План порівняльної характеристики образів тома і гека: Складіть план порівняльної характеристики образів Тома й Гека

Содержание

Презентація до уроку з розвитку мовлення (письмово). Порівняльна характеристика Тома та Гека за поданим планом.

Про матеріал

Завдання створити письмову порівняльну характеристику за поданим планом здається, на перший погляд, дуже простим, але певні труднощі всеж є. Надана презентація містить окремі характеристики Тома і Гека, план порівняння та висновок. Якщо дехто з дітей позбавлеий творчої уяви, то на основі наданого він зможе написати характеристику компілятивного характеру.

Перегляд файлу

Зміст слайдів

Номер слайду 1

Том Сойєр і Гекльберрі Фінн Порівняльна характеристика Тома і Гека за поданим планом РМ. (письмово)

Номер слайду 2

Яку дружбу заведеш, таке й життя поведеш. Прислів’я

Номер слайду 3

Характеристика Тома Характеристика Гека Гекльберрі Фінн – одноліток Тома Сойєра, волоцюга, що не має власного житла. Його мати померла, а батько — п’яниця, який не дбає про сина й згадує про нього лише тоді, коли йому від Гека щось потрібно. Хлопець не ходить до школи, харчується недоїдками, одягнений у лахміття, яке викидають дорослі. Його кращий друг – Том Сойєр, втім усі хлопці містечка хотіли б дружити з Геком незважаючи на заборону своїх батьків. Гекльберрі здатний подбати про себе. Рано подорослішати його змусило важке життя, але хлопець із задоволенням бере участь у всьому, що задумує Том Сойєр.

Номер слайду 4

Порівняйте цих персонажів за планом 1. Матеріальний достаток. 2. Ставлення до освіти, до виховання. 3. Риси характеру Тома і Гека. 4. Сімейний стан героїв. 5. Ставлення до них інших персонажів. 6. Їхнє ставлення один до одного. 7. Роль дружби в їхньому житті.

Номер слайду 5

Висновок Два головні герої повісті Марка Твена — цілком різні: за вихованням, родинними звичаями й цінностями, способом життя. Ставши друзями, вони спільно вигадують щоразу нові пригоди, створюють проблеми для самих себе і дорослих. Водночас інколи вони опиняються у важливих місцях, вчасно і доречно у такий спосіб допомагаючи людям.

Хлопці-кмітливі та вигадливі, але й небайдужі, відважні, уміють ризикувати й знаходити правильні рішення в складних життєвих ситуаціях.

Номер слайду 6

Скульптор Ф. Хаббард. 1926 рік. Найвідоміші твори М. Твена розповідають про світлу пору його дитинства в Ганнібалі. Сьогодні там на високому скелястому березі Міссісіпі стоїть один із небагатьох пам’ятників літературним героям, яких створила творча фантазія письменника, двом підліткам — Тому Сойєру та Гекльберрі Фінну.

Номер слайду 7

Створити власну презентацію про втілення сюжетів творів Марка Твена у кіно, живописі, графіці та інших видах мистецтва. Бути готовими відповісти на тестові запитання за змістом вивченого під час уроків. Домашнє завдання

✅ План сравнительной характеристики тома и гека. Сравнительная характеристика тома сойера и гекльберри финна

Образ Гека Финна и образ Тома Сойера (сравнительная характеристика)

В 1876 г. было опубликовано одно из наиболее известных и популярных произведений Твена – “Приключения Тома Сойера “Приключения Тома Сойера” представляют собой сочетание реализма с романтизмом. Реалистически описывая маленький городок, его сонную, обывательскую жизнь, Марк Твен противопоставляет ему романтический мир Тома и его друзей, их необычайные приключения. В красочных тонах изображается река Миссисипи и окружающая природа, создающая романтический фон в книге. В повести много действия. Динамично развивается сюжет, занимательности

Герои романа Марка Твена “Приключения Тома Сойера” Двенадцатилетние мальчишки, жители маленького провинциального американского городка Санкт-Петербург, товарищи по играм и забавам, которые то и дело рождает их неуемная фантазия. Том Сойер – сирота. Его воспитывает сестра покойной матери.

Классики американской литературы – Марк Твен Нужно сказать несколько слов о самом главном событии американской истории 19 века. В 1861-65 годах происходила Гражданская война между Севером и Югом, северные штаты под руководством президента Авраама Линкольна хотели.

Когда человечность одолевает страх Поздравляю! Я – Том Сойер. Мое имя вам кажется чудным? Возможно, так оно и есть. Я англичанин. Живу с теткой Полли и братом Сидом. Хожу в школу. В выходные тетка.

Характеристика образа Тома Сойера Том Сойер – подросток из маленького провинциального городка Санкт-Петербург на Миссисипи, большой непоседа, непослушный мальчишка, питающий зависть к настоящей свободе своего знакомца беспризорного Гекльберри Финна. Стесненный бесконечными благочестивыми наставлениями, которые.

Сочинение по повести “Принц и нищий” В 1882 году он писал повесть “Принц и нищий”, где действие – впервые у Твена – разворачивается в очень давние времена: перед нами Англия середины XVI века. Сюда, в Элмайру.

Мое отношение к главному герою романа Марка Твена “Приключения Тома Сойера” Произведения американского писателя Марка Твена пронизанные светом и добрым юмором. Известными героями Марка Твена стали Том Сойер и Гекльберри Финн. В образе главного героя – Тома Сойера – Марк Твен.

Том Сойер и Гекльберри Финн – характеристика литературного героя ТОМ СОЙЕР И ГЕКЛЬБЕРРИ ФИНН (англ. Tom Sawyer, Hucklberry Finn) – герои романов Марка Твена “Приключения Тома Сойера” (1876) и “Приключения Гекльберри Финна” (1884). Двенадцатилетние мальчишки, жители маленького провинциального американского.

Образ автора в повести “Приключення Тома Сойера” В образе Тома Сойера Марк Твен изобразил самого себя “Я рассказывал в “Томе Сойере” о собственных проделках,- сообщил писатель своему другу и будущему биографу Пейну.- Я был озорным мальчуганом и.

Моя любимая книга “Приключения Тома Сойера” Марк Твен провел детство в городке Ганнибал на Миссисипи. После смерти отца вынужден был оставить школу. Работая учеником наборщика в местных газетах, опубликовал свои первые опыты. С 1853 по 1857.

Повести Марка Твена Великий американец Марк Твен – автор многочисленных рассказов, повестей, романов, памфлетов, публицистических статей, путевых очерков, ценнейших автобиографических записок и литературных писем – завоевал мировую славу книгами о Томе Сойе-ре и.

История, смысл и уроки повести “Принц и нищий” История, ее смысл, ее уроки интересовали Твена особенно сильно.

И неудивительно, что все эти размышления заполняют страницы “Принца и нищего”. Никогда прежде Твен не обращался к исторический прозе. Но “Принца.

Детские годы Марка Твена Когда Оливии Лэнгдов было шестнадцать лет, она упала, поскользнувшись на подтаявшем льду, и получила тяжелую травму. Врачи распорядились, чтобы ей была отведена особая комната с тяжелыми шторами, которые не поднимали.

Почему мне нравится образ Тома Сойера Секрет здесь в том, что и сказка насыщена такими подробностями, которым мы верим сразу же, потому что они жизненны. О тех реальных людях, которые в качество персонажей выведены на страницах.

Юмористический колорит рассказов Марка Твена На этой мнимой авторской серьезности основывается весь юмористический колорит рассказов молодого Марка Таена. Первым его читателям казалось, что такие рассказы – вообще не литература. Тогда еще верили, что литература непременно.

Дружба Тома и Гека Много всяких приключений было в жизни героев Марка Твена – Тома Сойера и Гекльберри Финна. И в каждом эпизоде проявлялась дружба ребят. Мне хочется рассказать о таком эпизоде. В один.

