 TD-004 продемонстрировал превосходную деградацию ALK и ингибирование роста клеток SU-DHL-1 и h4122.Кроме того, TD-004 резко уменьшал размер опухоли в мышиной модели с ксенотрансплантатом h4122 in vivo.

AR

Нарушение рецептора андрогенов является основной движущей силой рака предстательной железы. 124 Препаратами первой линии для лечения рака предстательной железы были конкурентные антагонисты, такие как энзалутамид, которые могли ингибировать транскрипционную активность AR. Однако после длительного воздействия этих антагонистов у большинства пациентов в конечном итоге разовьется лекарственная устойчивость. 125

Полученный из энзалутамида PROTAC, нацеленный на AR под названием ARCC-4, о котором Crews и его коллеги сообщили в 2018 г. 126 (рис. 7). ARCC-4 является высокоэффективным разлагающим агентом с низкой наномолярной разлагающей активностью, и его DC 50 (полумаксимальные концентрации разложения) составляли 5 нМ. Более того, ARCC-4 продемонстрировал ингибирующее действие на пролиферацию клеток опухоли предстательной железы и способность разрушать клинически значимый мутантный рецептор андрогена. Кроме того, для параллельного сравнения энзалутамида и ARCC-4 использовались различные клеточные модели лекарственной устойчивости рака предстательной железы.Например, ARCC может снижать уровень AR (~3,5 раза при 10 мкМ) в клетках LNCaP, сконструированных для сверхэкспрессии мутантного AR-F876L (LNCaP/F876L), в то время как AR в клетках, обработанных энзалутамидом, значительно увеличивается (~17,5-17,5-мкМ). кратно при 10  мкМ). Другие точечные мутации AR у пациентов, подвергшихся терапии, направленной на AR, также эффективно деградировали, включая H874Y, M896V, T877A, L702H. Таким образом, ARCC-4 продемонстрировал лучшие антипролиферативные эффекты в среде с мутантным AR, в то время как энзалутамид оказался неэффективным.

Рис.7

Типичные PROTAC, разрушающие лекарственно-устойчивые AR.

Компания Arvinas разработала другой PROTAC, нацеленный на AR (ARV-110), который продемонстрировал высокую эффективность деградации как AR, так и мутантов AR после перорального введения (рис. 7). АРВ-110 может разрушать 95–98% АР в различных клеточных линиях, обычно используемых в исследованиях рака предстательной железы. АРВ-110 продемонстрировал сравнимую эффективность при более низких дозах по сравнению с энзалутамидом в моделях АР дикого типа. При оценке в моделях приобретенной и внутренней резистентности рост опухоли блокировался на 70% и 100% соответственно после лечения АРВ-110.АРВ-110 вошел в фазу 1 клинических испытаний, и предварительные данные показали удовлетворительную безопасность и переносимость у пациентов. Таким образом, АРВ-110 будет многообещающей стратегией лечения пациентов с метастатическим резистентным к кастрации раком предстательной железы (КРРПЖ), которые получали стандартную терапию.

BCL2

BCL2 является ключевым членом семейства BCL2 и регулирует гибель клеток (апоптоз), индуцируя (проапоптоз) или подавляя ее (антиапоптоз). BCL2 классифицируется как онкоген из-за его важной роли в качестве антиапоптотических белков. 127 При нарушении регуляции BCL2 возникают различные виды рака, включая рак легких и лимфомы. Пирс Бломбери и его коллеги обнаружили появление новой мутации, устойчивой к венетоклаксу (BCL2 F104I) при фолликулярной лимфоме. Более того, было трудно нацелиться на BCL2 из-за белок-белкового взаимодействия (PPI) с Bcl-xl. Таким образом, PROTAC открывают перспективы для разработки новых ингибиторов BCL2, преодолевающих ИПП и лекарственную устойчивость.

О первой деградации BCL2 сообщили Чжан и его коллеги в 2019 году.разработанные PROTAC для целей PPI, опосредованных α-спиралями, для деградации BCL2 128 (рис. 8). Самый мощный и селективный PROTAC, C5, расщепил BCL2 с DC 50 3,0 мкМ и продемонстрировал ингибирование клеточной пролиферации, обусловленное эффективностью деградации.

Рис. 8

Типичный PROTAC, нацеленный на BCL2.

Несмотря на разработку деструкторов BCL2, не было никаких документов об эффективных PROTAC, разрушающих лекарственно-устойчивый BCL2. 129,130 ​​

BCL6

Транскрипционный фактор В-клеточная лимфома 6 (BCL6) является членом семейства безделушек, трамвая, широкого комплекса/поксвируса цинкового пальца (BTB/POZ).Он взаимодействует с тремя корепрессорами (т. е. BCoR, SMRT и NCoR) и обладает доменами BTB, RD2 и цинковыми пальцами. 131 BCL6 необходим для образования В-клеток зародышевого центра и дифференцировки Т-лимфоцитов. 132,133 Кроме того, было обнаружено, что он участвует в дифференцировке и пролиферации диффузных крупноклеточных В-клеточных лимфом (DLBCL) и фолликулярных раковых лимфом посредством ряда генетических изменений. 134,135 Таким образом, BCL6 рассматривается как эффективная терапевтическая мишень для терапии аутоиммунных заболеваний и рака. 136 Хотя в настоящее время сообщается о неразборчивых ингибиторах 137 и пептидомиметиках 138 на основе ингибиторов BCL6, которые продемонстрировали привлекательный эффект in vitro, они не оправдали обещаний своих доклинических данных. Мощный и селективный инструмент необходим для понимания BCL6 при заболеваниях человека.

В 2018 году компания AstraZeneca впервые сообщила о сильном и селективном PROTAC, нацеленном на BCL6, PROTAC 9 , путем конъюгации разработанного лиганда BCL6 и лиганда CRBN талидомида (рис.9). 139 PROTAC 9 показал дозозависимую деградацию BCL6 во всех субклеточных фракциях, но эта деградация не была полной. Кроме того, PROTAC9 не индуцировал фенотипический ответ в клетках OCI-Ly1 и SUDHL4 в течение 16 дней исследования.

Рис. 9

Представитель PROTAC компании BCL6.

BCR-ABL

Слитый ген BCR-ABL является основной причиной хронической миелогенной лимфомы (ХМЛ). 140 При хромосомной транслокации гена ABL из хромосомы 9 в ген BCR на хромосоме 22 образуется BCR-ABL.BCR-ABL приводил к нарушению пролиферации клеток CML у пациентов за счет активации нижестоящей передачи сигналов. 141 В настоящее время основное внимание уделяется поиску новых препаратов против тирозинкиназы ABL BCR-ABL для лечения CML по-прежнему являются АТФ-конкурентными ингибиторами. Поэтому ученые разработали несколько ингибиторов тирозинкиназы BCR-ABL, и FDA одобрило их для лечения ХМЛ. Принимая во внимание, что точечные мутации в тирозинкиназном домене BCR-ABL наблюдались у ряда пациентов во время введения ингибиторов киназы, и в конечном итоге у них развилась лекарственная устойчивость.поэтому было идентифицировано три поколения ингибиторов для борьбы с растущей лекарственной устойчивостью, включая ИТК первого поколения, иматиниб; 142 ИТК второго поколения, дазатиниб 143 и нилотиниб; 144 и ИТК третьего поколения, понатиниб. 145

Первый расщепитель BCR-ABL был разработан Crews и его коллегами в 2015 г. На основе бозутиниба и дазатиниба был сконструирован BCR-ABL PROTAC, который индуцировал расщепление c-ABL и BCR-ABL в присутствии либо CRBN или VHL E3 убиквитинлигаза 146 (рис.10). После оценки полученный из дазатиниба PROTAC (DAS-VHL) опосредовал явное (> 65%) снижение c-ABL при 1 мкМ. Дазатиниб-CRBN (DAS-CRBN) PROTAC вызывал как деградацию c-ABL (>85% при 1 мкМ), так и BCR-ABL (>60% при 1 мкМ). Разрушитель BCR-ABL, полученный из дазатиниба, вызывал ингибирование клеточного роста в отношении управляемого BCR-ABL K562 с полумаксимальной концентрацией ответа (EC 50 ) 4,4 нМ. Эти деструкторы проливают свет на разработку PROTAC для лечения лекарственно-устойчивых заболеваний, связанных с BCR-ABL.

Рис. 10

Репрезентативные PROTAC, нацеленные на лекарственно-устойчивый BCR-ABL.

В 2017 г. Naito и его коллеги сообщили о втором BCR-ABL PROTAC, полученном из дазатиниба 147 (рис. 10). Впоследствии эта группа разработала новый мощный деструктор BCR-ABL, названный DAS-IAP. DAS-IAP показал сравнимую активность в ингибировании роста клеток CML и устойчивые антипролиферативные эффекты, даже когда препарат отменяли после кратковременного лечения. Эти результаты показали, что деструкторы BCR-ABL демонстрируют более устойчивое ингибирование роста клеток CML, чем ингибиторы киназы ABL.

BET

Являясь вторым по значимости онкологическим заболеванием у мужчин во всем мире, рак предстательной железы поразил ряд людей. Обычно андрогенная депривация для окончательной ремиссии является наиболее часто используемой стратегией лечения рака предстательной железы. Тем не менее сопротивление кастрации появилось. Для этих КРРПЖ блокаторы сигналов AR были основным лечением, сопровождающимся плохим прогнозом. 148 Однако вторичная резистентность неизменно появлялась, хотя КРРПЖ лечили препаратами, воздействующими на передачу сигналов AR. 149 Недавно было доказано, что ингибирование семейства бромодоменных и экстратерминальных (BET) белков может нарушать нормальный рост в доклинических моделях КРРПЖ. 150 Есть много сообщений о деструкторах BET 151,152,153,154,155,156 , и мы сосредоточимся на достижениях BET PROTAC, которые преодолели лекарственную устойчивость.

В 2016 году Crews и его коллеги проиллюстрировали ARV-771 с DC 50 < 5 нМ в клетках 22Rv1 (рис. 11) в качестве пан-BET-разрушителя.ARV-771 вызывал деградацию c-MYC с IC 50 < 1 нМ и апоптоз клеток посредством расщепления PARP. 152 Для оценки активности АРВ-771 in vivo в модели опухоли VCaP была выбрана модель опухоли VCaP, которая представляет собой клинические условия сверхэкспрессии AR после андроген-депривационной терапии. После лечения АРВ-771 ингибирование роста опухоли индуцировалось на 60% без существенной потери массы тела. напротив, в группе, получавшей энзалутамид, не наблюдалось ингибирования роста опухоли.В то же время АРВ-771 продемонстрировал более высокую эффективность и преимущества в аспекте лечения КРРПЖ по сравнению с энзалутамидом.

Рис. 11

Репрезентативные PROTAC, нацеленные на лекарственно-устойчивый BET.

В 2015 году группа Bradner сообщила о другом известном деструкторе БЭТ 151 (рис. 11). Конъюгация JQ1 и помалидомида давала dBET1. Обработка клеток MV4-11 с помощью dBET1 привела к значительной потере BRD4 (> 85%), что было достигнуто при таких низких концентрациях, как 100 нМ после 18 часов обработки, а dBET1 показал сильное и превосходное ингибирование пролиферации клеток MV4-11. через 24 часа по сравнению с JQ1.Более того, dBET1 был способен расщеплять BRD4 и ингибировать рост опухоли in vivo в модели ксенотрансплантата задней конечности мыши с клетками лейкемии человека MV4-11, не влияя на вес животного и нормальный полный анализ крови после обработки деструктором. Более значительное подавление MYC наблюдалось по сравнению с группой, получавшей носитель, в иссеченных опухолях.

У пациентов с тройным негативным раком молочной железы (ТНРМЖ) химиотерапия обычно может дать высокий ответ. 153 Однако резидуальные опухоли вызывают высокие показатели метастазирования из-за амплификации локусов MCL1, что было одним из наиболее распространенных генетических изменений в химиорезистентных опухолях.Таким образом, ученые доказали, что MCL1 представляет собой слияние как врожденных, так и приобретенных факторов резистентности у пациентов с ТНРМЖ. Резистентность ограничивает эффективность различных противоопухолевых средств. В 2018 году группа Ванга сообщила, что BETd-246, полученный из их ингибитора BET (BETi-211), расщепляет белки BET для лечения ТНРМЖ (рис. 11). BETd-246 индуцировал деградацию BRD2, BRD3 и BRD4 дозозависимым образом. После обработки в течение 1 часа или 3 часов 30–100 нмоль/л BETd-246 или 10–30 нмоль/л BETd-246 соответственно белки BRD2-4 были почти полностью истощены.BETd-246 ингибировал рост клеток ТНРМЖ с IC 50 < 10 нмоль/моль и приводил к быстрому и зависящему от времени подавлению белка MCL1 в протестированных клеточных линиях ТНРМЖ. Лечение модели ксенотрансплантата пациента (PDX) ТНРМЖ с помощью BETd-246, в дозе 5 mpk, в/в, три раза в неделю в течение 3 недель, наблюдалась эффективная противоопухолевая активность, аналогичная ингибирующим эффектам BETi-211. по 50 мг/кг, ежедневно, после приема внутрь, 5 дней в неделю в течение 3 недель. Это открытие предложило многообещающий подход к нацеливанию MCL1 на ТНРМЖ для преодоления клинической резистентности.

BRD9 и BRD7

BRD9 является бромдоменсодержащей субъединицей BAF (BRG-/BRM-ассоциированный фактор) 157 , а его близкий гомолог BRD7 является субъединицей PBAF (полибром-ассоциированный BAF). 158 BAF и PBAF представляют собой два варианта комплекса SWI/SNF, которые регулируют экспрессию генов, репликацию ДНК и репарацию ДНК. 159 Повышенная экспрессия BRD9 обнаружена при некоторых видах рака, включая рак шейки матки. 160

В 2017 году группа Bradner разработала и охарактеризовала первый деструктор BRD9, который показал очевидную деградацию BRD9 при 50 нМ 161 (рис.12). Антипролиферативный эффект dBRD9 был несколько лучше, чем у ингибитора в клеточной линии ОМЛ человека MOLM-13.

Рис. 12

Репрезентативные PROTAC, нацеленные на BRD9/7.

В 2019 году Чиулли и его коллеги описали деструктор путем конъюгации лигандов VHL и BRD9. заявленный деструктор может разлагать BRD9 и BRD 7 со значениями DC 50 1,8 и 4,5  нМ соответственно 162 (рис. 12). Две клеточные линии, EOL-1 (острый миелоидный эозинофильный лейкоз) и A-204 (злокачественная рабдоидная опухоль), которые чувствительны к ингибированию/деградации BRD9 и зависят от активного комплекса BAF, были отобраны для изучения влияния BRD7, индуцированного деградацией. /9 деградация на жизнеспособность раковых клеток. Метаболически активными клетками называли клетки с присутствием клеточного АТФ.Разрушитель на основе CRBN dBRD9 показал цитотоксическое действие в обеих клеточных линиях со значениями EC 50 5 нМ (EOL-1) и 90 нМ (A-402) и оказался эквивалентным VZ185 со значениями EC 50 3 и 40 нМ соответственно.

BTK

В-клеточный рецептор (BCR) является важным регулятором передачи сигналов В-клетками при адгезии, выживании и росте. Для пути BCR незаменима BTK, поскольку она работает как проксимальная сигнальная молекула мембраны для активации и пролиферации B-клеток. 163 В настоящее время ибрутиниб одобрен для лечения MCL и активированной B-клетки (ABC)-DLBCL путем ковалентного связывания. 164 Однако у пациентов с MCL развилась лекарственная устойчивость после лечения ибрутинибом из-за миссенс-мутации BTK C481S. 165 Ибрутиниб также потерял эффективность ингибирования роста опухолевых клеток DLBCL, возникающих в результате мутации BTK C481S.

В 2018 и 2019 годах Рао и его коллеги впервые сообщили о двух панелях новых деструкторов BTK для нокдауна устойчивых к лекарствам BTK 166 167 (рис.13). Сначала мощный расщепитель P13I показал высокую эффективность деградации как C481S BTK дикого типа, так и устойчивого к ибрутинибу, с DC 50 при 9,2 и 30 нМ соответственно. Кроме того, P13I обеспечивал несколько лучшее ингибирование роста со значениями GI 50 (концентрация подавления роста 50%), равными 1,5 нМ, по сравнению с ибрутинибом в клетках BTK дикого типа. Более того, P13I эффективно подавлял самофосфорилирование C481S мутантного BTK при низкой концентрации, в то время как ибрутиниб не работал.Следовательно, P13I может значительно ингибировать рост клеток HBL-1, экспрессирующих мутант BTK C481S, со значениями GI 50 приблизительно 28 нМ. При этом ибрутиниб терял ингибирующую эффективность в мутантных клетках ВТК. После этого были созданы еще более оптимизированные BTK PROTAC со значительным улучшением растворимости в воде. Среди второго поколения L18I был репрезентативным разрушителем, который обладал способностью разрушать различные мутанты C481 BTK со значениями DC 50 ниже 50  нМ. Кроме того, L18I мог обеспечить быструю регрессию опухоли в моделях ксенотрансплантатов мышей, инокулированных клетками C481S BTK HBL-1 с дозой 30 или 100 mpk, и опухоль уменьшилась на 36% и 63% соответственно.Напротив, у мышей, получавших ибрутиниб, наблюдалась серьезная опухолевая нагрузка. Приведенные выше результаты свидетельствуют о том, что деструкторы PROTAC, нацеленные на BTK, обладают большим потенциалом ингибирования функций BTK, особенно при резистентных к ибрутинибу лимфомах.

Рис. 13

Репрезентативные PROTAC, нацеленные на лекарственно-устойчивые BTK.

Почти в то же время группа Crews сообщила о другом BTK PROTAC, MT-802, полученном из ибрутиниба 168 (рис. 13). Для BTK дикого типа MT-802 эффективно вызывал деградацию BTK с DC 50 из 14.6 нМ с максимальной деградацией при 250 нМ. MT-802 сохранял ту же активность против C481S BTK с DC 50 14,9 нМ. Кроме того, МТ-802 был способен снижать фосфорилирование BTK в клетках, выделенных от пациентов с ХЛЛ с мутацией C481S, в то время как ибрутиниб не мог.

В 2018 году Натанаэлем С. Греем был разработан мультикиназный деструктор, который сочетает в себе очень неразборчивый ингибитор киназы с лигандом, связывающимся с цереблоном, и этот мультикиназный деструктор мог деградировать несколько киназ, включая BTK 169 (рис.13). В 2019 году был выпущен более специфический деструктор БТК под названием ДД-04-015, который эффективно и избирательно разлагал БТК. Обработка DD-04-015 в течение 4 ч приводила к эффективной деградации при 100 нМ. Кроме того, DD-04-015 проявлял аналогичный эффект клеточной пролиферации по сравнению с RN486 в клетках TMD8 после 3 дней обработки. При дальнейшей оптимизации было разработано соединение свинца DD-03-171 со способностью разлагать C481S-BTK. DD-03-171 продемонстрировал более сильное антипролиферативное ингибирование клеток мантийно-клеточной лимфомы (MCL) in vitro с IC 50 , равным 5.1 нМ и эффективное противораковое действие на PDX in viv o .

В 2018 году компания Pfizer также описала препараты PROTAC, нацеленные на BTK, полученные из ранее сообщавшегося ковалентного фенилпиразола для связывания BTK и помалидомида для связывания CRBN 170 (рис. 13). Самый мощный деградант BTK приводил к эффективной деградации BTK с DC 50 5,9 ± 0,5 нМ после 24 часов обработки в клетках Рамоса. При оценке in vivo эффективная деградация BTK также наблюдалась в легких и селезенке у крыс, получавших разрушитель BTK.Этот BTK PROTAC, примененный к мутантам BTK, не был раскрыт в отчете.

CDK4/6

В 2019 году Берджесс и его коллеги сообщили о своей работе по разработке двойных деструкторов CDK4/6 171 (рис. 14). Разработанные PROTAC могли расщеплять CDK4/6 со значениями DC 50 в диапазоне от 20 до 50 нМ и ингибировать рост клеток на допустимом уровне. Однако их соединения не показали эффективности в клетках, сверхэкспрессирующих CDK4/6.

Рис. 14

Репрезентативные протоколы PROTAC, нацеленные на CDK4/6.

В 2019 году Грей и его коллеги изменили линкеры бифункциональных молекул, чтобы найти двойные деструкторы CDK4/6 (BSJ-03-204) и селективные деструкторы CDK4 и CDK6 (BSJ-04-132 или BSJ-03-123 соответственно). 172,173 (рис. 14). Эти деструкторы могли расщеплять целевые белки при концентрации 100 нМ и проявляли лучшие антипролиферативные эффекты по сравнению с ингибиторами CDK4/6. Более того, в клетках Granta-519 характерна сверхэкспрессия циклина D1. деструктор BSJ-02-162 или BSJ-03-204 может приводить к заметной деградации CDK4/6 и одновременно индуцировать остановку клеточного цикла G1.

Рао и его коллеги сообщили о наиболее сильном разлагающем агенте, который был получен из помалидомида и палбоциклиба и показал специфическую и замечательную эффективность в отношении деградации CDK6 с DC 50 2,1 нМ 174 (рис. 14). Более того, PROTAC по-прежнему подвергались сильной деградации и пролиферации за счет ингибирования гематопоэтических раковых клеток копийно-амплифицированными/мутированными формами CDK6.

Хотя сообщалось о нескольких PROTAC, нацеленных на CDK4/6, разработка PROTAC, применяемых для клеток, устойчивых к ингибиторам CDK, до сих пор остается сложной задачей. 175,176

CDK8

Циклинзависимая киназа 8 (CDK8) является членом семейства циклинзависимых киназ, которые играют важную роль в содействии фазовому переходу клеточного цикла, инициации синтеза ДНК и регуляции клеточной транскрипции во время клеточной пролиферации и дифференцировка, особенно в онкогенных сигнальных путях, включая сигнальный путь TGF-β, путь Wnt-β-катенина, путь p53 и сеть ответа на сыворотку и гипоксию. 177,178,179 Исследование показало, что сверхэкспрессия гена CDK8 нарушает пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток, что может ускорить рост и деление раковых клеток, таких как рак шейки матки, колоректальный рак, рак желудка, злокачественная меланома и так далее. 180 Хотя ингибиторы CDK8 использовались и постепенно привлекали к себе все большее внимание, их эффективность при лечении различных видов рака еще не подтверждена. 181 Таким образом, разработка PROTAC для деградации белка CDK8 стала новой стратегией преодоления этих недостатков.

Nathanael S. Gray и его коллеги впервые синтезировали серию соединений на основе кортистатина А. Результаты показали, что разработанные производные имеют слегка сниженную биологическую активность в отношении CDK8 в лабораторных и клеточных анализах.Затем, на основе этого каркаса, они разработали JH-XI-10-02 ( 24 ), 182 мощный деструктор CDK8 (рис. 15). Они наблюдали значительную деградацию CDK8 после обработки 24 при концентрации 1 мкМ в течение 24 часов в клетках Jurkat. Затем они проверили механизм, с помощью которого деградация опосредовалась через CRBN, используя отрицательный контроль в клетках Molt14, нокаутированных по CRBN. Разработка деструкторов CDK8 не только предоставила инструмент для регулирования уровней белка CDK8 in vivo, но также предложила эффективную стратегию лечения рака с помощью деструкторов CDK8.

Рис. 15

Химическая структура зарегистрированного CDK8 PROTAC.

CDK 9

Циклинзависимая киназа 9 (CDK9) является представителем семейства циклинзависимых протеинкиназ (CDK), которая может образовывать субъединицу комплекса положительного фактора элонгации транскрипции b (P-TEFb) с циклином T и играет критическую роль в удлинении транскрипции ряда онкогенов. 183,184,185 Он повсеместно экспрессируется во всех тканях и различных злокачественных новообразованиях. 186 Доклинические исследования показали, что избирательное воздействие на CDK9 может иметь терапевтический потенциал при лечении рака и других заболеваний человека. 187,188 Однако CDK9 демонстрирует высокий уровень консервативной последовательности с другими членами семейства CDK, что затрудняет разработку селективных ингибиторов CDK9. 189 Из-за разной формы поверхности и разного распределения остатков лизина на поверхности CDK это предоставит уникальную возможность разработать PROTAC, селективно нацеливающийся на CDK9, для которого требуется соответствующим образом экспонировать поверхность остатков лизина для убиквитинирования и протеасомной деградации. 190

В 2017 году Сандип Рана и его коллеги разработали первый селективный деструктор CDK9 путем конъюгации аналога аминопиразола и лиганда CRBN талидомида 191 (рис. 16). В клетках HCT116 вестерн-блоты показали, что деструктор CDK9 может восстанавливать примерно 56 и 65% белка CDK9 при 10 и 20 мкМ соответственно, не затрагивая других членов семейства CDK.

Рис. 16

Типичные PROTAC CDK9.

В 2018 году группа Натанаэля С. Грея разработала селективный деструктор CDK9, THAL-SNS-032, который состоял из многоцелевого ингибитора киназы CDK SNS-032 и производного талидомида 192 (рис.16). THAL-SNS-032 индуцировал быструю деградацию CDK9 с 99% D max при 250 нМ в клетках MOLT 4 после 6 ч обработки, но не влиял на уровни других мишеней SNS-032. Кроме того, THAL-SNS-032 проявлял более длительный фармакодинамический эффект, чем ингибиторы.

В отличие от PROTAC на основе аминопиразола и аминотиазола, нацеленных на CDK9, из двух вышеуказанных групп, 191,192 Zhiyu Li et al. получили деструктор CDK9 27 путем конъюгации природного продукта вогонина с помалидомидом 293 193 .16). PROTAC 27 избирательно расщеплял CDK9 и проявлял более сильную активность по ингибированию клеточной пролиферации (IC 50  = 17 ± 1,9 мкМ), чем вогонин (IC 50  = 30 ± 3,5 мкМ) Кроме того, 27 был гораздо менее активен в отношении клеточных линий с низким уровнем экспрессии CDK9, таких как L02 (IC 50 >100 мкМ).

CK2

Казеинкиназа 2 (CK2) представляет собой вездесущую и конститутивно активную серин/треониновую протеинкиназу с различными функциями. 194 Повышенная экспрессия CK2 связана с возникновением рака. 195

В 2018 году Гоу и его коллеги сообщили о PROTAC, нацеленных на CK2 путем конъюгации ингибитора CK2 (CX-4945) и помалидомида 196 (рис. 17). Среди зарегистрированных деструкторов соединение 28 показало деградацию CK2 в зависимости от дозы и времени. При деградации CK2 наблюдалось снижение фосфорилирования Akt и активация p53. Удивительно, но деструктор 28 показал цитотоксичность, аналогичную CX-4945 с ингибитором CK2, хотя механизм был совершенно другим.PROTAC, нацеленные на белки CK2, по-видимому, являются потенциальной стратегией лечения рака.

Рис. 17

Представитель PROTAC, нацеленный на CK2.

c-Met

c-Met представляет собой трансмембранную RTK и рецептор фактора роста гепатоцитов (HGF), который также известен как фактор рассеяния (SF). c-Met и HGF играют причинную роль в выживании, росте, ангиогенезе и метастазировании раковых клеток. После связывания с HGF/SF c-Met димеризуется, и трансфосфорилирование происходит в киназном домене (Y1234 и Y1235) и С-концевом стыковочном домене (Y1313, Y1349, Y1356 и Y1365). 197 Домен стыковки распознает многие нижележащие клеточные эффекторы, включая Src, Gab1, Crk, Grb2, SHC и PI3K, которые играют важную роль в биологии рака. Ингибиторы киназы c-Met были разработаны в течение последних почти 20 лет, но их клинические испытания не оправдали ожиданий. Это предполагает, что независимая от киназы функция может управлять онкогенезом и деградацией и может быть потенциальным преимуществом перед ингибированием.

Поэтому группа Crews разработала PROTAC, нацеленный на c-Met, на основе беспорядочного ингибитора форетиниба 47,103,198 (рис.18). И VHL, и CRBN PROTAC могут индуцировать деградацию c-Met в зависимости от дозы и времени. Быстрый клиренс c-Met с помощью VHL PROTAC на основе форетиниба наблюдался в течение 6 ч, что обеспечивало преимущество перед РНКи. Для РНКи обычно требуются реагенты для трансфекции или давление экзогенного отбора, которое может повлиять на другие биологические процессы. Поскольку RTK также расщепляются HSP90, они обнаружили, что VHL PROTAC на основе форетиниба и ингибитор HSP90 17-AAG обладают аддитивным действием на деградацию c-Met.Они также подтвердили, что VHL PROTAC на основе форетиниба индуцирует интернализацию c-Met с клеточной поверхности с помощью конфокальной иммунофлуоресцентной микроскопии. Делеция экзона 14 c-Met лишена сайта рекрутирования юкста-мембранного домена (Y1003) для его эндогенной лигазы E3, и, таким образом, естественный «выключатель» для HGF-индуцированной передачи сигналов больше не присутствует. VHL PROTAC на основе форетиниба может индуцировать деградацию c-Met с делецией экзона 14, несмотря на то, что она не расщепляется по естественному механизму, что является еще одним примером того, что деградация может иметь преимущество перед ингибированием.