Образ главного героя в романе М. Твена “Приключения Тома Сойера” 1. Марк Твен как создатель неповторимого образа. 2. Достоинства и недостатки героя. 3. Том Сойер – один из самых любимых героев в мировой литературе. Пожалуй, нет в мире мало-мальски грамотного.

Искусство молодого Твена – это искусство гротеска На языке литературоведов подобное изображение называется гротеском. Но и гротеск бывает самый разный по-своим формам да и по сущности. Мы читаем, как у коллежского асессора Ковалева исчез нос. Бедный Ковалев.

Мотивы написания романа “Янки дворе короля Артура” Как-то Твен спросил своего спутника, где он отыскивает такие витиеватые выражения и обороты. Кейбл отправился к себе в номер и принес большую старую книгу. Она была переложена закладками и основательно.

С другом ничего не страшно. Сочинение по повести “Приключения Тома Сойера” Много всяческих приключений было в жизни героев Марка Твена – Тома Сойера и Гекльберри Финна. И в каждом эпизоде оказывается важна дружба ребят. Мне хочется вспомнить такой эпизод. Однажды Том.

Сочинение по повести “Приключения Тома Сойера” Легко вообразить чувство двух мальчиков, которые оказались ночью на кладбище. Их всегда привлекало все тайное, неведомое, связанное с опасностью. Том и Гек любили быть открывателями таинственного. Ночное кладбище именно и.

Сейчас вы читаете: Образ Гека Финна и образ Тома Сойера (сравнительная характеристика)

Образ Гека Финна и образ Тома Сойера (сравнительная характеристика)

В 1876 г. было опубликовано одно из наиболее известных и популярных произведений Твена – “Приключения Тома Сойера “Приключения Тома Сойера” представляют собой сочетание реализма с романтизмом. Реалистически описывая маленький городок, его сонную, обывательскую жизнь, Марк Твен противопоставляет ему романтический мир Тома и его друзей, их необычайные приключения. В красочных тонах изображается река Миссисипи и окружающая природа, создающая романтический фон в книге. В повести много действия. Динамично развивается сюжет, занимательности

Герои романа Марка Твена “Приключения Тома Сойера” Двенадцатилетние мальчишки, жители маленького провинциального американского городка Санкт-Петербург, товарищи по играм и забавам, которые то и дело рождает их неуемная фантазия. Том Сойер – сирота. Его воспитывает сестра покойной матери.

Классики американской литературы – Марк Твен Нужно сказать несколько слов о самом главном событии американской истории 19 века. В 1861-65 годах происходила Гражданская война между Севером и Югом, северные штаты под руководством президента Авраама Линкольна хотели.

Когда человечность одолевает страх Поздравляю! Я – Том Сойер. Мое имя вам кажется чудным? Возможно, так оно и есть. Я англичанин. Живу с теткой Полли и братом Сидом. Хожу в школу. В выходные тетка.

Характеристика образа Тома Сойера Том Сойер – подросток из маленького провинциального городка Санкт-Петербург на Миссисипи, большой непоседа, непослушный мальчишка, питающий зависть к настоящей свободе своего знакомца беспризорного Гекльберри Финна.

Стесненный бесконечными благочестивыми наставлениями, которые.

Сочинение по повести “Принц и нищий” В 1882 году он писал повесть “Принц и нищий”, где действие – впервые у Твена – разворачивается в очень давние времена: перед нами Англия середины XVI века. Сюда, в Элмайру.

Мое отношение к главному герою романа Марка Твена “Приключения Тома Сойера” Произведения американского писателя Марка Твена пронизанные светом и добрым юмором. Известными героями Марка Твена стали Том Сойер и Гекльберри Финн. В образе главного героя – Тома Сойера – Марк Твен.

Том Сойер и Гекльберри Финн – характеристика литературного героя ТОМ СОЙЕР И ГЕКЛЬБЕРРИ ФИНН (англ. Tom Sawyer, Hucklberry Finn) – герои романов Марка Твена “Приключения Тома Сойера” (1876) и “Приключения Гекльберри Финна” (1884). Двенадцатилетние мальчишки, жители маленького провинциального американского.

Образ автора в повести “Приключення Тома Сойера” В образе Тома Сойера Марк Твен изобразил самого себя “Я рассказывал в “Томе Сойере” о собственных проделках,- сообщил писатель своему другу и будущему биографу Пейну. — Я был озорным мальчуганом и.

Моя любимая книга “Приключения Тома Сойера” Марк Твен провел детство в городке Ганнибал на Миссисипи. После смерти отца вынужден был оставить школу. Работая учеником наборщика в местных газетах, опубликовал свои первые опыты. С 1853 по 1857.

Повести Марка Твена Великий американец Марк Твен – автор многочисленных рассказов, повестей, романов, памфлетов, публицистических статей, путевых очерков, ценнейших автобиографических записок и литературных писем – завоевал мировую славу книгами о Томе Сойе-ре и.

История, смысл и уроки повести “Принц и нищий” История, ее смысл, ее уроки интересовали Твена особенно сильно. И неудивительно, что все эти размышления заполняют страницы “Принца и нищего”. Никогда прежде Твен не обращался к исторический прозе. Но “Принца.

Детские годы Марка Твена Когда Оливии Лэнгдов было шестнадцать лет, она упала, поскользнувшись на подтаявшем льду, и получила тяжелую травму. Врачи распорядились, чтобы ей была отведена особая комната с тяжелыми шторами, которые не поднимали.

Почему мне нравится образ Тома Сойера Секрет здесь в том, что и сказка насыщена такими подробностями, которым мы верим сразу же, потому что они жизненны. О тех реальных людях, которые в качество персонажей выведены на страницах.

Юмористический колорит рассказов Марка Твена На этой мнимой авторской серьезности основывается весь юмористический колорит рассказов молодого Марка Таена. Первым его читателям казалось, что такие рассказы – вообще не литература. Тогда еще верили, что литература непременно.

Дружба Тома и Гека Много всяких приключений было в жизни героев Марка Твена – Тома Сойера и Гекльберри Финна. И в каждом эпизоде проявлялась дружба ребят. Мне хочется рассказать о таком эпизоде. В один.

Образ главного героя в романе М. Твена “Приключения Тома Сойера” 1. Марк Твен как создатель неповторимого образа. 2. Достоинства и недостатки героя. 3. Том Сойер – один из самых любимых героев в мировой литературе. Пожалуй, нет в мире мало-мальски грамотного.

Искусство молодого Твена – это искусство гротеска На языке литературоведов подобное изображение называется гротеском. Но и гротеск бывает самый разный по-своим формам да и по сущности. Мы читаем, как у коллежского асессора Ковалева исчез нос. Бедный Ковалев.

Мотивы написания романа “Янки дворе короля Артура” Как-то Твен спросил своего спутника, где он отыскивает такие витиеватые выражения и обороты. Кейбл отправился к себе в номер и принес большую старую книгу. Она была переложена закладками и основательно.

С другом ничего не страшно. Сочинение по повести “Приключения Тома Сойера” Много всяческих приключений было в жизни героев Марка Твена – Тома Сойера и Гекльберри Финна. И в каждом эпизоде оказывается важна дружба ребят. Мне хочется вспомнить такой эпизод. Однажды Том.

Сочинение по повести “Приключения Тома Сойера” Легко вообразить чувство двух мальчиков, которые оказались ночью на кладбище. Их всегда привлекало все тайное, неведомое, связанное с опасностью. Том и Гек любили быть открывателями таинственного. Ночное кладбище именно и.

Сейчас вы читаете: Образ Гека Финна и образ Тома Сойера (сравнительная характеристика)

Составить план сравнительной характеристики Тома Сойера и Гекльберри.