Рис. 18

Репрезентативные PROTAC c-Met.

DHODH

Дигидрооротатдегидрогеназа (DHODH) представляет собой фермент флавинмононуклеотида (FMN) в митохондриях, который катализирует окисление дигидрооротата до оротата с коферментом Q в качестве кофактора в биосинтезе пиримидина de novo. Он обеспечивает строительные блоки для дальнейшего синтеза РНК, ДНК, гликопротеинов и фосфолипидов. 199 Ингибирование активности DHODH было предложено в качестве многообещающей терапевтической стратегии при вирусных инфекциях, раке, артрите и иммуносупрессии.Например, бреквинар, сильный ингибитор ДГОДГ, привлекал большое внимание в предыдущих исследованиях, но не прошел клинические испытания из-за его побочных эффектов и плохой растворимости.

Группа Neamati разработала зонды PROTAC на основе бреквинара, чтобы лучше понять терапевтическую значимость DHODH при раке 200 (рис. 19). Зонд 32 содержал важнейшую карбоновую кислоту и сохранял превосходную активность в ферментативном анализе (IC 50  = 0,093 мкМ). Напротив, метиловый эфир 31 не ингибировал активность ДГОДГ (IC 50  > 200 мкМ).Однако 32 не ингибировал рост клеток в клетках HCT-116, чувствительных к DHODH. И наоборот, 31 был более активен в клетках HCT-116, что может быть результатом превосходной клеточной проницаемости. Более того, 31 препятствовал образованию новых колоний лучше, чем бреквинар, который предполагал более глубокое биологическое свойство 31 . К сожалению, деградации белков не наблюдалось ни с 31 , ни с 32 из-за возможной значительно отличающейся системы убиквитинирования белка в митохондриях.

Рис. 19

Репрезентативные PROTAC компании DHODH.

EGFR и HER2

Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) представляет собой гликопротеин с тирозинкиназной активностью, который является основным представителем семейства онкогенов В эритробластоза (ErbB). 201 Семейство EGFR включает четыре подтипа: EGFR (ErbB1, HER1), ErbB2 (HER2), ErbB3 (HER3) и ErbB4 (HER4). 202 EGFR участвует в пролиферации опухолевых клеток, ангиогенезе, инвазии опухоли, метастазировании и ингибировании апоптоза.Сверхэкспрессия EGFR играет важную роль в прогрессировании злокачественных опухолей, таких как глиобластома, НМРЛ, рак головы и шеи, рак молочной железы, колоректальный рак, рак яичников, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы и так далее. 201,203,204 Терапия, нацеленная на EGFR, привела к разработке многих превосходных ингибиторов EGFR с высокой селективностью и небольшим количеством побочных эффектов. 49,146,205 Однако по-прежнему существует лекарственная устойчивость и низкий уровень клинического ответа, вызванный новыми мутациями при длительном клиническом лечении.62,63,206

клеток линии 90 584 h2975
Мутация Protac БЧ DC 50 (нМ) D макс (%)
OVCAR8 Wild-Type 33 33 Lapatinib 39.2 39.2 97.6 97.6 97.6
Hela (сверхэкспрессированный мутант) Exon 20 ints 33 736 736.2 68,8
HCC827 экзон 19 дель 34 гефитинибом 11,7 98,9
h4255 L858R 34 гефитинибом 22,3 96,6 +
L858R / Т790М 35 afatinib 215,8 79,1

Craig M. экипажей и соавторы сообщили некоторые EGFR деструкторов на основе ингибитора киназы лапатиниба, мутант-EGFR Selective гефитиниб, ингибитор второго поколения афатиниб и лиганд VHL (рис.20 и 21). Они обнаружили, что все разрушители способны вызывать деградацию EGFR. 198 Например, соединение 33 индуцировало деградацию EGFR с DC 50  = 39,2 нМ и D max  = 97,6% в клеточной линии OVCAR8. Соединение 33 обладало большей антипролиферативной эффективностью с IC50 50  = 102 нМ в клетках SKBr3. Кроме того, результаты показали, что соединение 33 также может разрушать мутантную форму EGFR со вставкой экзона-20 в клеточной линии HeLa.Селективный мутантный EGFR гефитиниб был использован для замены боеголовки для разработки соединения 34 , которое позволило расщепить делецию экзона-19 EGFR (DC 50  = 11,7 нМ и D max  = 98,7%). Клеточная линия HCC827 и мутация точки активации L858R (DC 50  = 22,3 нМ и D max  = 96,6%) в клеточной линии h4255. Когда для разработки соединения 35 использовали ингибитор второго поколения афатиниб, он мог разлагать устойчивый к гефитинибу двойной мутантный (L858R/T790M) EGFR с DC 50  = 215.8 нМ и D max  = 79,1% в клеточной линии h2975.

Рис. 20

Эффективность EGFR PROTAC в различных клеточных линиях. 198

Рис. 21

Репрезентативные PROTAC EGFR и HER2.

Учитывая, что лапатиниб также эффективно связывает другие RTK, они оценили потенциальную способность соединения 33 к деградации HER2. Они обнаружили, что соединение 33 способно индуцировать деградацию HER2 при 25 нМ, но не проявляет селективности между EGFR и HER2.Основываясь на результатах, они разработали новые соединения с другими линкерами и протестировали активность и селективность в отношении HER2. Наконец, эти соединения только избирательно разрушали EGFR и не влияли на HER2.

Кроме того, был запатентован дизайн деструкторов EGFR. В патенте они обнаружили, что соединение 36 обладает хорошей активностью по расщеплению EGFR. Очевидно, что деградацию EGFR можно наблюдать с соединением 36 при 100 нМ. Соединение 36 также обладало хорошей антипролиферативной активностью в отношении мутанта L858R и мутанта L858R/T790M с IC 50 300 нМ в клетках Ba/F3.

eIF4E

Эукариотический фактор инициации трансляции 4E (eIF4E) представляет собой кэп-связывающий белок, который специфически распознает кэп m7GpppX на 5′-конце кодирующей мРНК, который влияет на инициацию эукариотической трансляции. 207,208,209

Связывание eIF4E с кэпом мРНК приводит к включению механизма трансляции, а затем инициирует синтез белка в стартовом кодоне транскрипта. eIF4E оказывает большое влияние на пролиферацию, дифференцировку и метастазирование клеток. 210 Исследования показали, что eIF4E сверхэкспрессируется во многих злокачественных клеточных линиях и первичных опухолях у животных и человека, включая рак молочной железы, рак легких и неходжкинские лимфомы. 211 Сообщалось, что ингибирование функции eIF4E может замедлять рост опухоли и вызывать апоптоз. 212 Таким образом, разработка новых деструкторов eIF4E является новой стратегией лечения многих видов рака. 213 214

Аманда Л. Гарнер и его коллеги впервые разработали новые PROTAC для деградации eIF4E (рис.22). Они создали небольшую библиотеку производных GxP (GMP или GDP), конъюгированных с леналидомидом и лигандом VHL. 215 В предыдущем отчете было показано, что GxP (GMP или GDP) является хорошим ингибитором eIF4E, поэтому он был выбран в качестве каркаса Bn7GxP. Чтобы проверить способность соединений к деградации, они разработали анализ конкуренции шапки in vitro. В этом анализе лизаты клеток HEK293 инкубировали с агарозной смолой m7GxP (GMP или GDP), чтобы обеспечить аффинную очистку eIF4E.

Рис.22

Представитель PROTAC eIF4E.

В тестах биохимической характеристики они обнаружили, что все конъюгаты GDP были активны, в то время как производные GMP не обладали способностью к деградации. В частности, соединение 37 было способно значительно разлагать eIF4E при 50 мкМ, а eIF4E полностью разлагалось, когда концентрация соединения увеличивалась до 500 мкМ. Однако при обработке клеток MDA-MB231 и K562 этими соединениями внутриклеточная деградация eIF4E не наблюдалась, несмотря на концентрации соединения до 500 мкМ.Они предполагают, что основной причиной была низкая клеточная проницаемость, как это наблюдалось с другими аналогами колпачка.

ER

ER является регулятором экспрессии генов и многих биологических процессов в качестве ядерного рецептора, включая ERα и ERβ. Восемьдесят процентов всех вновь диагностированных случаев рака молочной железы являются положительными по ERα, 194 , поскольку ERα считается основным регулятором, передающим сигналы эстрогена в женских половых путях и молочных железах. 216 В настоящее время стандартом лечения является фулвестрант, который действует путем избирательной деградации рецептора эстрогена при ER+ метастатическом раке молочной железы.Хотя фулвестрант оказывает терапевтическое воздействие за счет деградации ER, после шести месяцев лечения фулвестрантом сохраняется до 50% ER по сравнению с исходным уровнем. Следовательно, у различных ER+ раков молочной железы возникла лекарственная устойчивость, хотя одобренные методы лечения обеспечили успех в этой популяции пациентов.

В 2018 г. компания Arvinas задокументировала АРВ-471 в качестве деструктора ER для лечения метастатического рака молочной железы ER+ в качестве пероральной терапии (рис. 22). АРВ-471 индуцировала явную деградацию ER при концентрации 11 нМ в различных клеточных линиях рака молочной железы.АРВ-471 продемонстрировал 99% ингибирующий эффект на рост опухоли при 10 мпк и 106% эффект при 30 мпк (ниже) в PDX на модели пациента с мутацией ESR1 после перорального введения. В то же время фулвестрант продемонстрировал менее сильное ингибирование роста опухоли. Эти данные показали, что АРВ-471 продемонстрировал сильное ингибирование роста опухоли по сравнению с фулвестрантом. Как было выпущено Arvinas, ARV-471 обладал многообещающей активностью и эффективностью как в качестве отдельного агента, так и в качестве комбинированной терапии с ингибиторами CDK4/6 за счет деградации ER.Исследование фазы 1 в третьем квартале было начато в 2019 году компанией Arvinas для женщин с местнораспространенным или метастатическим ER+-положительным/HER2-отрицательным раком молочной железы.

В 2018 году Ван и его коллеги раскрыли сильнодействующий деструктор ER под названием ERD-308 217 (рис. 23). ERD-308 индуцировал эффективную деградацию ER в клеточных линиях рака молочной железы MCF7 и T47D ER+ с DC 50 0,17 и 0,43 нМ соответственно. По сравнению с фулвестрантом деградант вызывал более полную деградацию мишени и демонстрировал более сильное ингибирование роста клеток MCF-7.Эти данные демонстрируют новый тип деструкторов ER для лечения распространенного и метастатического ER+ рака молочной железы.

Рис. 23

Репрезентативные PROTAC, нацеленные на лекарственно-устойчивый ER.

ERK1 и ERK2

ERK1 и ERK2 являются близкородственными серин/треонинкиназами и участвуют в каскаде передачи сигнала Ras-Raf-MEK-ERK, который участвует во многих биологических процессах, включая клеточную адгезию, ход клеточного цикла, миграцию клеток, выживаемость, дифференцировка, метаболизм, пролиферация и транскрипция клеток, катализируя фосфорилирование сотен цитоплазматических и ядерных субстратов. 218,219 Этот сигнальный путь вовлечен в многочисленные виды рака. Деградация уровней ERK1 и ERK2 может быть выгодным подходом по сравнению с ингибированием, поскольку значительная часть передачи сигналов с помощью ERK1 и ERK2 возникает в результате белок-белковых взаимодействий в дополнение к каталитической активности.

Группа Хайтмана предположила, что PROTAC обладают высокой молекулярной массой, которая ограничивает их проникновение в клетки, и другими лекарственными свойствами 62 (рис. 24).Они разработали два предшественника меньшего размера, которые могли внутриклеточно формировать молекулу PROTAC, нацеленную на ERK1 и ERK2, с помощью биоортогональной комбинации кликов на основе ковалентного ингибитора и талидомида, меченного тетразином. Разложение ERK1 и ERK2 было завершено через 16 часов в присутствии зонда 40 (10 мкМ) и Tz-талидомида 39 (10 мкМ). Когда ERK-CLIPTAC готовили перед добавлением к клеткам, не происходило деградации ERK1 или ERK2. Эти результаты указывали на отсутствие проницаемости молекулы PROTAC для клеток и подтверждали, что деградация происходила в результате щелчкового образования PROTAC из двух меньших молекул-предшественников после их проникновения в клетки.

Рис. 24

Репрезентативные PROTAC ERK1 и ERK2.

ERRα

Являясь членом суперсемейства орфанных ядерных рецепторов, рецепторы, связанные с эстрогеном (ERR), играют важную роль в поддержании гомеостаза в организме, включая раннее развитие, регулируемое ERRβ, и метаболический баланс, связанный с ERRα и ERRγ. 220,221,222 ERRα имеет относительно высокую гомологию с рецептором эстрогена α (ERα) и отвечает за регулирование метаболизма и гомеостаза энергии путем взаимодействия с несколькими транскрипционными кофакторами, такими как белки коактиватора 1 рецептора, активируемого пролифератором пероксисом (т.например, PGC-1α и PGC-1β), взаимодействующий с рецептором белок 140, корепрессор (RIP-140) и т. д. 223,224,225

205 (рис. 25). Разработанный деструктор показал дозозависимое снижение уровней ERRα в клетках MCF-7. DC 50 составлял около ~100 нМ, а D max составлял 86%. Кроме того, они оценили эффективность ERRα PROTAC in vivo.После лечения деструкторами наблюдалось значительное снижение уровней ERRα в сердце и почках, а также в опухолях MDA-MB-231 примерно на 44%, 44% и 39% соответственно по сравнению с введением равного объема ингибиторов ERRα. PROTAC_ERRα PROTAC сохранял свою деградационную активность in vivo, распределяясь в тканях и снижая уровни ERRα при воздействии на мишень.

Рис. 25

Репрезентативные PROTAC, нацеленные на ERRα.

В 2019 году группа Ding разработала серию производных (E) -3-(4-((2,4-бис(трифторметил)бензил)окси)-3-метоксифенил)-2-цианоакриламида для выявления новых деструкторы рецептора эстрогена α (ERRα) 226 (рис.25). Репрезентативный расщепитель, 43 , был способен специфически расщеплять белок ERRα на >80% от 30 нМ, что до сих пор считалось одним из наиболее селективных и мощных расщепителей ERRα.

FAK

Киназа фокальной адгезии (FAK или PTK2) широко экспрессируется у разных видов и имеет более 90% гомологии аминокислотной последовательности. 227 Он проявляет киназозависимую функцию фермента и независимую от киназы функцию каркаса, обе из которых имеют решающее значение в развитии рака (например,г., инвазия, метастазирование и ангиогенез), ранний эмбриональный, репродуктивный и так далее. 228,229,230,231 За исключением киназного домена, 232 FAK содержит три других функциональных домена: полоса 4.1, эзрин, радиксин, моэзин (FERM) N-концевой домен, богатые пролином области (PRI-III) и нацеливание на фокальную адгезию ( FAT) С-концевой домен. 233,234 Домен FERM играет важную роль в клеточной регуляции. 235,236,237 Домен PR и FAT в основном участвуют в различных белок-белковых взаимодействиях, 238 все из которых опосредуют независимую от киназы FAK передачу сигналов и участвуют в формировании больших сигнальных комплексов. 239,240 Однако текущий набор инструментов медицинской химии ограничивает разработку химических соединений для ингибирования FAK и игнорирует функции поддержки FAK. Хотя эффективность нескольких ингибиторов FAK была доказана в доклинических исследованиях, клинического успеха пока не наблюдалось. 239,241,242 Кроме того, к традиционным ингибиторам киназы может привести лекарственная устойчивость, поскольку они могут действовать только на киназный домен. Таким образом, новые стратегии устранения как ферментативных функций FAK, так и функций каркаса очень важны для заболеваний, связанных с FAK.

В 2018 году группа Craig M. Crews сообщила о первом наномолярном FAK-таргетинге PROTAC, 44 , на основе дефактиниба и убиквитинлигазы VHL E3 100 (рис. 26). Соединение 44 показало лучшую селективность в отношении белка и сильное расщепление белка. Его DC 50 составлял 3 нМ, а D max составлял 99% в бессывороточных обработанных клетках PC3 через 24 часа. Кроме того, 44 значительно нарушил миграцию клеток и привел к уменьшению заживления ран после лечения 50 нМ и 250 нМ через 24 часа лечения в клетках тройного негативного рака молочной железы человека (MDA-MB-231).В анализе инвазии клеток Transwell 44 снижал инвазию клеток MDA-MB-231 на целых 65% при концентрации 100 нМ в течение 24 часов. Более того, 44 также превосходил дефактиниб в отношении активации FAK и последующей передачи сигналов. Однако это не повлияло на пролиферацию клеток.

Рис. 26

Представитель PROTAC компании FAK.

В 2019 году группа Питера Эттмайера разработала два высокоселективных и функциональных FAK-таргетинга PROTAC (BI-3663 и BI-0319) с использованием лигандов CRBN и VHL 243 (рис.26). BI-3663 (на основе CRBN) расщепил FAK с DC 50 30 нМ на панели из 11 клеточных линий гепатоцеллюлярной карциномы человека. Несмотря на эффективную деградацию FAK, эти соединения по-прежнему не влияли на пролиферацию клеток ни в одной из протестированных клеточных линий.

Недавно группа Yu Rao разработала FAK-направленные PROTAC с ингибиторами FAK (PF562271 или VS6063) и лигандом CRBN 244 (рис. 26). FC-11 (FAK PROTAC на основе PF562271) показал пикомолярную деградацию FAK в тестируемых клеточных линиях (DC 50 в тестируемых клеточных линиях составляли 40 пМ в Ramos, 80 пМ в PA1, 310 пМ в TM3, 330 пМ в MDA). -MB-436 и 370 пМ в клеточных линиях LNCaP).Однако, как и другие зарегистрированные FAK PROTAC, 100 243 FC-11 не влиял на пролиферацию клеток в протестированных клеточных линиях в большей степени, чем PF562271. Следовательно, требуется дополнительная работа для изучения биологии, связанной с FAK.

FLT-3

FMS-подобная тирозинкиназа 3 (FLT3), относится к семейству RTK типа III, играет важную роль в клеточной пролиферации, дифференцировке и апоптозе. 245,246 Около 30% пациентов с недавно диагностированным острым миелоидным лейкозом (ОМЛ) обнаруживают мутации FLT3; они в основном включают мутации внутренней тандемной дупликации (ITD) в 20–25% случаев ОМЛ и точечные мутации (например,g., D835) в тирозинкиназном домене (TKD) примерно в 5–10% случаев. 247,248,249 Мутации как FLT3-ITD, так и TKD приводят к постоянной активации FTL3 и потере аутоингибирующей функции на FLT3, что в конечном итоге способствует активации нижестоящих сигнальных путей STAT, PI3K/Akt и MAPK/ERK. 250,251,252 В последние годы много усилий было направлено на разработку низкомолекулярных ингибиторов FLT3. Хизартиниб (AC220), гилтеритиниб, MLN-518, сунитиниб и понатиниб изучаются в клинических испытаниях. 253,254,255,256,257 Хотя эти ингибиторы FLT3 проявляют мощную активность против ОМЛ в клинических испытаниях, приобретенная лекарственная устойчивость и рецидивы все еще остаются проблемами для терапии, направленной на FLT3.

В 2018 году Натаниэль С. Грей и его коллеги синтезировали два FLT3-специфических PROTAC, TL13-117 и TL13-149, на основе изучения мультикиназного разрушителя TL12-186. Эти специфические PROTAC, нацеленные на FLT3, были синтезированы путем конъюгации клинического кандидата квизартиниба и лиганда CRBN помалидомида с линкером PEG (фиг.27). 169 В клетках MOLM-14 TL13-117 и TL13-149 вызывали наиболее эффективную деградацию FLT3 при концентрациях от 10 до 100 нМ соответственно. Тем не менее, квизартиниб показал примерно в пять раз более низкую IC50 50 , чем TL13-117 и TL13-149 в клетках MOLM-14 и MV4-11, что указывает на то, что TL13-117 и TL13-149 индуцированная деградация FLT3 обеспечивает небольшое улучшение их антипролиферативные эффекты.

Рис. 27

Репрезентативные PROTAC FLT3.

В том же году Крейг М.Группа Crews разработала FLT3 PROTAC, объединив квизартиниб и лиганд VHL E3 с оптимизированным линкером (рис. 27). 258 Этот PROTAC продемонстрировал низкие наномолярные концентрации деградации FLT3-ITD в клетках MV4-11 и MOLM-14, а активность ингибирования роста клеток была более чем в 3,5 раза более сильной, чем у квизартиниба с субнаномолярной IC50 50 (0,6 ± 0,08 нМ) в отличие от FLT3 PROTAC, о которых сообщалось ранее, которые не давали преимущества. 169 Кроме того, FLT3 PROTAC был способен индуцировать деградацию FLT3 ITD в ксенотрансплантатных опухолях MV4-11 в дозе 30 mpk (уровни препарата в плазме поддерживались на уровне > 5 нМ во время лечения).

HDAC6

Деацетилазы гистонов (HDAC) представляют собой класс протеаз, основной функцией которых является изменение структуры хромосом и регулирование экспрессии генов. 259 HDAC6 относится к семейству HDAC типа II, которое обладает уникальными структурными и биологическими свойствами. 260,261,262 HDAC6 имеет два функциональных домена деацетилирования и один мотив цинкового пальца, которые необходимы HDAC6 для проявления его биологической активности. Все большее число исследований показало, что HDAC6 тесно связан с возникновением и развитием опухолей. 259,263,264 Ингибиторы HDAC6 могут ингибировать пролиферацию раковых клеток, способствовать апоптозу и оказывать положительное воздействие на различные злокачественные опухоли, такие как множественная миелома (ММ), неходжкинская лимфома (НХЛ) и другие злокачественные опухоли. 262,265 Однако большинство ингибиторов HDAC6 плохо селективны и действуют на различные изоформы HDAC, особенно HDAC1 и HDAC3. Хотя они обладают очевидным антидифференцировочным и антипролиферативным действием, побочные эффекты также очевидны, включая миелосупрессию, потерю массы тела, утомляемость и аритмию и т. д., что ограничивает их серьезное использование. 264 266 267

В 2018 году Тан и его коллеги спроектировали и разработали первый деструктор цинк-зависимых HDAC путем конъюгации неселективных ингибиторов HDAC с убиквитинлигазой E3 268 (рис. 28). В этой работе они обнаружили, что расщепление репрезентативного соединения 51 происходило при 41 нМ и достигало максимального эффекта в диапазоне от 123 до 370 нМ в клетках MCF-7. DC 50 и D max были 34 нМ и 70.5% соответственно. Хук-эффект не наблюдался при более высоких концентрациях. Они также обнаружили, что максимальный эффект деградации HDAC6 наблюдался уже при 80 нМ, когда они использовали соединение 51 для обработки клеточной линии MM.1S в течение 6 часов.

Рис. 28

Репрезентативные PROTAC HDAC6.

В 2019 году они сообщили о новом поколении многофункциональных деструкторов HDAC6 путем связывания селективного ингибитора HDAC6 нексурурастата A с лигандом CRBN, который может быть синергическим для антипролиферации MM 269 (рис.28). В этой работе они обнаружили, что соединение 52 снижает уровень HDAC6 при такой низкой концентрации, как 3 нМ, и достигает максимального эффекта примерно при 30 нМ. Он показал DC 50 приблизительно при 1,6 нМ в клеточной линии MM.1S, что было примерно в 5-6 раз выше, чем у соединения 51 . В то же время они обнаружили, что соединение 52 обладает хорошей селективностью в отношении HDAC6 и демонстрирует меньшую деградацию HDAC1, HDAC3 и HDAC4.

В 2019 году Рао и его коллеги сообщили о разработке мощных инструментов PROTAC для селективной деградации белка HDAC6 (рис.28). Они также выбрали nexturastat A (Nex A) в качестве связующего HDAC6, но они модифицировали молекулу PROTAC на алкильную цепь вместо бензольного кольца в соединении 52. 270 мощный деструктор, который может значительно снизить уровень белка HDAC6 при концентрации 100 нМ в клетках HeLa. Они также оценили потенциал деградации в различных клеточных линиях и обнаружили, что соединение 53 последовательно индуцирует значительную деградацию HDAC6 во всех клеточных линиях, но проявляет наилучшую чувствительность в клеточной линии MM MM.1С. Более того, они обнаружили, что соединение 53 обладало хорошей селективностью в отношении HDAC6 и не оказывало влияния на деградацию HDAC1, HDAC2 или HDAC4 даже при концентрации 10 мкМ. Соединение 53 имело DC 50 3,8 нМ против HDAC6, а GI 50 составляло 1,21 мкМ в клетках MM.1S. Процесс деградации также хорошо иллюстрируется визуализацией на основе флуоресценции.

MCL1

Миелоидно-клеточный лейкоз 1 (MCL1) представляет собой белок, способствующий выживанию, сверхэкспрессируемый при различных видах рака, таких как лимфома, лейкемия, рак молочной железы и ММ. 271 MCL1 может комбинироваться с проапоптотическими факторами Bim, Bak и Bax с помощью ИПП и подавлять их проапоптотические функции. 272 Таким образом, MCL1 считается критическим фактором выживания при раке человека. Учитывая, что ингибирование традиционными небольшими молекулами зависит от заполнения кармана при определенной концентрации и в течение достаточного времени, ИПП трудно нацелить из-за их неглубоких областей связывания. Поскольку PROTAC могут индуцировать деградацию белка без необходимости высокой аффинности связывания, PROTAC обладают большим потенциалом для решения этой проблемы.

В 2019 г. Дерксен и его коллеги разработали dMCL1-2 и подтвердили образование тройного комплекса 273 (рис. 29). Они доказали, что по сравнению с контролем ДМСО dMCL1-2 может вызывать заметное снижение уровней MCL1 при 100 нМ в клетках OPM2 путем инициирования убиквитинирования MCL1.

Рис. 29

Типичные PROTAC, нацеленные на MCL1.

Как упоминалось выше, MCL1 взаимодействовал с BCL2. Поэтому Чжан и его коллеги также осознали деградацию MCL1 с помощью PROTAC C1 со значением DC 50 , равным 0.7 мкМ и в то же время добились деградации BCL2 128 (рис. 29).

MDM2

Онкосупрессор p53 играет ключевую роль в регуляции многих клеточных процессов и предотвращении развития рака. 274 Однако мутации или делеции р53 происходят примерно в 50% случаев рака человека, что приводит к инактивации функции подавления опухолей р53. 275 Мышиная двойная минута 2 (MDM2) является отрицательным эндогенным клеточным регулятором p53. Как лигаза E3, она может связываться с p53 и убиквитинировать его, что в конечном итоге приводит к эффективной деградации p53. 276 Действительно, MDM2 сверхэкспрессируется при некоторых опухолях дикого типа p53 человека. Чтобы восстановить супрессорную функцию опухоли p53, нарушение взаимодействий MDM2-p53 стало многообещающей терапевтической стратегией при раке человека p53 дикого типа. Однако ингибирование p53 приводит к сверхэкспрессии и накоплению MDM2, что может привести к проблемам с токсичностью. Кроме того, несмотря на значительный прогресс в разработке ингибиторов MDM2, лекарственная устойчивость стала существенным ограничением. Таким образом, стратегия PROTAC стала весьма желательным методом модуляции уровней MDM2.

В 2018 году группа Shaomeng Wang опубликовала первый мощный деструктор MDM2, MD-224, путем привязки спирооксиндолового ингибитора MDM2 MI-1061 к лиганду CRBN леналидомиду 61 (рис. 30). MD-224 эффективно индуцировал деградацию MDM2 в субнаномолярных концентрациях в клетках лейкемии человека. Он достиг значения IC 50 1,5 нМ для ингибирования роста клеток RS4; 11 и других клеточных линий лейкемии. Кроме того, MD-224 также продемонстрировал полную и стойкую регрессию опухоли in vivo, что превосходит ингибитор MI-1061.

Рис. 30

Химическая структура заявленного ингибитора MDM2 и PROTAC.