Спасибо заранее

Ответ оставил Гуру

Произведения американского писателя Марка Твена пронизанные светом и добрым юмором. Известными героями Марка Твена стали Том Сойер и Гекльберри Финн. В образе главного героя — Тома Сойера — Марк Твен изобразил самого себя в детстве. Основой повести стали реальные события, которые состоялись в года его детства, поэтому повесть имеет автобиографический характер.

Том Сойер — мальчик, шутник и шалун. Ему не по вкусу жизнь образцового мальчика и образцовой семьи, размеренная жизнь «по правилам» противоречит его бунтарскому духу. Он непоседа, выдумщик и фантазер. Начитавшись историй о смелых и отважных разбойниках, которые борются за справедливость, помогают слабым, Том ищет приключений в реальной жизни. Он романтик. Мальчик сам наполняет свою жизнь событиями, несмотря на все предостережения взрослых, его не пугают опасности, он радуется своим затеям. Для него жизнь — продолжение любимых книг и игр. Том готов каждый день «осуществлять подвиги», ему некогда скучать, он беззаботный и прыткий. Герой наделен способностью видеть в будничном чрезвычайное. Том умеет испытывать удивление обычным, казалось бы, вещам и подавать событие в непредвиденной интерпретации. Так грандиозным событием в его жизни становится потеря зуба, крашение изгороди. Да и вообще много бытовых предметов (ключ, мел) могут привести к чрезвычайным событиям. В мире Тома так много тайн и приключений.

Том — надежный товарищ, он умеет сохранять тайны и по-настоящему дружить. Недаром лучшим другом Тома есть «уличный» мальчишка, беспризорник — Гек Финн, Том здравомыслящий, благородный и смелый. Он умеет преодолеть страх, взять себя в руки и не впасть в отчаяние, несмотря на юные года, у него есть ощущения ответственности. Это выразительно описано в рассказе о том, как Том вместе с Бекки — девушкой, в которую он влюбился, — забрели в пещеру. Храбрость, мужество, сообразительность и решительность — эти недетские черты характера Тома помогли ему выбраться вместе из Бекки из пещеры.

Все события, связанные с Томом, делают роман захватывающим и незабываемым. Захватывающие приключения Тома Сойера и Геккельберри Финна не оставляют равнодушными много поколений читателей, подавая пример того, как воспитать в себе те человеческие качества, которые присущи Тому Сойеру.

Источники:

http://studentguide.ru/tven-m/obraz-geka-finna-i-obraz-toma-sojera-sravnitelnaya-xarakteristika.html
http://studentguide.ru/tven-m/obraz-geka-finna-i-obraz-toma-sojera-sravnitelnaya-xarakteristika.html
http://zadachki.net/literatura/page6390820.html

ГДЗ Світова література 5 клас. Підручник Волощук Є.В. 2018 » Сторінка 45 » Rule.School

Запитання і завдання до прочитаних уривків

1. Чому Том і Гек вирушили вночі на цвинтар? Як вони почувалися на початку своєї пригоди? Обґрунтуйте відповідь рядками тексту.

Уночі Том і Гек потайки пішли на цвинтар, аби випробувати «рецепт» лікування бородавок за допомогою дохлої кішки.

2. Розкажіть про злочин, свідками якого стали Том і Гек. Яким постає в цьому епізоді індіанець Джо?

Поттер та індієць Джо несли ноші з мотузкою і двома лопатами. Вони поклали ноші на землю і почали розкопувати могилу. Лікар поставив ліхтар в головах могили, а сам сів на землю, притулившись спиною до одного з ясенів. Він був так близько, що хлопці могли доторкнутись до нього.

3. Чому хлопці вирішили нікому не розповідати про те, що бачили на цвинтарі? А чому Том все ж таки виступив на захист Мефа Поттера? Які риси характеру юного героя розкрилися в цій ситуації? А як на його місці вчинили б ви?

Боячись жорстокого індіанця Джо, Том і Гек заприсягнулися нікому не розповідати про побачене на цвинтарі. Тим часом поліцейське розслідування показало, що злочин скоїв Меф Поттер. Чоловіка було кинуто до в’язниці. Містечко чекало на суд і найсуворіший вирок для вбивці. Думка про те, що буде покарано невинного, не давала хлопцям спокою. Однак страх перед Джо й вірність клятві були сильнішими за голос сумління…

4. Що Том і Беккі пережили в печері? Як вони поводилися під час цієї пригоди?

Спершу вони бродили по похмурих закутках печери разом з рештою товариства. Відвідали вже знайомі їм дива печери, дива, що мали трохи вишукані назви, як-от: «Вітальня», «Собор», «Палац Аладдіна» та інші. Потім почали гратися в схованки, і Том і Беккі ретельно брали участь у цій веселій грі, але зрештою вона трохи набридла їм. Потім вони вдвох увійшли в кривулясту галерею, високо тримаючи свої свічки і розбираючи плутанину імен, дат, адрес і висловів, якими вкрито було скелясті стіни. Ідучи й розмовляючи, діти не помітили, як увійшли до тієї частини печери, де на стінах не було написів. Вони вивели кіптем свої імена на стіні під навислим каменем і рушили далі. Потім вони набрели на струмок, який, падаючи зі скелі і приносячи з собою вапно, на протязі століть утворив мереживну Ніагару з блискучого міцного каміння. Худенький Том легко протиснувся крізь вузьку щілину до цього водоспаду і освітив його свічкою, щоб зробити приємність Беккі.

5. Чим Гек відрізнявся від своїх однолітків? Знайдіть опис зовнішності (портрет) цього героя. Що ви можете розповісти про характер і спосіб життя хлопчика за цим описом?

Портрет Гека: «Нікуди не поспішаючи, йде вулицею містечка хлопець. Його одяг звисає лахміттям, пацюки відгризли від його бриля величезний шмат; жодного ґудзика немає на його одязі — але йому байдуже. Він сам собі за хазяїна: відпочивав, де міг і коли хотів, вештався, де заманеться, ніхто ні до чого не примушував, він не мився, не одягав чистої білизни, лаявся. Кому, скажіть, дозволять батьки виводити бородавки за допомогою дохлої кішки? Звісно, нікому. А йому все було можна, він відповідав сам за себе.»

6. Порівняйте! Складіть план порівняльної характеристики образів Тома й Гека.

Якості характерів Тома і Гека. (Обидва — веселі бешкетники, але Гек більш досвідчений у життєвих питаннях, він може вижити в будь-якій ситуації, а Том ніколи не знає, куди приведуть його нові фантазії. Гек самостійніший, ніж Том, не любить підкорятися, виконувати те, чого не хоче. Том — домашня дитина, він намагається знайти компроміс зі світом дорослих, влаштувати все так, шоб усім було добре. Яскраве підтвердження цьому — випадок із фарбуванням паркана.) Чому Том і Гек — друзі? Обидва хлопчики — з різних соціальних прошарків, тому тітка Поллі не дозволяє Томові товаришувати із Геком. Однак у них є дуже важливі для дружби спільні речі: однакова любов до волі та пригод, не-сприймання насильства та примусу, почуття



Назад1 … 41 42 43 44 45 46 47 48 49 … 51ГДЗ 5 клас Підручник Світова література Волощук Генеза Якщо помітили в тексті помилку, виділіть її та натисніть Ctrl + Enter

Незвичайні пригоди звичайного бешкетника

Літературна розминка

1. Як ви розумієте слово «пригода»? Наведіть приклади творів літератури, кіно і мультиплікації, в яких зображені пригоди дітей.

Пригода — непередбачений, несподіваний випадок в житті; подію, що сталася під час подорожі, мандрівки, часто пов’язана з ризиком.

2. Які риси характеру зазвичай герої пригодницьких творів?

Характери головних героїв вже на початку подається цілісним, сформованим. Але і він розвивається, як і належить характеру позитивного героя пригодницького твору, по лінії благородства.

Перевірте себе 1.

Назвіть справжнє ім’я письменника Марка Твена. Як виник його псевдонім?

Ім’я письменника Семюель Ленгхорн Клеменс. Семюел Клеменс довелося стати солдатом війська Конфедерації. Втім через два тижні він дезертирів з лав армії Півдня і відправляється на захід, до брата в Неваду. Тоді саме пішов поголос, що в диких преріях цього штату знайшли срібло і золото. Тут Семюель працював цілий рік на срібному руднику. Паралельно писав гумористичні оповідання для газети «Терріторіал ентерпрайз» в Вірджіні-Сіті і в серпня 1862-го отримав запрошення стати її співробітником. Тоді ж Семюель Клеменс взяв собі псевдо вираз лотів на Міссісіпі, які вигукували «Марк Твен» («відмітка 2»), Що означало достатню глибину для безпечного плавання.

2. Що вам відомо про дитячі та юнацькі роки письменника? Як обставини того часу вплинули на його творчість?

Коли Марку Твену виповнилося чотири роки, його родина переїхала в містечко Ганнібал, де був річковий порт на Міссісіпі. Згодом Ганнібал стане прообразом міста Санкт-Петербург в знаменитих романах «Пригоди Тома Сойєра» і «Пригоди Гекльберрі Фінна». У той час Міссурі був рабовласницьким штатом, тому вже тоді Марк Твен зміг ознайомитися з рабством, яке буде згодом описувати та засуджувати у своїх творах.

3. Про що йдеться у творі «Пригоди Тома Сойєра»? Які життєві цінності стверджує в ньому автор?

Автор не дає від себе ніяких коментарів, але його співчуття цілком на боці Тома. Звідси й життєрадісний гумор Марка Твена, не так вже нешкідливий, як може здатися на перший погляд. Кумедні пригоди Тома Сойєра по суті є історією осягнення хлопчиком законів буржуазного суспільства. Варто було тільки тому і Гек знайти скарб, як «багато городян навіть пошкодилися в розумі, не витримавши хвилювання. Куди б не пішли Том з Геком, їх всюди доглядали, захоплювалися ними, витріщалися на них». Хлопчики зрозуміли, що в навколишньому світі цінність людини визначається не його особистими достоїнствами, а багатством. Однак володіння цим багатством принесло тому і Гек, особливо останньому, одні лише прикрощі і неприємності. У повісті про Тома Сойєра переважають радісні, безтурботні тону.

4. Чим Том і Гек відрізняються від інших героїв пригодницької літератури?

Том і Гек — чудові хлопці й справжні друзі. Вони завжди разом — і в біді, і в радості, вони щирі та вірні. Вони зможуть пронести почуття дружби через все життя.

5. Дайте визначення понять «повість» і «роман».

  • Повість — епічний прозовий твір (рідше віршований), який характеризується однолінійним сюжетом, а за широтою охоплення життєвих явищ і глибиною їх розкриття займає проміжне місце між романом та оповіданням.
  • Роман — великий за обсягом і складний за будовою епічний твір, в якому широко охоплені важливі і складні суспільні процеси, всебічно і в розвитку показані численні персонажі.

Літературний практикум

1. Перечитайте початок розділу «чудовий художник». Як в ньому передано життєрадісний, світлий настрій літнього ранку? Прочитайте відповідні рядки твору.

Ранок видався ясний і свіжий. Життя вирувало. Кожне серце співало, а якщо серце було ще й молоде, то з вуст зривалася пісня. У всіх людей усміхнені обличчя, все йшли весело. Цвіли акації, наповнюючи п’янким запахом повітря. Кардівська гора, височіла над містом, зазеленіла, здавалась чудовою привабливою державою, повною світу і спокою.

2. З яким почуттям Том взявся до роботи? Чому?

Неохоче, тому що він не хотів працювати.

3. Як героєві вдалося залучити до побілки паркана інших дітлахів? Який «великий закон», що керує вчинками людей, він відкрив?

— Приємно? А що тут неприємної? Хіба кожен день вдається білити паркани?

Це перетворило все по-новому. Бен перестав гризти яблуко. Том м’яко водив щіткою вгору і вниз відходив трохи, щоб помилуватися, підмазував то тут, то там, критичним поглядом оглядав зроблене. Бен стежив за кожним його рухом та все більше зацікавлювався.

Нарешті Бен не витримав:

— Слухай, Том, дай я трохи побілю.

Том задумався, готовий був погодитися, але потім передумав:

— Ні, Бен, нічого не вийде. Бачиш, тітка Поллі надто піклується про це паркан: він виходить на вулицю. Якщо б це у дворі — це інша справа, але тут треба фарбувати дуже і дуже дбайливо. Я вважаю, що навряд чи знайдеться хоч хтось один на тисячу, навіть на дві тисячі хлопців, хто може це зробити як слід.

— Невже? Дай я тільки спробую трохи. Я б тобі дала, щоб ти був на моєму місці. Дай, Том

— Бен, я б із задоволенням, чесне слово. Але тітка Поллі. Знаєш, Джим вже просив, але вона не дозволила йому. Сід теж просився — не пустила і Сіда. Тепер ти сам бачиш, що я не можу тобі довірити цю роботу. Почнеш фарбувати паркан, і що-небудь вийде не так.

— Так що ти, Том Я буду старатися. Мені б тільки спробувати! Слухай: я тобі дам серединку ось цього яблука.

— Ну добре! Однак немає, Бен, краще не треба. Я боюсь.

— Я тобі дам все яблуко. Все що залишилось.

4. Які ситуації або деталі з розділу «чудовий художник» вас розсмішили? Чому?

Те, як він привертав інших дітей до роботи.

Запитання та завдання до прочитатаного уривка

1. Чому Том і Гек вирушили вночі на кладовищі? Як вони почувалися на початку своєї пригоди? Обґрунтуйте відповідь рядками тексту.

Вночі Том і Гек потайки пішли на кладовище, щоб випробувати «рецепт» лікування бородавок за допомогою дохлої кішки.

2. Розкажіть про злочин, свідками якого стали Том і Гек. Яким постає в цьому епізоді індіанець Джо?

Поттер і індіанець Джо несли ноші з мотузкою і двома лопатами. Вони поклали носилки на землю і почали розкопувати могилу. Лікар поставив ліхтар в головах могили, а сам сів на землю, притулившись спиною до одного з ясенів. Він був так близько, що хлопці могли доторкнутися до нього.

3. Чому хлопці вирішили нікому не розповідати про те, що бачили на кладовищі? А чому Том все ж виступив на захист Мефа Поттера? Які риси характеру юного героя розкрилися в цій ситуації? А як на його місці вчинили б ви?

Боячись жорстокого індіанця Джо, Том і Гек заприсягнулася нікому не розповідати про побачене на кладовищі. Тим часом поліційське розслідування показало, що злочин скоїв Меф Поттер. Чоловік був кинутий у в’язницю. Місто чекало суд і суворий вирок для вбивці. Думка про те, що будуть покарані невинного, не давала хлопцям спокою. Однак страх перед Джо і вірність клятві були сильнішими голоса совісті …

4. Том і Беккі пережили в печері? Як вони поводилися під час цього події?

Спочатку вони бродили по похмурих завулках печери разом з рештою. Відвідали вже знайомі їм дива печери, чудеса, які мали трохи вишукані назви, наприклад, «вітальня», «собор», «палац Аладдіна» та інші. Потім стали гратися в хованки, і Том і Беккі ретельно брали участь в цій веселій грі, але зрештою вона трохи набридла їм. Потім вони вдвох увійшли в змієподібну галерею, високо тримаючи свої свічки й розбираючи плутанину імен, дат, адрес і виразів, якими покрито було скласти стіни. Йдучи та розмовляючи, діти не помітили, що увійшли в тій частині печери, де на стінах не було написів. Вони вивели кіптяви свої імена на стіні під навислим каменем і рушили далі. Потім вони натрапили на струмок, який, падаючи зі скелі і приносячи з собою вапно, протягом століть утворив мереживну Ніагару з блискучого міцного каменю. Худенький Том легко протиснувся крізь вузьку щілину до цього водоспаду і освітив його свічкою, щоб зробити приємність Беккі.