В 2019 году группа Weiping Tang сообщила о втором разрушителе MDM2, разрушителе 32, за счет соединения лиганда MDM2 (нутлин) и лиганда лигазы CRBN E3 (леналидомид) (рис. 30). 277 Разрушитель 57 индуцировал эффективную деградацию MDM2 со значением DC 50 23 нМ в клетках лейкемии RS4;11. Он также ингибировал пролиферацию лейкозных клеток с помощью IC 50 , равной 3,2 нМ, что было почти в 1000 раз более эффективным, чем у ингибитора MDM2.

p38α и p38δ

Киназы p38 MAPK активируются различными клеточными стрессами и воспалительными цитокинами. 278,279 Они состоят из четырех членов (p38α, p38β, p38γ и p38δ), но сообщалось о редких селективных по изоформе химических пробах. 47 p38 MAPKs активируются посредством двойного фосфорилирования их мотива Thr-Gly-Tyr в их петле активации и последующих характерных глобальных конформационных изменений. Среди изоформ p38α является наиболее изученной изоформой, поэтому для нее было разработано множество ингибиторов, но они показали ограниченную эффективность и безопасность.Напротив, p38δ недостаточно изучен для лечения рака и диабета, и его функциональное ингибирование, по-видимому, не поддается лечению.

Группа Crews разработала p38α- и p38δ-селективные PROTAC на основе форетиниба и различных лигандов E3-лигазы (VHL) 47 (рис. 31). SJFα разлагал p38α с DC 50 7,16 нМ и D max 97,4%, в то время как он был менее эффективен против p38β, p38γ и p38δ. SJFδ разложил p38δ с DC 50 46,17 нМ и D max 99.4%, при этом он не разрушал p38α, p38β или p38γ. Затем они использовали анализ трехкомпонентных комплексов in vitro, чтобы продемонстрировать селективность. Было обнаружено, что SJFα способствует только тройному комплексу VHL:PROTAC:p38α, тогда как в присутствии SJFδ таких тройных частиц не обнаружено. Однако как SJFα, так и SJFδ могут взаимодействовать с тройными комплексами VHL:PROTAC:p38δ с одинаковой эффективностью. Таким образом, они использовали поверхностный плазмонный резонанс (ППР) для изучения кинетики сборки бинарных и тройных комплексов.Комплекс SJFδ показал увеличенный период полураспада ( t 1/2  = 38 с) по сравнению с комплексом SJFα ( t 1/2  = 8 с), что указывает на то, что p38δ:SJFδ:VHL является более благоприятный тройной комплекс по сравнению с p38α:SJFδ:VHL, что соответствует исходам деградации. Моделирование молекулярной динамики (МД) на комплексах p38δ:SJFδ:VHL и p38δ:SJFα:VHL показало, как длина и ориентация линкера для рекрутирования VHL на разных PROTAC могут привести к различным тройным интерфейсам для достижения селективной деградации.

Рис. 31

Репрезентативные PROTAC p38α и p38δ.

PARP1

Поли(АДФ-рибозо)полимеразы (ПАРП) относятся к ДНК-зависимым ядерным ферментам, выполняющим роль переноса отрицательно заряженных фрагментов АДФ-рибозы с клеточного НАД+ на различные белковые субстраты. 280 PARP1 является наиболее распространенным ядерным ферментом семейства PARP. Он обладает функциями восстановления повреждений ДНК, вызванных репликацией, воздействием экзогенных токсинов, ионизирующего излучения, ультрафиолетового излучения, факторов окружающей среды, химиотерапии, клеточных метаболитов, лучевой терапии и т. д.и играет роль в остановке гибели клеток. 281 Из-за ключевой роли PARP1 в реакции на повреждение ДНК он считается мощной терапевтической мишенью для лечения рака. В настоящее время ряд ингибиторов PARP1, таких как олапариб, нирапариб и инипариб, находятся на разных стадиях клинических испытаний. 282 Однако цитотоксичность и лекарственная устойчивость являются самыми большими препятствиями для их использования у пациентов. Таким образом, другие терапевтические методы с новыми механизмами действия остаются крайне необходимыми.

В 2018 году группа Yu Rao опубликовала первый PROTAC, нацеленный на PARP1 (соединение 60 ), соединив ингибитор PARP1 нирапариб и лиганд MDM2 нутлин-3 283 (рис.32). После широкого скрининга деградации в нескольких клеточных линиях тройного негативного рака молочной железы (TNBC) было обнаружено, что соединение 60 может избирательно индуцировать значительную деградацию PARP1 и клеточный апоптоз в клетках MDA-MB-231. Кроме того, соединение 3 в пять раз превосходит ингибиторы PARP1 (нирапариб, олапариб и велипариб) в отношении антипролиферативной активности и не проявляет цитотоксичности в нормальных клетках.

Рис. 32

Представитель PROTAC компании PARP1.

PI3K

Фосфоинозитид-3-киназы (P13Ks) представляют собой внутриклеточные фосфатидилинозитолкиназы, входящие в состав сигнального пути PI3K/Akt/mTOR, которые участвуют в регуляции клеточной пролиферации, апоптоза и дифференцировки. 284,285,286 Недавние исследования показали, что гиперэкспрессия P13K-зависимого сигнального пути является основным признаком онкогенеза. В соответствии с различными структурами и функциями PI3K обычно подразделяют на три класса, среди которых PI3K класса I считаются наиболее тесно связанными с развитием опухоли и наиболее часто изучаемым ферментом. 287 288 289 290 Класс I PI3K можно разделить на IA (PI3Kα, PI3Kβ и PI3Kδ) и IB (PI3Kγ). Хотя многие ингибиторы PI3K уже разработаны, их лекарственные свойства серьезно ограничены из-за низкой селективности и побочных эффектов. 291,292,293 Более того, высокая частота мутаций гена PIK3CA, который кодирует PI3Kα в солидных опухолях, затрудняет разработку ингибиторов PI3Kα. 294,295 Таким образом, разработка новых агентов деградации белка, нацеленных на белок PI3K, стала отличной стратегией.

Цзян и его коллеги разработали и синтезировали серию потенциальных PROTAC на основе CRBN и ZSTK474 для разложения PI3K 296 (рис. 33).Репрезентативное соединение 61 индуцировало заметную деградацию PI3K при 10  мкМ, а фосфорилирование Akt, S6K и GSK-3β в сигнальном пути PI3K/Akt/mTOR также может подавляться в клетках HepG2. Однако ферментативная активность репрезентативного соединения -61- в отношении PI3Kα оказалась хуже, чем у контрольного ZSTK474.

Рис. 33

Представитель PROTAC компании PI3K.

Пирин

Пирин является железосвязывающим членом надсемейства белков купина и, как сообщается, является регулятором фактора транскрипции. 297 Он взаимодействует с BCL3, протоонкобелком, связываясь с путем NFκB через комплекс пирин/p65/ДНК. Было высказано предположение, что роль человеческого пирина заключается в том, чтобы быть окислительно-восстановительным регулятором фактора транскрипции под контролем фактора транскрипции NRF2 посредством изменений клеточного окислительного стресса. Нокдаун пирина с помощью siRNA может подавлять миграцию и пролиферацию раковых клеток. 298 299

Джонс и его коллеги сообщили о высокоаффинном пириновом химическом зонде CCT251236 с помощью фенотипического скрининга для разработки PROTAC, нацеленных на пирин 300 (рис.34). Их PROTAC первого поколения обладали хорошим сродством к пирину и комплексу CRBN-DDB1, но не наблюдалось заметной деградации пирина или воздействия на раковые клетки. Они предположили, что физико-химические свойства были основной причиной отказа PROTAC первого поколения. Они уменьшили количество tPSA и HBD, сохранив приемлемый Log D 7,4, чтобы сбалансировать проницаемость и растворимость в PROTAC второго поколения, что дало обнадеживающие результаты. Однако талидомидный лиганд, нацеленный на CRBN, в PROTAC быстро разлагается при 37°C при pH 7.4 фосфатный буфер. Поэтому они стремились дополнительно оптимизировать проницаемость в третьем поколении, чтобы быстрее достичь более высоких свободных внутриклеточных концентраций. При обработке пирином третьего поколения PROTAC CCT367766 можно было наблюдать почти полную деградацию пирина при обработке всего 50 нМ и всего 2 часа воздействия. Масс-спектрометрия всего протеома показала хорошую селективность PROTAC CCT367766.

Рис. 34

Представитель PROTAC из пирина.

PRC2 (нацеленный на EED)

Репрессивный комплекс Polycomb 2 (PRC2) включает три основные субъединицы: развитие эмбриональной эктодермы (EED), энхансер гомолога zeste 1 (EZh2) или EZh3 и супрессор гомолога zeste 12 (SUZ12). 301 PRC2 обладает активностью гистонметилтрансферазы (HMT), которая устанавливает и поддерживает моно- или триметилирование лизина 27 гистона 3 (h4K27). Сложная сеть белок-белковых взаимодействий между EED, EZh3 и SUZ12 необходима для каталитической активности PRC2. 302,303,304 Сообщалось, что PRC2 ведет себя как онкоген и как супрессор онкогенеза при различных типах рака. EZh3, EED и SUZ12 обычно активируются и также подвержены мутациям при некоторых видах рака, таких как рак молочной железы, колоректальный рак и рак предстательной железы. 302,305 Таким образом, нацеливание на PRC2 для лечения рака стало эффективной стратегией. В настоящее время эффективное ингибирование каталитической активности PRC2 было достигнуто путем воздействия как на EED, так и на EZh3. Несмотря на клиническую разработку нескольких ингибиторов EZh3 (например, UNC1999, GSK126, EPZ-6438, CPI-1205 и DS-3201b) и EED (например, EED226, A-395 и MAK683), лекарственная устойчивость наблюдалась и ограничение для этого класса молекул. Поэтому необходимы новые подходы для преодоления наблюдаемого сопротивления.

Группа Lindsey I. James впервые сообщила о химическом разрушителе PRC2, UNC6852, который содержал лиганд, производный от EED226, и лиганд VHL (рис. 35). 306 UNC6852 сильно разлагал EED и EZh3 со значениями DC 50 0,79 ± 0,14 мкМ и 0,3 ± 0,19 мкМ соответственно, в то время как SUZ12 показал меньшую деградацию. Кроме того, UNC6852 блокировал активность гистонметилтрансферазы EZh3 и ингибировал пролиферацию клеток DB (линия клеток DLBCL, содержащая мутант EZh3 Y641N) с EC 50 из 3.4 ± 0,77 мкМ через 9 дней лечения, что было аналогично ингибиторам EED226 и UNC1999

Рис. 35

Представитель PROTAC PRC2.

RIPK2

Серин-треонинкиназа RIPK2 является важным врожденным иммунным медиатором передачи сигналов NOD1 и NOD2. 307 NOD1 и NOD2 представляют собой цитозольные рецепторы для производных бактериального пептидогликана, таких как мурамилдипептид (MDP), которые связаны с активированным RIPK2 и привлекают киназы, такие как TAK1, IKKα, IKKβ и IKKγ, для активации NF-κB и MAPK.Это приводит к экспрессии различных воспалительных белков и антибактериальных белков, активации аутофагии и презентации антигена. Сигнальный путь NOD-RIP2 особенно важен для воспаления кишечника и иммунитета слизистых оболочек в дыхательной системе, который регулируется убиквитинированием.

Группа Crews разработала молекулу PROTAC_RIPK2, нацеленную на RIPK2 ( 63 ), которая дала D max >95% при концентрациях более 10 нМ и DC 50

.4 нМ

205 (рис. 36). Затем они обратились к одному из аспектов действия PROTAC: субстехиометрическому катализу, при котором одна молекула PROTAC способна вызывать убиквитинирование и деградацию нескольких молекул белка-мишени. Для определения каталитической природы PROTAC_RIPK2 они определили абсолютное количество RIPK2 с помощью жидкостного сцинтилляционного анализа в реакциях, содержащих 0,50, 1,0 и 2,0 моль PROTAC, в результате чего было получено 1,7, 3,4 и 4,0 пмоль модифицированного RIPK2 соответственно, что соответствует Стехиометрия 3.3, 3.4 и 2.0. Эти данные свидетельствуют о каталитическом способе деградации PROTAC. Однако они считали, что каталитическая способность была недооценена для клеточной среды и полиубиквитинирования. Протеомное исследование клеточной количественной экспрессии также выявило высокую специфичность в отношении деградации мишени.

Рис. 36

Представитель PROTAC РИПК2.

Rpn13

Rpn13 связан с регуляторным компонентом 19S протеасомы и захватывает убиквитинированные белки в качестве субстрата для деградации через протеасому 20S. 308 Фрагменты убиквитина затем удаляются из захваченного субстрата с помощью фермента деубиквитинирования UCh47 в протеасоме 19S, который затем разворачивается с помощью ААА-АТФаз для дальнейшей деградации, опосредованной протеасомой 20S. Ингибирование протеасомы является эффективной стратегией лечения множественной миеломы (ММ), но нацеливание на различные компоненты убиквитин-протеасомной системы остается неуловимым. Экспрессия Rpn13 выше в клетках ММ и играет важную роль в росте и выживании клеток ММ.И РНК-интерференция, и ингибиторы подтвердили, что Rpn13 является лекарственной мишенью для ММ. 309

Чаухан и его коллеги разработали деструктор WL-40 путем связывания ковалентного ингибитора Rpn13 RA190 с лигандом CRBN 309 (рис. 37). Ковалентное связывание RA190 с Rpn13 может блокировать распознавание полиубиквитинилированных белков для последующей деградации протеасомой. В клетках, обработанных WL40, уровни Rpn13 были максимально (95%) снижены через 16 часов. Важно отметить, что в отличие от бортезомиба, который может избирательно ингибировать активность 20S-протеасом и, следовательно, приводить к агрегации полиубиквитинированных белков с более низкой молекулярной массой, WL40 блокирует только протеасому 19S и предотвращает деубиквитинирование субстратов, что приводит к образованию полиубиквитинированных белков с более высокой молекулярной массой.Кроме того, WL-40 запускал мощную анти-MM активность в присутствии цитопротекторного микроокружения BM опухоли, преодолевал устойчивость к бортезомибу и был активен в контексте мутированного p53. WL40 индуцировал реакцию ER на стресс/UPR и передачу апоптотических сигналов p53/p21 быстрее, чем RA190. Кроме того, исследование in vivo показало, что WL40 значительно ингибирует рост опухоли при половинной эквимолярной дозе RA190.

Рис. 37

Представитель PROTAC Rpn13.

SGK3

Сывороточная/глюкокортикоид-индуцируемая протеинкиназа (SGK) представляет собой ключевую сигнальную молекулу нижестоящего уровня PI3K, которая играет важную роль в регуляции клеточной пролиферации, выживания, инвазии и метастазирования. 310 SGK-3, изоформа семейства SGK, играет важную роль в пролиферации и выживании клеток, особенно при раке молочной железы, раке печени, колоректальном раке и раке предстательной железы. 311,312 Недавние исследования показали, что SGK-3 сверхэкспрессируется в клетках рака молочной железы и что его ингибитор может значительно ингибировать пролиферацию клеток рака молочной железы. Однако известные в настоящее время ингибиторы СГК-3 имеют низкие значения IC 50 и селективность. 313 Таким образом, кажется, что оптимизация и определение характеристик PROTAC, специфичного для SGK3, особенно привлекательны.

Дарио Р. Алесси и его коллеги впервые разработали конъюгат PROTAC ингибитора 308-R SGK с лигандом, связывающим VH032 VHL, нацеленный на деградацию SGK3 314 (рис. 38). Соединение 65 индуцировало 50% деградацию эндогенного SGK3 при 0,3 мкМ в течение 2 часов, а максимальная 80% деградация наблюдалась в течение 8 часов в клетках HEK293. В отличие от ингибитора деструктор обладал хорошей селективностью, не разрушая близкородственные изоформы SGK1 и SGK2. Деструктор также может подавлять пролиферацию линий раковых клеток ZR-75-1 и CAMA-1 по сравнению с ингибитором PI3K (GDC0941).

Рис. 38

Представитель PROTAC СГК-3.

Smad3

Smad3 является важным транспортером в сигнальном пути трансформирующего фактора роста β (TGF-β), который отвечает за прямую передачу сигнала TGF-β из внеклеточного пространства в ядро ​​и регуляцию экспрессии целевые гены. 315,316 Известно, что уровень экспрессии и функциональное состояние Smad3 влияет на процесс передачи сигнала, включая клеточный рост, пролиферацию, развитие, дифференцировку, миграцию и апоптоз. 316,317,318 Было подтверждено, что сверхэкспрессия Smad3 связана с фиброзом печени и почек, особенно при различных заболеваниях почек, таких как обструктивная нефропатия, диабетическая нефропатия и гипертоническая нефропатия. Следовательно, стратегия создания новой химерной молекулы, нацеленной на протеолиз (PROTAC), которая может предотвратить фиброз почек путем нацеливания на убиквитинирование и деградацию основного внутрицитоплазматического Smad3, имеет большое значение.

Ван и его коллеги провели скрининг низкомолекулярных лигандов, которые связываются с Smad3, а затем использовали молекулу для синтеза целевого соединения 319 (рис.39). Они наблюдали небольшую деградацию после обработки 1 мкг 66 в лизатах клеток ACHN.

Рис. 39

Представитель PROTAC компании Smad3.

STAT3

STAT3 принадлежит семейству STAT, состоящему из семи членов, включая STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B и STAT6. Они имеют общий консервативный домен Src-homology 2 (Sh3), который отвечает за гомодимеризацию посредством фосфорилирования Tyr 705 и последующей трансактивации. Следовательно, ингибиторы, нацеленные на домен Sh3, чтобы разрушить PPI для гомодимеризации, были ограничены гомологичной селективностью.С другой стороны, только частичная транскрипционная активность STAT3 может быть подавлена, поскольку мономерный STAT3 все еще остается активным. Хотя эмбриональная летальность наблюдается у мышей с нулевым STAT3, первичные фибробласты мыши растут с близкой скоростью у мышей с нулевым STAT3 как фибробласты дикого типа, что указывает на то, что STAT3 необязателен в нормальных клетках. 320 Однако, как фактор транскрипции, STAT3 играет критическую роль в онкогенезе, регулируя гены, связанные с выживанием клеток, пролиферацией, инвазией и метастазированием.STAT3 был предложен в качестве особенно привлекательной мишени для потенциальной терапии рака.

Учитывая, что разработка эффективных и селективных ингибиторов STAT3 остается сложной задачей, совсем недавно группа Wang разработала сильнодействующие и специфические деструкторы PROTAC, нацеленные на STAT3, которые показали большой терапевтический потенциал in vivo для ОМЛ и анапластической крупноклеточной лимфомы (ALCL) 321 ( рис. 40). Сначала они выполнили оптимизацию на основе своего предыдущего ингибитора домена STAT3 Sh3 CJ-887 и получили лиганд, названный SI-109, с высоким сродством к STAT3 и хорошей клеточной проницаемостью.Сокристаллическая структура STAT3 с SI-109 была решена и использовалась для разработки PROTAC путем связывания SI-109 и аналога леналидомида. Деструктор SD-36 показал высокую активность в клетках ОМЛ и АККЛ. Он разложил >90% STAT3 в клетках ОМЛ в течение 4 часов и >50% STAT3 в клетках ALCL. Серия спасательных экспериментов подтвердила, что SD-36 является настоящим PROTAC, а не молекулярным клеем. Что еще более важно, SD-36 продемонстрировал превосходную селективность, поскольку другие члены семейства STAT не подвергались деградации или связыванию.Некоторые мутации STAT3, такие как D661Y, K658R и Y705F, также эффективно деградировали с помощью SD-36. SD-36 истощал как мономерный, так и димерный STAT3 в клетках ОМЛ в концентрации 1 мкМ после обработки в течение 5 часов; таким образом, транскрипционная активность STAT3 сильно и специфически ингибируется. Например, все нижестоящие гены, такие как BCL3, HCK, HGF, JAK3, PIM1, SOCS3 и VEGFA, были подавлены. SD-36 индуцировал апоптоз за счет активации каспазы-3/7 и расщепления PARP; при этом уровень STAT3 в митохондриях также снижался.SD-36 эффективно индуцировал деградацию ксенотрансплантатных опухолей STAT3 и достигал полной и длительной регрессии опухоли у мышей. После анализа других тканей мыши, таких как печень, селезенка, сердце и почки, было обнаружено, что SD-36 вызывает глубокое истощение STAT3 в этих тканях, но его безопасность оказалась хорошей.

Рис. 40

Представитель PROTAC STAT3.

TBK1

TANK-связывающая киназа 1 (TBK1) представляет собой серин/треонинкиназу и неканонический член семейства IKK с множеством клеточных функций во врожденном иммунитете, онкогенезе и развитии. 322 Что еще более интересно, некоторые эксперименты с РНК-интерференцией показали синтетическую летальность K-Ras с TBK1. 323 Однако последующие отчеты поставили под сомнение эту гипотезу. 324

Вместо РНКи группа Crews разработала PROTAC, нацеленные на TBK, которые можно было использовать в качестве инструментов для исследования взаимосвязи между мутантами TBK1 и K-Ras 322 (рис. 41). В качестве отправной точки они выбрали кристаллическую структуру TBK1, связанного с ингибитором. После структурной модификации с доступной взаимосвязью структура-активность (SAR) ингибитор использовали в качестве нацеливающей на белок части VHL PROTAC.Систематический обзор длины линкера показал, что PROTAC с линкерами менее 12 атомов не проявляют заметной активности деградации из-за стерических конфликтов в тройном комплексе. Репрезентативный PROTAC 67 с линкером из 15 атомов показал высокую эффективность клеточной деградации (DC 50  = 12 нМ) и максимальную деградацию ( D max  = 96%). Они дополнительно модифицировали фрагмент, нацеленный на белок, и лиганд VHL, чтобы изучить больше SAR. Была проверена способность PROTAC 67 расщеплять неканоническую киназу IkB IKKε, близкого гомолога TBK1.Хотя ингибитор проявлял низкую селективность в отношении TBK1 по сравнению с IKKε (значения IC 50 1,3 нМ против 8,7 нМ), PROTAC 67 не влиял на уровень IKKε. Они предположили, что селективность является результатом дифференциального представления их поверхностных лизинов VHL и его реакционноспособному компоненту тиоэфира убиквитина E2, что приводит к разной эффективности переноса убиквитина. Кроме того, различие в образовании и стабильности тройного комплекса может способствовать селективности.Наконец, оценивали эффект PROTAC 67 на пролиферацию клеток как в мутантных клеточных линиях K-Ras (h33, A549 и h2792), так и в клеточных линиях K-Ras дикого типа (h3110 и HCC827). Результаты показали, что в этих клетках не было существенной разницы, что указывало на то, что TBK1 не был синтетически летальным у мутанта K-Ras.

Рис. 41

Представитель PROTAC компании TBK1.

TRIM 24

Адресный карман белка часто не имеет функционального значения при заболевании.Это верно для мультидоменного регулятора транскрипции TRIM24, содержащего бромодомены. Было установлено, что TRIM24 является зависимым при многих видах рака, однако мощные и селективные лиганды бромодомена TRIM24 не вызывают эффективных антипролиферативных ответов. 325

В 2018 г. группа Bradner разработала PROTAC, dTRIM24, для деградации TRIM24 путем привлечения убиквитинлигазы VHL E3 326 (рис. 42). Разрушитель вызывал сильное и селективное расщепление TRIM24 с максимальной деградацией при 5 мкМ.Используя dTRIM24 для исследования функции TRIM24, они охарактеризовали динамические полногеномные последствия потери TRIM24 на локализацию хроматина и контроль генов. Кроме того, они определили TRIM24 как новую зависимость при остром лейкозе. Парное исследование деградации TRIM24 по сравнению с ингибированием бромодомена выявило усиление антипролиферативной реакции на деградацию. dTRIM24 предложил химическое исследование возникающей зависимости от рака и проложил путь вперед для многочисленных селективных, но неэффективных лигандов для белков, представляющих терапевтический интерес.

Рис. 42

Репрезентативный PROTAC для TRIM 24.