5. Чим Гек відрізнявся від своїх однолітків? Знайдіть опис зовнішності (портрет) цього героя. Що ви можете розповісти про характер і спосіб життя хлопчика за цим описом?

портрет Гека «Нікуди не поспішаючи, йде вулицею містечка парубок. Його одяг звисає лахміттям, щури відгризли від його капелюха величезний шматок; ні гудзика в його одязі — але йому все одно. Він сам собі господаря: відпочивав, де міг і коли хотів, бродив, де заманеться, ніхто ні до чого не примушував, він не мився, а не надягав чистої білизни, лаявся. Кому, скажіть, дозволять батьки виводити бородавки за допомогою дохлої кішки? Звичайно, нікому. А йому все було можна, він відповідав сам за себе.»

6. Порівняйте! Складіть план порівняльної характеристики образів Тома і Гека.

Якості характерів Тома і Гека.

Обидва — веселі пустуни, але Гек більш досвідчений в життєвих питаннях, він може вижити в будь-якій ситуації, а Том ніколи не знає, куди приведуть його нові фантазії.
Гек самостійніше, ніж Том, не любить підкорятися, виконувати те, чого не хоче.
Том — домашня дитина, він намагається знайти компроміс зі світом дорослих, влаштувати все так, щоб всім було добре. Яскраве підтвердження цьому — випадок з фарбуванням паркану.

Чому Том і Гек — друзі?

Обидва хлопці — з різних соціальних верств, тому тітка Поллі не дозволяє Тому дружити з Геком. Проте у них є дуже важливі для дружби загальні речі: однакова любов до свободи й пригод, ніяк сприйняття насильства і примусу, почуття

О чём хотел сказать автор в романе робинзон крузо

Роб народився у 1160 році .Його батько був головним лісничим. У дитинстві він захоплювався стрільбою з лука.Його мати була проти цього ,адже виросла у благодатній родині.Хлопчик дружив з Біллі сином батькового брата та з Маріан єдиною донькою графа Хантінгтона.За підступним наклепом ворогів лісничого  Фітзу було знято з посади. Не витримавши цього батьки Роба померли.                 Коли Роб йшов на змагання ,то він зустрів лісничого й лісничий йому сказав, якщо він влучить у ціль заробить 20 монет , якщо ні , то прочухана. Роб сказав, що якщо він не попаде в ціль то краще хай йому відрубають голову.Роб влучив в оленя . Лісничий його прогнав і впустив йому стрілу у спину, але не попав. Роб розвернувся націлив на лісничного і влучив.І утік. Підтримувала його у змаганні Маріан. Його давня подруга. Ім я йому дали розбійники.                                                                      

Краткое содержание
К бабке Агафье приехал из города погостить сын с семьёй. Сам сын и его жена кандидаты, а дочь школьница. Вечером у дома Капустина собрались местные жители. Собравшиеся и Капустин пошли к дому старухи Журавлёвой, к которой приехал сын.Капустин в деревне славился тем, что может любого в неловкое положение поставить, даже самого учёного человека.  Деревенских мужиков кандидат встретил радостно и всё было бы хорошо, если бы не Капустин. Между кандидатом и Капустиным завязался спор на философские темы. Капустин начал задавать каверзные вопросы, на которые кандидат Журавлёв не знал, что и ответить. И тогда Капустин сказал, что костюм то на вас кандидатский и подкатили вы шикарно к дому старухи, на такси, но вот к общению с народом не подготовились. После этого все разошлись по домам. Опять Глеб Капустин » оттянул», » срезал» теперь уже кандидата.
Главные герои 
1. Глеб Капустин
2. Константин Журавлёв — кандидат
3. Жена Журавлёва
Отзыв 
Я очень люблю творчество Шукшина. Его рассказы наполнены шутками , доброй иронией. Шукшин , на мой взгляд, автор , которому лучше всего удаётся рассказать о быте, нравах простого русского народа. Все персонажи его рассказов настолько реалистичны, в них зачастую можно узнать соседа по дому, старого знакомого. Наверное это потому , что Шукшин сам из народа. К данному рассказу очень подошла бы цитата из » Евгения Онегина» — » Мы все учились понемногу, чему — нибудь и как — нибудь» То есть, есть такие люди, которые нахватавшись поверхностных знаний, строят из себя «всезнаек «


это означает что сабака была хорошей и мальчик. её любил

Гигантский- огромный, большой
Корявый- кривой, корой, неровный

Он передвигался чаще всего на коне, было дело что он на ядре летел.

Сравните два описания текста пушкина борис годунов

Вроде о природе-зиме.

речь тараса о дружбе и товариществе, сам убивает сына за предательство, когда горит на костре, подсказывает своим, как спастись

9 мая это, несомненно, самый важный праздник в стране. Ведь без великой победы могло бы не быть и нас. Люди, воевавшие за наше светлое будущее, и возможность быть свободными, достойны уважения. Хотя многие об этом забыли, и даже не способны уступить место в общественном транспорте. Ветеранов войны, тех, кто действительно рисковал своими жизнями, держали в руках оружие, осталось совсем немного, ведь на фронт брали с восемнадцати лет, а с момента окончания войны прошел уже семьдесят один год, самым молодым ветеранам почти девяносто лет. И мало людей доживают до этого возраста, в связи с ухудшающейся экологией и не качественном питании. Есть, безусловно, те, кто сжигал свои документы, для того чтобы защитить свою родину, в то время в людях был воспитан патриотизм. И так как воевать до совершеннолетия не брали, они шли на такой отчаянный поступок. Ежегодно к 9 мая молодежные коллективы подготавливают всяческие выступления, поют тематические песни, танцуют. Школьники к этому же празднику учат стихи, читают книги о происшествиях военного времени. Вспоминают моменты из истории. В преддверье праздника, ходят к ветеранам домой, поздравляют, дарят подарки, всячески помогают. Про этот торжественный день, снято множество фильмов, написано неимоверное количество песен, и их обязательно транслируют по всем телеканалам в течение всего дня. 9 мая в каждом уголке страны проходит парад в честь дня победы, а где-то даже парад военной техники. Начинают празднование дня победы с шествия к могиле неизвестного солдата, и возложения к ней венков и цветов, чаще всего это гвоздики или тюльпаны. Затем проходит минута молчания, парад, а завершает вечер праздничный салют. И, конечно же, поздравляют тех людей, благодаря которым живем, ветеранов. День великой победы над фашисткой Германией празднуется на всей территории бывшего советского союза. Так же 9 мая отмечают в Израиле и Лондоне. В современной России это выходной, но так было не всегда, при правлении Сталина выходной был отменен и перенесен на новый год, но люди так же отмечали этот праздник, ведь не могли же они забыть, какой подвиг совершила красная армия. В парках так же были массовые гуляния, в больших городах торжественный салют, в тридцать залпов. И лишь в тысяче девятьсот шестьдесят пятом году был возвращен выходной в честь праздника, это случилось уже при Брежневе. В православных церквях в этот день проходит служба об упокоении всех погибших на этой войне.
Существующие традиции появились не за один день, они накапливались десятилетиями, последние годы появилась замечательная традиция, повязывать георгиевские ленты, причем это делают не только ветераны великой отечественной войны, но и молодое поколение. Эти ленты так же вешают на автомобиль. Найти их не проблема, почти в каждом городе, год за годом их раздают волонтеры. Также с две тысячи тринадцатого года появился новый обычай, тожественное шествие по площади, с фотографиями родных, погибших в этой страшной войне.
Великая отечественная война, началась 22 июня 1940 года, разведчики, конечно, предупреждали о предстоящем наступлении, но власти, верили в подписанную Германией бумагу о том, что в течение десяти лет они находятся в состоянии перемирия, до последнего не верили. Первый год германия побеждала, так как солдаты ли готовились к сражениям, но затем советская армия собралась и начала одерживать победы. Но, не смотря ни на что, именно советские вооруженные силы избавили весь мир от фашистского режима. Ведь как оказалось, в Европе почти не было сил сражаться с Германией, и они очень быстро сдались, тем самым отдав оружие врагу. В планах наполеона было целью стереть весь советский союз с лица земли, но он недооценил силу и мощь нашего войска. Восьмого же мая германия подписала акт о безоговорочной капитуляции, который был изначально отклонен. Всего в ходе войны уничтожено множество техники, танков, самоходных орудии, тяжелой артиллерии. Она унесла с собой более десяти миллионов жизней, только в заключающем побоище, погибло больше пятнадцати тысяч человек. Война коснулась каждой семьи, унесла жизнь кого-то родного и близкого. День победы отмечается я того чтобы люди не забывали какой ценой досталась эта победа, сколько людей полегло. Давайте же уважать ветеранов, по возможности помогать, и дарить им любовь и уважение. Это их вечный праздник! 