%PDF-1.6 % 1 0 объект > эндообъект 7 0 объект > эндообъект 2 0 объект > /Шрифт > >> /Поля [11 0 R] >> эндообъект 3 0 объект > поток 2016-06-29T11:17:07+01:002016-04-21T07:57:26+02:002016-06-29T11:17:07+01:00Adobe InDesign CS2 (4.0)application/pdfuuid:9624b8ca-ff83- 40e6-9375-893511adba98uuid:4f8dd690-abac-4db5-890f-a68b8bb01286Библиотека Adobe PDF 7.0 конечный поток эндообъект 4 0 объект > эндообъект 5 0 объект > эндообъект 6 0 объект > эндообъект 8 0 объект > эндообъект 9 0 объект > эндообъект 10 0 объект > эндообъект 11 0 объект > эндообъект 12 0 объект > эндообъект 13 0 объект > эндообъект 14 0 объект > эндообъект 15 0 объект > эндообъект 16 0 объект > эндообъект 17 0 объект > эндообъект 18 0 объект > эндообъект 19 0 объект > эндообъект 20 0 объект > /Ф 4 /FT /Btn /FF 65536 /Ч/П /П 28 0 Р /Родитель 11 0 Р /Прямо[42.5197 700,907 139,174 733,473] /Подтип /Виджет /T (Страница 1) /ТУ (http://www.nature.com/nsmb/) /Тип /Аннот >> эндообъект 21 0 объект > эндообъект 22 0 объект > эндообъект 23 0 объект > эндообъект 24 0 объект > эндообъект 25 0 объект > эндообъект 26 0 объект > эндообъект 27 0 объект > /XОбъект > >> /Annots [568 0 R 569 0 R 570 0 R 571 0 R 572 0 R 573 0 R] /Родитель 14 0 Р /MediaBox [0 0 595 842] >> эндообъект 28 0 объект > /Шрифт > /ProcSet [/PDF /текст] >> /Повернуть 0 /StructParents 0 /Большой палец 617 0 R /Обрезка [0.0 0,0 594,0 783,0] /Тип /Страница >> эндообъект 29 0 объект > /Шрифт > /ProcSet [/PDF /текст /ImageC] /Свойства > >> /XОбъект > >> /Повернуть 0 /StructParents 24 /Большой палец 653 0 R /TrimBox [0,0 0,0 594,0 783,0] /Тип /Страница >> эндообъект 30 0 объект > /ExtGState > /Шрифт > /ProcSet [/PDF /текст /ImageC /ImageI] /Свойства > >> /XОбъект > >> /Повернуть 0 /StructParents 37 /Большой палец 705 0 R /TrimBox [0,0 0,0 594,0 783,0] /Тип /Страница >> эндообъект 31 0 объект > /ExtGState > /Шрифт > /ProcSet [/PDF /текст /ImageC /ImageI] /Свойства > >> /XОбъект > >> /Повернуть 0 /StructParents 50 /Большой палец 741 0 R /Обрезка [0.0 0,0 594,0 783,0] /Тип /Страница >> эндообъект 32 0 объект > /ExtGState > /Шрифт > /ProcSet [/PDF /текст /ImageC /ImageI] /Свойства > >> /XОбъект > >> /Повернуть 0 /StructParents 61 /Большой палец 840 0 R /TrimBox [0,0 0,0 594,0 783,0] /Тип /Страница >> эндообъект 33 0 объект > /Шрифт > /ProcSet [/PDF /текст] >> /Повернуть 0 /StructParents 85 /Большой палец 881 0 R /TrimBox [0,0 0,0 594,0 783,0] /Тип /Страница >> эндообъект 34 0 объект > /ExtGState > /Шрифт > /ProcSet [/PDF /текст /ImageC /ImageI] /Свойства > >> /Затенение > /XОбъект > >> /Повернуть 0 /StructParents 112 /Большой палец 928 0 R /Обрезка [0.0 0,0 594,0 783,0] /Тип /Страница >> эндообъект 35 0 объект > /ExtGState > /Шрифт > /ProcSet [/PDF /текст /ImageC /ImageI] /Свойства > >> /Затенение > /XОбъект > >> /Повернуть 0 /StructParents 129 /Большой палец 968 0 R /TrimBox [0,0 0,0 594,0 783,0] /Тип /Страница >> эндообъект 36 0 объект > /ExtGState > /Шрифт > /ProcSet [/PDF /текст /ImageC /ImageI] /Свойства > >> /XОбъект > >> /Повернуть 0 /StructParents 134 /Большой палец 1017 0 R /TrimBox [0,0 0,0 594,0 783,0] /Тип /Страница >> эндообъект 37 0 объект > /Шрифт > /ProcSet [/PDF /текст /ImageC] /Свойства > >> /XОбъект > >> /Повернуть 0 /StructParents 152 /Большой палец 1062 0 R /Обрезка [0.0 0,0 594,0 783,0] /Тип /Страница >> эндообъект 38 0 объект > /Шрифт > /ProcSet [/PDF /текст] >> /Повернуть 0 /StructParents 180 /Большой палец 1078 0 R /TrimBox [0,0 0,0 594,0 783,0] /Тип /Страница >> эндообъект 39 0 объект > /Шрифт > /ProcSet [/PDF /текст] >> /Повернуть 0 /StructParents 183 /Большой палец 1104 0 R /TrimBox [0,0 0,0 594,0 783,0] /Тип /Страница >> эндообъект 40 0 объект > /Шрифт > /ProcSet [/PDF /текст] >> /Повернуть 0 /StructParents 198 /Большой палец 1134 0 R /TrimBox [0,0 0,0 594,0 783,0] /Тип /Страница >> эндообъект 41 0 объект > /Шрифт > /ProcSet [/PDF /текст] >> /Повернуть 0 /StructParents 221 /Большой палец 1152 0 R /Обрезка [0.0 0,0 594,0 783,0] /Тип /Страница >> эндообъект 42 0 объект > эндообъект 43 0 объект > эндообъект 44 0 объект > эндообъект 45 0 объект > эндообъект 46 0 объект > эндообъект 47 0 объект > эндообъект 48 0 объект > эндообъект 49 0 объект > эндообъект 50 0 объект > эндообъект 51 0 объект > эндообъект 52 0 объект > эндообъект 53 0 объект > эндообъект 54 0 объект > эндообъект 55 0 объект > эндообъект 56 0 объект > эндообъект 57 0 объект > эндообъект 58 0 объект > эндообъект 59 0 объект > эндообъект 60 0 объект > эндообъект 61 0 объект > эндообъект 62 0 объект > эндообъект 63 0 объект > эндообъект 64 0 объект > эндообъект 65 0 объект > эндообъект 66 0 объект > эндообъект 67 0 объект > эндообъект 68 0 объект > эндообъект 69 0 объект > эндообъект 70 0 объект > эндообъект 71 0 объект > эндообъект 72 0 объект > эндообъект 73 0 объект > эндообъект 74 0 объект > эндообъект 75 0 объект > эндообъект 76 0 объект > эндообъект 77 0 объект > эндообъект 78 0 объект > эндообъект 79 0 объект > эндообъект 80 0 объект > эндообъект 81 0 объект > эндообъект 82 0 объект > эндообъект 83 0 объект > эндообъект 84 0 объект > эндообъект 85 0 объект > эндообъект 86 0 объект > эндообъект 87 0 объект > эндообъект 88 0 объект > эндообъект 89 0 объект > эндообъект 90 0 объект > эндообъект 91 0 объект > эндообъект 92 0 объект > эндообъект 93 0 объект > эндообъект 94 0 объект > эндообъект 95 0 объект > эндообъект 96 0 объект > эндообъект 97 0 объект > эндообъект 98 0 объект > эндообъект 99 0 объект > эндообъект 100 0 объект > эндообъект 101 0 объект > эндообъект 102 0 объект > эндообъект 103 0 объект > эндообъект 104 0 объект > эндообъект 105 0 объект > эндообъект 106 0 объект > эндообъект 107 0 объект > эндообъект 108 0 объект > эндообъект 109 0 объект > эндообъект 110 0 объект > эндообъект 111 0 объект > эндообъект 112 0 объект > эндообъект 113 0 объект > эндообъект 114 0 объект > эндообъект 115 0 объект > эндообъект 116 0 объект > эндообъект 117 0 объект > эндообъект 118 0 объект > эндообъект 119 0 объект > эндообъект 120 0 объект > эндообъект 121 0 объект > эндообъект 122 0 объект > эндообъект 123 0 объект > эндообъект 124 0 объект > эндообъект 125 0 объект > эндообъект 126 0 объект > эндообъект 127 0 объект > эндообъект 128 0 объект > эндообъект 129 0 объект > эндообъект 130 0 объект > эндообъект 131 0 объект > эндообъект 132 0 объект > эндообъект 133 0 объект > эндообъект 134 0 объект > эндообъект 135 0 объект > эндообъект 136 0 объект > эндообъект 137 0 объект > эндообъект 138 0 объект > эндообъект 139 0 объект > эндообъект 140 0 объект > эндообъект 141 0 объект > эндообъект 142 0 объект > эндообъект 143 0 объект > эндообъект 144 0 объект > эндообъект 145 0 объект > эндообъект 146 0 объект > эндообъект 147 0 объект > эндообъект 148 0 объект > эндообъект 149 0 объект > эндообъект 150 0 объект > эндообъект 151 0 объект > эндообъект 152 0 объект > эндообъект 153 0 объект > эндообъект 154 0 объект > эндообъект 155 0 объект > эндообъект 156 0 объект > эндообъект 157 0 объект > эндообъект 158 0 объект > эндообъект 159 0 объект > эндообъект 160 0 объект > эндообъект 161 0 объект > эндообъект 162 0 объект > эндообъект 163 0 объект > эндообъект 164 0 объект > эндообъект 165 0 объект > эндообъект 166 0 объект > эндообъект 167 0 объект > эндообъект 168 0 объект > эндообъект 169 0 объект > эндообъект 170 0 объект > эндообъект 171 0 объект > эндообъект 172 0 объект > эндообъект 173 0 объект > эндообъект 174 0 объект > эндообъект 175 0 объект > эндообъект 176 0 объект > эндообъект 177 0 объект > эндообъект 178 0 объект > эндообъект 179 0 объект > эндообъект 180 0 объект > эндообъект 181 0 объект > эндообъект 182 0 объект > эндообъект 183 0 объект > эндообъект 184 0 объект > эндообъект 185 0 объект > эндообъект 186 0 объект > эндообъект 187 0 объект > эндообъект 188 0 объект > эндообъект 189 0 объект > эндообъект 190 0 объект > эндообъект 191 0 объект > эндообъект 192 0 объект > эндообъект 193 0 объект > эндообъект 194 0 объект > эндообъект 195 0 объект > эндообъект 196 0 объект > эндообъект 197 0 объект > эндообъект 198 0 объект > эндообъект 199 0 объект > эндообъект 200 0 объект > эндообъект 201 0 объект > эндообъект 202 0 объект > эндообъект 203 0 объект > эндообъект 204 0 объект > эндообъект 205 0 объект > эндообъект 206 0 объект > эндообъект 207 0 объект > эндообъект 208 0 объект > эндообъект 209 0 объект > эндообъект 210 0 объект > эндообъект 211 0 объект > эндообъект 212 0 объект > эндообъект 213 0 объект > эндообъект 214 0 объект > эндообъект 215 0 объект > эндообъект 216 0 объект > эндообъект 217 0 объект > эндообъект 218 0 объект > эндообъект 219 0 объект > эндообъект 220 0 объект > эндообъект 221 0 объект > эндообъект 222 0 объект > эндообъект 223 0 объект > эндообъект 224 0 объект > эндообъект 225 0 объект > эндообъект 226 0 объект > эндообъект 227 0 объект > эндообъект 228 0 объект > эндообъект 229 0 объект > эндообъект 230 0 объект > эндообъект 231 0 объект > эндообъект 232 0 объект > эндообъект 233 0 объект > эндообъект 234 0 объект > эндообъект 235 0 объект > эндообъект 236 0 объект > эндообъект 237 0 объект > эндообъект 238 0 объект > эндообъект 239 0 объект > эндообъект 240 0 объект > эндообъект 241 0 объект > эндообъект 242 0 объект > эндообъект 243 0 объект > эндообъект 244 0 объект > эндообъект 245 0 объект > эндообъект 246 0 объект > эндообъект 247 0 объект > эндообъект 248 0 объект > эндообъект 249 0 объект > эндообъект 250 0 объект > эндообъект 251 0 объект > эндообъект 252 0 объект > эндообъект 253 0 объект > эндообъект 254 0 объект > эндообъект 255 0 объект > эндообъект 256 0 объект > эндообъект 257 0 объект > эндообъект 258 0 объект > эндообъект 259 0 объект > эндообъект 260 0 объект > эндообъект 261 0 объект > эндообъект 262 0 объект > эндообъект 263 0 объект > эндообъект 264 0 объект > эндообъект 265 0 объект > эндообъект 266 0 объект > эндообъект 267 0 объект > эндообъект 268 0 объект > эндообъект 269 ​​0 объект > эндообъект 270 0 объект > эндообъект 271 0 объект > эндообъект 272 0 объект > эндообъект 273 0 объект > эндообъект 274 0 объект > эндообъект 275 0 объект > эндообъект 276 0 объект > эндообъект 277 0 объект > эндообъект 278 0 объект > эндообъект 279 0 объект > эндообъект 280 0 объект > эндообъект 281 0 объект > эндообъект 282 0 объект > эндообъект 283 0 объект > эндообъект 284 0 объект > эндообъект 285 0 объект > эндообъект 286 0 объект > эндообъект 287 0 объект > эндообъект 288 0 объект > эндообъект 289 0 объект > эндообъект 290 0 объект > эндообъект 291 0 объект > эндообъект 292 0 объект > эндообъект 293 0 объект > эндообъект 294 0 объект > эндообъект 295 0 объект > эндообъект 296 0 объект > эндообъект 297 0 объект > эндообъект 298 0 объект > эндообъект 299 0 объект > эндообъект 300 0 объект > эндообъект 301 0 объект > эндообъект 302 0 объект > эндообъект 303 0 объект > эндообъект 304 0 объект > эндообъект 305 0 объект > эндообъект 306 0 объект > эндообъект 307 0 объект > эндообъект 308 0 объект > эндообъект 309 0 объект > эндообъект 310 0 объект > эндообъект 311 0 объект > эндообъект 312 0 объект > эндообъект 313 0 объект > эндообъект 314 0 объект > эндообъект 315 0 объект > эндообъект 316 0 объект > эндообъект 317 0 объект > эндообъект 318 0 объект > эндообъект 319 0 объект > эндообъект 320 0 объект > эндообъект 321 0 объект > эндообъект 322 0 объект > эндообъект 323 0 объект > эндообъект 324 0 объект > эндообъект 325 0 объект > эндообъект 326 0 объект > эндообъект 327 0 объект > эндообъект 328 0 объект > эндообъект 329 0 объект > эндообъект 330 0 объект > эндообъект 331 0 объект > эндообъект 332 0 объект > эндообъект 333 0 объект > эндообъект 334 0 объект > эндообъект 335 0 объект > эндообъект 336 0 объект > эндообъект 337 0 объект > эндообъект 338 0 объект > эндообъект 339 0 объект > эндообъект 340 0 объект > эндообъект 341 0 объект > эндообъект 342 0 объект > эндообъект 343 0 объект > эндообъект 344 0 объект > эндообъект 345 0 объект > эндообъект 346 0 объект > эндообъект 347 0 объект > эндообъект 348 0 объект > эндообъект 349 0 объект > эндообъект 350 0 объект > эндообъект 351 0 объект > эндообъект 352 0 объект > эндообъект 353 0 объект > эндообъект 354 0 объект > эндообъект 355 0 объект > эндообъект 356 0 объект > эндообъект 357 0 объект > эндообъект 358 0 объект > эндообъект 359 0 объект > эндообъект 360 0 объект > эндообъект 361 0 объект > эндообъект 362 0 объект > эндообъект 363 0 объект > эндообъект 364 0 объект > эндообъект 365 0 объект > эндообъект 366 0 объект > эндообъект 367 0 объект > эндообъект 368 0 объект > эндообъект 369 0 объект > эндообъект 370 0 объект > эндообъект 371 0 объект > эндообъект 372 0 объект > эндообъект 373 0 объект > эндообъект 374 0 объект > эндообъект 375 0 объект > эндообъект 376 0 объект > эндообъект 377 0 объект > эндообъект 378 0 объект > эндообъект 379 0 объект > эндообъект 380 0 объект > эндообъект 381 0 объект > эндообъект 382 0 объект > эндообъект 383 0 объект > эндообъект 384 0 объект > эндообъект 385 0 объект > эндообъект 386 0 объект > эндообъект 387 0 объект > эндообъект 388 0 объект > эндообъект 389 0 объект > эндообъект 390 0 объект > эндообъект 391 0 объект > эндообъект 392 0 объект > эндообъект 393 0 объект > эндообъект 394 0 объект > эндообъект 395 0 объект > эндообъект 396 0 объект > эндообъект 397 0 объект > эндообъект 398 0 объект > эндообъект 399 0 объект > эндообъект 400 0 объект > эндообъект 401 0 объект > эндообъект 402 0 объект > эндообъект 403 0 объект > эндообъект 404 0 объект > эндообъект 405 0 объект > эндообъект 406 0 объект > эндообъект 407 0 объект > эндообъект 408 0 объект > эндообъект 409 0 объект > эндообъект 410 0 объект > эндообъект 411 0 объект > эндообъект 412 0 объект > эндообъект 413 0 объект > эндообъект 414 0 объект > эндообъект 415 0 объект > эндообъект 416 0 объект > эндообъект 417 0 объект > эндообъект 418 0 объект > эндообъект 419 0 объект > эндообъект 420 0 объект > эндообъект 421 0 объект > эндообъект 422 0 объект > эндообъект 423 0 объект > эндообъект 424 0 объект > эндообъект 425 0 объект > эндообъект 426 0 объект > эндообъект 427 0 объект > эндообъект 428 0 объект > эндообъект 429 0 объект > эндообъект 430 0 объект > эндообъект 431 0 объект > эндообъект 432 0 объект > эндообъект 433 0 объект > эндообъект 434 0 объект > эндообъект 435 0 объект > эндообъект 436 0 объект > эндообъект 437 0 объект > эндообъект 438 0 объект > эндообъект 439 0 объект > эндообъект 440 0 объект > эндообъект 441 0 объект > эндообъект 442 0 объект > эндообъект 443 0 объект > эндообъект 444 0 объект > эндообъект 445 0 объект > эндообъект 446 0 объект > эндообъект 447 0 объект > эндообъект 448 0 объект > эндообъект 449 0 объект > эндообъект 450 0 объект > эндообъект 451 0 объект > эндообъект 452 0 объект > эндообъект 453 0 объект > эндообъект 454 0 объект > эндообъект 455 0 объект > эндообъект 456 0 объект > эндообъект 457 0 объект > эндообъект 458 0 объект > эндообъект 459 0 объект > эндообъект 460 0 объект > эндообъект 461 0 объект > эндообъект 462 0 объект > эндообъект 463 0 объект > эндообъект 464 0 объект > эндообъект 465 0 объект > эндообъект 466 0 объект > эндообъект 467 0 объект > эндообъект 468 0 объект > эндообъект 469 0 объект > эндообъект 470 0 объект > эндообъект 471 0 объект > эндообъект 472 0 объект > эндообъект 473 0 объект > эндообъект 474 0 объект > эндообъект 475 0 объект > эндообъект 476 0 объект > эндообъект 477 0 объект > эндообъект 478 0 объект > эндообъект 479 0 объект > эндообъект 480 0 объект > эндообъект 481 0 объект > эндообъект 482 0 объект > эндообъект 483 0 объект > эндообъект 484 0 объект > эндообъект 485 0 объект > эндообъект 486 0 объект > эндообъект 487 0 объект > эндообъект 488 0 объект > эндообъект 489 0 объект > эндообъект 490 0 объект > эндообъект 491 0 объект > эндообъект 492 0 объект > эндообъект 493 0 объект > эндообъект 494 0 объект > эндообъект 495 0 объект > эндообъект 496 0 объект > эндообъект 497 0 объект > эндообъект 498 0 объект > эндообъект 499 0 объект > эндообъект 500 0 объект > эндообъект 501 0 объект > эндообъект 502 0 объект > эндообъект 503 0 объект > эндообъект 504 0 объект > эндообъект 505 0 объект > эндообъект 506 0 объект > эндообъект 507 0 объект > эндообъект 508 0 объект > эндообъект 509 0 объект > эндообъект 510 0 объект > эндообъект 511 0 объект > эндообъект 512 0 объект > эндообъект 513 0 объект > эндообъект 514 0 объект > эндообъект 515 0 объект > эндообъект 516 0 объект > эндообъект 517 0 объект > эндообъект 518 0 объект > эндообъект 519 0 объект > эндообъект 520 0 объект > эндообъект 521 0 объект > эндообъект 522 0 объект > эндообъект 523 0 объект > эндообъект 524 0 объект > эндообъект 525 0 объект > эндообъект 526 0 объект > эндообъект 527 0 объект > эндообъект 528 0 объект > эндообъект 529 0 объект > эндообъект 530 0 объект > эндообъект 531 0 объект > эндообъект 532 0 объект > эндообъект 533 0 объект > эндообъект 534 0 объект > эндообъект 535 0 объект > эндообъект 536 0 объект > эндообъект 537 0 объект > эндообъект 538 0 объект > эндообъект 539 0 объект > эндообъект 540 0 объект > эндообъект 541 0 объект > эндообъект 542 0 объект > эндообъект 543 0 объект > эндообъект 544 0 объект > эндообъект 545 0 объект > эндообъект 546 0 объект > эндообъект 547 0 объект > эндообъект 548 0 объект > эндообъект 549 0 объект > эндообъект 550 0 объект > эндообъект 551 0 объект > эндообъект 552 0 объект > /Свойства > >> >> /Подтип /Форма >> поток H͎I)ΈF#aF,^6cx{9UAlgwv QYs»?=}~i{xÿ v}˾smfZkspokex]~_}|wOëiᗯo%>jJ?Sf0��? |{WB!$Njd]k\6g/u/6~ʰVͶ

12 мая 2015 г. Рабочая группа CPE по стратегической повестке дня

%PDF-1.7 % 1 0 объект >поток application/pdf

  • Повестка дня: 12 мая 2015 г. Рабочая группа по стратегической повестке CPE
  • Совет Кентукки по послесреднему образованию
  • Инструментарий http://www.activepdf.com; изменено с использованием iTextSharp 4.1.6 от 1T3XT2020-01-17T12:36:36-05:002015-05-11T16:37:39-06:00Toolkit http://www.activepdf.com конечный поток эндообъект 2 0 объект > эндообъект 6 0 объект > эндообъект 7 0 объект (на английском языке) эндообъект 3 0 объект > эндообъект 4 0 объект > эндообъект 5 0 объект > эндообъект 8 0 объект [9 0 R 10 0 R 11 0 R 12 0 R 13 0 R 14 0 R 15 0 R 21 0 R 17 0 R 18 0 R 22 0 R 23 0 R 24 0 R 25 0 R 26 0 R 27 0 R 28 0 R 29 0 R 30 0 R 31 0 R 32 0 R 33 0 R 34 0 R 35 0 R 36 0 R 37 0 R 38 0 R 39 0 R 40 0 ​​R 41 0 R 42 0 R 20 0 R] эндообъект 9 0 объект > эндообъект 10 0 объект > эндообъект 11 0 объект > эндообъект 12 0 объект > эндообъект 13 0 объект > эндообъект 14 0 объект > эндообъект 15 0 объект > эндообъект 21 0 объект > эндообъект 17 0 объект > эндообъект 18 0 объект > эндообъект 22 0 объект > эндообъект 23 0 объект > эндообъект 24 0 объект > эндообъект 25 0 объект > эндообъект 26 0 объект > эндообъект 27 0 объект > эндообъект 28 0 объект > эндообъект 29 0 объект > эндообъект 30 0 объект > эндообъект 31 0 объект > эндообъект 32 0 объект > эндообъект 33 0 объект > эндообъект 34 0 объект > эндообъект 35 0 объект > эндообъект 36 0 объект > эндообъект 37 0 объект > эндообъект 38 0 объект > эндообъект 39 0 объект > эндообъект 40 0 объект > эндообъект 41 0 объект > эндообъект 42 0 объект > эндообъект 20 0 объект > эндообъект 16 0 объект > эндообъект 19 0 объект > эндообъект 65 0 объект > эндообъект 43 0 объект > эндообъект 66 0 объект > эндообъект 67 0 объект > эндообъект 68 0 объект > эндообъект 69 0 объект > эндообъект 70 0 объект > эндообъект 71 0 объект > эндообъект 72 0 объект > эндообъект 44 0 объект > эндообъект 45 0 объект > эндообъект 73 0 объект > эндообъект 74 0 объект > эндообъект 75 0 объект > эндообъект 76 0 объект > эндообъект 77 0 объект > эндообъект 78 0 объект > эндообъект 46 0 объект > эндообъект 47 0 объект > эндообъект 48 0 объект > эндообъект 79 0 объект > эндообъект 80 0 объект > эндообъект 81 0 объект > эндообъект 82 0 объект > эндообъект 83 0 объект > эндообъект 84 0 объект > эндообъект 49 0 объект > эндообъект 50 0 объект > эндообъект 85 0 объект > эндообъект 51 0 объект > эндообъект 86 0 объект > эндообъект 87 0 объект > эндообъект 88 0 объект > эндообъект 89 0 объект > эндообъект 90 0 объект > эндообъект 52 0 объект > эндообъект 53 0 объект > эндообъект 91 0 объект > эндообъект 54 0 объект > эндообъект 92 0 объект > эндообъект 93 0 объект > эндообъект 94 0 объект > эндообъект 95 0 объект > эндообъект 96 0 объект > эндообъект 55 0 объект > эндообъект 56 0 объект > эндообъект 97 0 объект > эндообъект 57 0 объект > эндообъект 98 0 объект > эндообъект 99 0 объект > эндообъект 100 0 объект > эндообъект 101 0 объект > эндообъект 102 0 объект > эндообъект 58 0 объект > эндообъект 59 0 объект > эндообъект 60 0 объект > эндообъект 103 0 объект > эндообъект 104 0 объект > эндообъект 105 0 объект > эндообъект 106 0 объект > эндообъект 107 0 объект > эндообъект 108 0 объект > эндообъект 61 0 объект > эндообъект 62 0 объект > эндообъект 63 0 объект > эндообъект 109 0 объект > эндообъект 110 0 объект > эндообъект 111 0 объект > эндообъект 112 0 объект > эндообъект 113 0 объект > эндообъект 114 0 объект > эндообъект 64 0 объект > эндообъект 115 0 объект >/ProcSet[/PDF/Text/ImageB/ImageC/ImageI]>>/Parent 119 0 R/Group>/Type/Page/Tabs/S>> эндообъект 119 0 объект > эндообъект 118 0 объект > эндообъект 117 0 объект > эндообъект 116 0 объект >поток xZr6}O1SAĕdǹ4uSwAG-.xgb]]]

    Обзоры исследований биомаркеров при психических и нейродегенеративных расстройствах

    ‘) var head = document.getElementsByTagName(«head»)[0] var script = document.createElement(«сценарий») script.type = «текст/javascript» script.src = «https://buy.springer.com/assets/js/buybox-bundle-52d08dec1e.js» сценарий.id = «ecommerce-scripts-» ​​+ метка времени head.appendChild (скрипт) var buybox = document.querySelector(«[data-id=id_»+ метка времени +»]»).parentNode ;[].slice.call(buybox.querySelectorAll(«.вариант-покупки»)).forEach(initCollapsibles) функция initCollapsibles(подписка, индекс) { var toggle = подписка.querySelector(«.цена-варианта-покупки») подписка.classList.remove(«расширенный») переменная форма = подписка.querySelector(«.форма-варианта-покупки») если (форма) { вар formAction = form.getAttribute(«действие») document.querySelector(«#ecommerce-scripts-» ​​+ timestamp).addEventListener(«load», bindModal(form, formAction, timestamp, index), false) } var priceInfo = подписка.querySelector(«.Информация о цене») var PurchaseOption = переключатель.родительский элемент если (переключить && форма && priceInfo) { toggle.setAttribute(«роль», «кнопка») toggle.setAttribute(«tabindex», «0») toggle.addEventListener («щелчок», функция (событие) { var expand = toggle.getAttribute(«aria-expanded») === «true» || ложный toggle.setAttribute(«aria-expanded», !expanded) форма.скрытый = расширенный если (! расширено) { покупкаOption.classList.add(«расширенный») } еще { покупкаOption.classList.remove(«расширенный») } priceInfo.hidden = расширенный }, ложный) } } функция bindModal (форма, formAction, метка времени, индекс) { var weHasBrowserSupport = окно.выборка && Array.from функция возврата () { var Buybox = EcommScripts ? EcommScripts.Buybox : ноль var Modal = EcommScripts ? EcommScripts.Modal : ноль if (weHasBrowserSupport && Buybox && Modal) { var modalID = «ecomm-modal_» + метка времени + «_» + индекс var modal = новый модальный (modalID) модальный.domEl.addEventListener(«закрыть», закрыть) функция закрыть () { form.querySelector(«кнопка[тип=отправить]»).фокус() } вар корзинаURL = «/корзина» var cartModalURL = «/cart?messageOnly=1» форма.setAttribute( «действие», formAction.replace(cartURL, cartModalURL) ) var formSubmit = Buybox.перехват формы отправки ( Buybox.fetchFormAction(окно.fetch), Buybox.triggerModalAfterAddToCartSuccess(модальный), функция () { form.removeEventListener («отправить», formSubmit, false) форма.setAttribute( «действие», formAction.replace(cartModalURL, cartURL) ) форма.представить() } ) form.addEventListener («отправить», formSubmit, ложь) document.body.appendChild(modal.domEl) } } } функция initKeyControls() { document.addEventListener («нажатие клавиши», функция (событие) { если (документ.activeElement.classList.contains(«цена-варианта-покупки») && (event.code === «Пробел» || event.code === «Enter»)) { если (document.activeElement) { событие.preventDefault() документ.activeElement.click() } } }, ложный) } функция InitialStateOpen() { var узкаяBuyboxArea = покупная коробка.смещениеШирина -1 ;[].slice.call(buybox.querySelectorAll(«.опция покупки»)).forEach(функция (опция, индекс) { var toggle = option.querySelector(«.цена-варианта-покупки») var form = option.querySelector(«.форма-варианта-покупки») var priceInfo = option.querySelector(«.Информация о цене») если (allOptionsInitiallyCollapsed || узкаяBuyboxArea && индекс > 0) { переключать.setAttribute («ария-расширенная», «ложь») form.hidden = «скрытый» priceInfo.hidden = «скрытый» } еще { переключить.щелчок() } }) } начальное состояниеОткрыть() если (window.buyboxInitialized) вернуть window.buyboxInitialized = истина initKeyControls() })()

    Поиск идентификационного кода производителя лодки — MIC

    Используйте этот бесплатный инструмент для поиска идентификационного кода производителя (MIC), чтобы найти название производителя прогулочной лодки, каноэ, каяка или гидроцикла.Первые 3 символа идентификационного номера корпуса лодки (HIN) представляют собой код производителя. Коды MIC выдаются Береговой охраной США. Существует более 16 000 кодов MIC (поэтому , пожалуйста, дайте этой странице время, чтобы загрузить ).

    История HIN

    В 1972 году Береговая охрана США начала требовать от производителей и импортеров лодок наносить идентификационные номера на корпус всех прогулочных лодок. Структура HIN менялась с течением времени, но всегда требовалось, чтобы первые три символа состояли из кода MIC.Вплоть до середины 1990-х некоторые коды MIC также могли содержать числа; однако все MIC теперь состоят только из букв алфавита.

    HIN служат нескольким целям. Государства используют HIN для присвоения прав и регистрации. Береговая охрана США использует его для отслеживания отзывов лодок и отчетов об инспекциях. Правоохранительные органы используют его для выявления утерянного или украденного имущества.

    Длина HIN прогулочного судна обычно составляет 12 символов. Первые 3 символа обозначают производителя лодки. Следующие 5 символов — либо заводской номер лодки, либо серийный номер.Следующие два символа указывают, когда была построена лодка (буква означает месяц постройки, а одна цифра — год постройки), а последние две цифры обозначают год, когда купленная модель поступила в продажу.

    Где можно найти HIN?

    На лодках HIN можно найти на транце, а также на скрытом участке внутри лодки. У гидроциклов HIN обычно располагается на верхней части задней платформы. На каноэ и каяках HIN обычно находится с правой стороны кормы (передняя правая сторона корпуса).

    HIN может представлять собой металлическую пластину, выдавленную или отлитую на корпусе лодки, либо выгравированную или вырезанную.

    Чем полезен код производителя лодки?

    Определение производителя лодки может быть очень полезным, особенно если вы покупаете или ремонтируете подержанную лодку. Знание имени производителя может быть полезно при проведении исследований, например, чтобы узнать, не заметили ли другие владельцы проблемы, общие для производителя. Вы можете отследить руководства пользователя, которые обычно также содержат схему деталей, и получить правильный номер детали.

    Как искать в этом списке

    !!!!! =>  Поле поиска появится после загрузки всего списка.

    Используйте поле поиска ниже, чтобы ввести трехзначный код MIC, название производителя, город или штат.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.