1) А. С.Пушкин 2) Гланый герой балда 3) .Поп хотел обмануть балду при приёме на работу,но Балда перехитрил его.»Вот Балда,сметливый очень,обманул попа,хитрец!» Жадность попа была наказана.Балда отдал оброк и стал требовать платы.Балда стал щёлкать попа по лбу.Поп лишился от этого ума.А Балда сказал:»Не гонялся бы ты,поп,за дешевизной

Лекция учителя литературы школы № 57, главного редактора журнала «Литература» Сергея Волкова «Есть ли логика у абсурда, или Как это сделано у Гоголя», прошедшая в рамках цикла лекций «XIX век. О чем молчит школьная программа или не ЕГЭ» на Малом Богословском факультете Православного Свято-Тихоновского университета. Речь шла о гоголевских повестях и о тех странностях, которые делают их узнаваемо гоголевскими. Полный текст и видеозапись лекции.

Вот мы читаем Гоголя, я открываю текст на любой странице, начинаю читать, и в какой-то момент я понимаю: это Гоголь. Не потому, что я посмотрел на обложку, или меня предупредили, что я буду читать Гоголя, а вот почему-то я понимаю, что читаю текст, который написан тем или иным писателем: Гоголем, Чеховым, Лермонтовым, Достоевским.

Почему я это понимаю? Откуда я это знаю? Это как вкус, как какой-то аромат, это как-то непонятно, да? Это как чей-то голос будто бы. Когда мы включаем радио, мы же не знаем, кто поет. Мы его узнаем по голосу. По тембру, по окраске, по манере, по характеру.

Марк Твен. «Пригоди Тома Сойєра». Том Сойєр та Гекльберрі Фінн

Тема: Марк Твен. «Пригоди Тома Сойєра». Том Сойєр та Гекльберрі Фінн.
Мета: розвивати навички зв’язного мовлення учнів, продовжувати формувати вміння аналізувати літературний твір, працювати з текстом, вчити порівнювати образи головних героїв твору, виховувати вдумливого читача.
Обладнання: портрет письменника, тексти твору «Пригоди Тома Сойєра», ілюстрації до нього, фрагмент з фільму «Пригоди Тома Сойєра» ( за мотивами книги «Пригоди Тома Сойєра»)

Хід уроку

І. Організаційний момент. Оголошення теми та мети уроку.

ІІ. Актуалізація вивченого матеріалу.

1. Бесіда за запитаннями:

— Яке враження на вас справила книжка М.Твена «Пригоди Тома Сойєра»?

— Що ми довідались з перших розділів про Тома Сойєра?

— Який епізод вам найбільше сподобався?

2. Літературна вікторина: « Впізнай героя»:

— « Як багато хто з простодушних людей, вона тішила себе марнославною думкою, ніби має неабиякий хист до таємничої дипломатії, і вважала свої наївні хитрощі за чудеса винахідливості й підступності» ( тітка Поллі)

— «…то був слухняний хлопчик, який не любив пустощів і нікому не завдавав клопоту» (Сід)

— «…у цього хлопчиська і витівки щоразу інші, отож не знаєш, чого й сподіватися» (Том)

— «…сповільнив швидкість, вийшов на середину вулиці і, нахилившись на правий борт, повернув до узбіччя –неквапливо, старанно й з належною солідністю, бо вдавав «Велику Міссурі», що мала осадку в дев’ять футів. Він був водночас і пароплав, і капітан, і сигнальний дзвін, отож мусив уявити, ніби стоїть сам на собі, на капітанському містку, сам дає команди й сам їх виконує» (Бен Роджерс)

— « Із хвіртки, наспівуючи «Дівчата з Буффало», підтюпцем вибіг…з бляшаним відром у руці» (Джім)

— «… право білити придбав – за дохлого пацюка на мотузці, щоб крутити ним над головою…» ( Джонні Міллер)

— « Він пробував якось виплутатися, але під пильним поглядом господаря щоразу бовкав дурницю за дурницею» ( Гек Фінн)


ІІІ. Вивчення нового матеріалу.

1. Слово вчителя.

Твір американського письменника Марка Твена «Пригоди Тома Сойєра» пройнятий світлом і добрим гумором. Відомими героями Марка Твена стали Том Сойер і Гекльберрі Фінн. Історія про двох хлопчаків — вигадника і фантазера Тома Сойєра та його вірного друга та зброєносця Гека Фінна — захоплювала не одне покоління читачів. Дуже мало знайдеться дорослих, які б не читали «Пригоди Тома Сойєра». Ця повість належить до тих книжок, які читають у дитинстві і перечитують у дорослому віці, знаходячи дотепи, що загубили через дитячу нерозважливість.

2. Бесіда:

— Яким ви уявляєте Тома? Знайдіть його опис у тексті.

3. Перегляд фрагмента з фільму за мотивами повісті «Пригоди Тома Сойєра».

Чи співпали ваші уявлення про героя та образ, представлений режисером?

— Про що свідчать витівки хлопців?

— А що можна сказати про Гекльберрі Фінна?

— Яке ставлення до дружби у Тома та Гека?


4. Характеристика Тома Сойєра.
Том Сойер — звичайний хлопчик, жартівник і пустун. Йому не до смаку життя зразкового хлопчика зі зразкової сім’ї, розмірене життя «за правилами» протирічить його бунтарському духові. Він непосида, вигадник і фантазер. Начитавшись історій про сміливих і відважних розбійників, які борються за справедливість, допомагають слабким, Том шукає пригод у реальному житті. Він романтик. Хлопчик сам наповнює своє життя подіями, незважаючи на всі застереження дорослих, його не лякають небезпеки, він радіє своїм витівкам. Для нього життя — продовження улюблених книг та ігор. Том готовий щодня «здійснювати подвиги», йому ніколи нудьгувати, він безжурний і меткий. Герой наділений здатністю бачити в буденному надзвичайне. Том уміє дивуватися звичайним, здавалося б, речам і подавати подію в непередбачуваній інтерпретації. Так, грандіозною подією в його житті стає втрата зуба, фарбування огорожі. Та й узагалі багато побутових предметів (ключ, крейда) можуть привести до надзвичайних подій. У світі Тома так багато таємниць і пригод. Том — надійний товариш, він уміє зберігати таємниці і по-справжньому дружити. Недаремно кращим другом Тома є «вуличний хлопчисько, безпритульник — Гек Фінн. Том — розсудливий, благородний і сміливий. Він уміє подолати страх, узяти себе в руки і не впасти у відчай, незважаючи на юні роки, у нього є відчуття відповідальності. Це виразно виявилося у розповіді про те, як Том разом з Бекі — дівчиною, в яку він закохався, — заблукали у печері. Хоробрість, мужність, кмітливість і рішучість — ці недитячі риси вдачі Тома допомогли йому вибратися разом із Бекі з печери.

4. Характеристика Гекльберрі Фінна

Гекльберрі Фінн — син відомого в містечку пияка, людини, яку всі обминали. Репутація батька відбилася і на ставленні мешканців міста до сина. Правда, і сам Гек Фінн був нероба, безпритульник і розбишака. Він завжди був одягнений в недоноски з дорослих людей. Гекльберрі був сам собі господар і робив усе, що заманеться. Батьки інших дітей побоювалися Гека, бо він немовби магнітом притягував до себе їхніх дітей. Йому подобалися незвичайні люди, що живуть за своїми правилами. Безтурботні, зухвалі люди, що йдуть на ризик задля досягнення своєї мети. Люди, які нехтують небезпекою у пошуках пригод. Такою людиною, на думку Тома, був Гекльберрі Фінн, якого він щиро полюбив.  Як до цієї дружби ставилися дорослі, свідчить такий факт. Йдучи до школи, Том зустрів Гека. Звісно, хлопець спізнився, і вчитель запитав чому. Том відповів, що зупинився побалакати з Гекльберрі Фінном. Учитель розгублено подивився на Тома, бо це була зухвала витівка учня. Але Том утаїв від вчителя, про що саме він розмовляв з Геком. А це б зацікавило вчителя. Хлопці домовилися наступної ночі відправитися на кладовище. Саме цей похід був у авантюрному дусі обох хлопців.

Том і Гек дізналися, що індіанець Джо переховує скарб. Їм закортіло заволодіти цим скарбом. Врешті-решт Том і Гек в невеликій затишній печерці знайшли скриньку зі скарбом. Вона важила фунтів п’ятдесят. Нести було важко, незручно, але хлопці захопили із собою торбини і гроші переклали в них. Сам володар цього скарбу індіанець Джо вже покоївся біля входу в печеру.

ІV. Закріплення матеріалу.

1. Інсценування уривка з твору.

2. Перегляд фрагмента з фільму за мотивами повісті «Пригоди Тома Сойєра».

— Як ви оцінюєте поведінку хлопчаків на кладовищі?

Прослідкуйте, як від звичайних пустощів та розваг хлопці перейшли до справжніх благородних вчинків?
3.Складання плану до порівняльної характеристики героїв.

План.


1.Сімейний стан героїв.

2. Матеріальний достаток дітей на початку твору.

3. Ставлення до освіти та виховання.

4. Спільні та відмінні риси характеру героїв.

5. Стосунки героїв з іншими персонажами твору.

6. Роль дружби в житті хлопчиків.

7. Авторське ставлення до своїх героів.
V. Підведення підсумків уроку.

Слово вчителя.

Отже, ми переконались, що Том і Гек – справжні друзі. І вони не тільки бешкетують, але можуть бути й цілком серйозними та відповідальними людьми. На кладовищі хлопці стали свідками жахливої сцени. На їхніх очах було вбито лікаря Робінсона. Це була їх перша спільна таємниця. Вони поставили кров’ю свої підписи під клятвою на сосновій дошці, що ніхто не дізнається про те, що сталося на кладовищі. Але клятву було порушено, оскільки мовчання заподіяло б зло невинній людині, на яку впала підозра у вбивстві лікаря Робінсона. Цей вчинок свідчить про милосердя друзів, про співчуття до чужої біди і сміливість. Дух авантюризму і потяг до пригод ніколи не залишали Тома і Гека. Одного разу вони і ще один підліток Джо Гарпер, узявши незвичайні імена, вирішили втекти з дому і оселитися на острові. У містечку здійснився переполох, усі вирішили, що хлопці потонули. їхні родичі замовили панахиду в церкві.Тось коли почалася сумна, скорботна церемонія, хлопці з’явилися. Том і Гек — чудові хлопці і справжні друзі. Вони завжди разом — і в біді, і в радості, вони щирі й вірні. Вони зуміють пронести почуття дружби через усе життя.
VI. Домашнє завдання. Скласти розповідь «Порівняльна характеристика образів Тома та Гека за планом.

Глава 8. Разработка стратегического плана | Раздел 1. Обзор стратегического планирования или «VMOSA» (видение, миссия, цели, стратегии и планы действий) | Основной раздел

Узнайте, как использовать VMOSA, чтобы воплотить мечту в реальность, развивая видение, ставя цели, определяя их и разрабатывая планы действий.

  • Что такое ВМОСА?
  • Почему вашей организации следует использовать VMOSA?
  • Когда следует использовать VMOSA?

VMOSA (Видение, Миссия, Цели, Стратегии и Планы действий) — это практический процесс планирования, который помогает группам сообщества определить видение и разработать практические способы реализации изменений.VMOSA помогает вашей организации ставить и достигать краткосрочных целей, не забывая при этом о долгосрочном видении. Внедрение этого процесса планирования в деятельность вашей группы способствует выработке четкой миссии, достижению консенсуса и обоснованию мечтаний вашей группы. В этом разделе рассказывается, как и когда внедрить VMOSA в процесс планирования вашей организации.

Что такое ВМОСА?

Один из способов сделать это путешествие — это стратегическое планирование, процесс, с помощью которого группа определяет свою собственную «VMOSA»; то есть его V ision, M ission, O цели, S trategies и A ction Планы. VMOSA — это практический процесс планирования, который может использоваться любой общественной организацией или инициативой. Этот комплексный инструмент планирования может помочь вашей организации, предоставив план перехода от мечты к действиям и положительным результатам для вашего сообщества.

В этом разделе мы дадим общий обзор процесса и кратко коснемся каждой из отдельных частей. В примерах мы покажем вам, как инициатива по предотвращению подростковой беременности эффективно использовала процесс VMOSA.Затем в Инструментах мы предлагаем вам возможную повестку дня выездного семинара по планированию, если ваша организация решит использовать этот процесс. Наконец, в оставшихся разделах этой главы вы пройдете через шаги, необходимые для полного развития каждой части процесса.

Почему вашей организации следует использовать VMOSA?

Почему вашей организации следует использовать этот процесс планирования? Есть много веских причин, в том числе все следующие:

  • Процесс VMOSA оправдывает ваши мечты. Он делает возможными хорошие идеи, показывая, что должно произойти, чтобы воплотить ваше видение в жизнь.
  • Создавая этот процесс в рамках групповых усилий (заботясь о вовлечении как людей, затронутых проблемой, так и тех, кто способен ее изменить), он позволяет вашей организации достичь консенсуса в отношении вашего внимания и необходимых шагов, которые ваша организация должна предпринять.
  • Этот процесс дает вам возможность развивать свое видение и миссию вместе с теми в сообществе, на которых то, что вы делаете, повлияет.Это означает, что ваша работа, скорее всего, будет отвечать реальным потребностям и желаниям сообщества, а не тем, о чем вы думаете. Это также означает, что сообщество несет ответственность за видение и миссию, ставит всех на одну страницу и значительно увеличивает шансы на успех любого усилия.
  • VMOSA позволяет вашей организации сосредоточиться на краткосрочных целях, не забывая при этом о долгосрочном видении и миссии.

Когда следует использовать VMOSA?

Итак, когда вам следует использовать этот процесс стратегического планирования? Конечно, для вашей организации всегда имеет смысл иметь направление и порядок, которые она вам дает, но в некоторых случаях использование этого процесса имеет особенно хороший смысл. Это время включает:

  • Когда вы начинаете новую организацию.
  • Когда ваша организация начинает новую инициативу или большой проект, или собирается начать работу в новом направлении.
  • Когда ваша группа переходит в новую фазу постоянных усилий.
  • Когда вы пытаетесь активизировать старую инициативу, которая потеряла свою направленность или импульс.
  • Когда вы подаете заявку на новое финансирование или к новому спонсору. В этих обстоятельствах важно прояснить свое видение и миссию, чтобы любое финансирование, которое вы ищете, поддерживало то, что на самом деле отстаивает ваша организация.В противном случае вы можете столкнуться с ограничениями, привязанными к деньгам, которые потребуют от вас выбора направления, не соответствующего истинным целям или философии вашей организации.

Давайте кратко рассмотрим каждый из отдельных ингредиентов, важных в этом процессе. Затем в следующих нескольких разделах мы рассмотрим каждый из них более подробно и объясним, как приступить к разработке каждого шага процесса планирования.

Видение (мечта)

Ваше видение отражает то, что ваша организация считает идеальными условиями для вашего сообщества — как бы все выглядело, если бы важная для вас проблема была решена безупречно.Эта утопическая мечта обычно описывается одной или несколькими фразами или заявлениями о видении, которые представляют собой краткие заявления, передающие мечты сообщества на будущее. Разрабатывая заявление о видении, ваша организация разъясняет убеждения и руководящие принципы вашей организации для более широкого сообщества (а также для вашего собственного персонала, участников и волонтеров).

Есть определенные характеристики, которые объединяет большинство заявлений о видении. Как правило, формулировка видения должна быть:

  • Понятно и передано членами сообщества
  • Достаточно широкий, чтобы охватить множество местных точек зрения
  • Вдохновляет и воодушевляет всех, кто участвует в ваших усилиях
  • Легко общаться — например, они должны быть достаточно короткими, чтобы поместиться на футболке

Вот несколько заявлений о видении, которые соответствуют вышеуказанным критериям:

  • Здоровые дети
  • Безопасные улицы, безопасные кварталы
  • Каждый дом по дому
  • Образование для всех
  • Мир на земле

Миссия (что и зачем)

Разработка миссии — следующий шаг в процессе планирования действий. Заявление о миссии организации описывает то, что группа собирается делать, и почему, она собирается это делать. Заявления о миссии похожи на заявления о видении, но они более конкретны и определенно более «ориентированы на действия», чем заявления о видении. Миссия может относиться к проблеме, такой как неадекватное жилье, или к цели, такой как обеспечение доступа к медицинскому обслуживанию для всех. И хотя они не вдавались в подробности, они начинают намекать — очень широко — на , как ваша организация может предпринять действия по устранению отмеченных проблем.Вот некоторые общие руководящие принципы в отношении заявлений о миссии:

  • Краткое . Хотя это не такая короткая фраза, как изложение видения, формулировка миссии все же должна выражать свою точку зрения в одном предложении.
  • Ориентация на результат . Заявления о миссии объясняют общие результаты, над достижением которых работает ваша организация.
  • Включительно . Хотя в заявлениях о миссии действительно содержатся заявления о всеобъемлющих целях вашей группы, очень важно, чтобы они делали это очень широко.Хорошие формулировки миссии не ограничивают стратегии или секторы сообщества, которые могут быть вовлечены в проект.

Следующие ниже формулировки миссии являются примерами, отвечающими указанным выше критериям.

  • «Содействовать здоровью и развитию детей через комплексную инициативу семьи и общества».
  • «Для создания процветающего афроамериканского сообщества путем развития рабочих мест, образования, жилья и культурной гордости.
  • «Чтобы создать безопасный и здоровый район посредством совместного планирования, действий сообщества и пропаганды политики.«

Хотя сами формулировки видения и миссии должны быть краткими, для организации часто имеет смысл включить свои глубоко укоренившиеся убеждения или философию, которые на самом деле могут определять как ее работу, так и саму организацию. Один из способов сделать это, не жертвуя прямотой видения и заявлений о миссии, — это включить руководящие принципы в качестве дополнения к заявлениям. Они могут изложить убеждения организации, сохраняя при этом ее видение и формулировку миссии краткими и по существу.

Цели (сколько из того, что и когда будет выполнено)

После того, как организация разработала свою миссию, следующим шагом будет разработка конкретных целей, направленных на достижение этой миссии. Цели относятся к конкретным измеримым результатам для общих целей инициативы. Цели организации обычно определяют, сколько из того, что и когда будет выполнено. Например, одной из нескольких целей общественной инициативы по содействию уходу и уходу за пожилыми людьми может быть: «К 2015 году (когда) увеличить на 20% (насколько) количество тех пожилых людей, которые сообщают, что они ежедневно контактируют с кем-то. кто о них заботится (о чем).«

Есть три основных типа объективов . Их:

  • Поведенческие цели . Эти цели касаются изменения поведения людей (того, что они делают и говорят) и продуктов (или результатов) их поведения. Например, группа по благоустройству микрорайона могла бы поставить перед собой цель увеличить объем ремонта дома (поведение) или улучшить жилье (результат).
  • Итоговые цели на уровне сообщества .Они связаны с целями поведенческих результатов, но больше ориентированы на уровень сообщества, а не на индивидуальный уровень. Например, та же группа может предложить увеличение доли достойного доступного жилья в общине в качестве конечной цели на уровне общины.
  • Цели процесса . Это цели, относящиеся к осуществлению деятельности, необходимой для достижения других целей. Например, группа может принять комплексный план улучшения жилищных условий в районе.

Важно понимать, что эти разные типы целей не исключают друг друга. Большинство групп разработают цели по всем трем категориям. Примеры целей включают:

  • К декабрю 2010 г. увеличить на 30% участие родителей (например, разговоры, игры, чтение) с детьми в возрасте до 2 лет. ( Поведенческая цель )
  • К 2012 году увеличить количество выпускников средней школы на 40%. ( конечная цель на уровне сообщества )
  • К 2006 году увеличить на 30% долю семей, владеющих домом.( конечная цель на уровне сообщества )
  • К декабрю этого года реализовать программу обучения волонтеров для всех волонтеров. ( Цель процесса )

Стратегии (как)

Следующим шагом в процессе VMOSA является разработка вашей стратегии. Стратегии объясняют, как инициатива будет достигать своих целей. Как правило, у организаций будет широкий спектр стратегий, которые включают людей из всех различных частей или секторов сообщества.Эти стратегии варьируются от очень широких, которые охватывают людей и ресурсы из самых разных частей сообщества, до очень конкретных, нацеленных на четко определенные области.

Примеры широких стратегий:

  • Программа охраны здоровья детей может использовать социальный маркетинг для поощрения взаимодействия взрослых с детьми
  • Инициатива по подростковой беременности может принять решение об увеличении доступа к контрацептивам в обществе
  • Проект возрождения города может улучшить художественную жизнь сообщества, поощряя артистов выступать в этом районе.

Пять типов конкретных стратегий могут помочь в большинстве вмешательств. .Их:

  • Предоставление информации и развитие навыков (например, обучение навыкам управления конфликтами)
  • Расширение услуг и поддержки (например, запуск программ наставничества для молодежи из групп высокого риска)
  • Изменить доступ, препятствия и возможности (например, предложить стипендии студентам, которые иначе не смогли бы посещать колледж)
  • Изменить последствия усилий (например, стимулировать членов сообщества к волонтерской деятельности)
  • Изменить политики (например,g. изменить политику ведения бизнеса, чтобы позволить родителям, опекунам и волонтерам проводить больше времени с маленькими детьми)

План действий (какие изменения произойдут; кто и что сделает, когда это произойдет)

Наконец, план действий организации очень подробно описывает, как именно будут реализовываться стратегии для достижения целей, разработанных ранее в этом процессе. План относится к: а) конкретным (сообществу и системам) изменениям, которые необходимо найти, и б) конкретным действиям, необходимым для внесения изменений во все соответствующие секторы или части сообщества.

Ключевые аспекты вмешательства или (сообщества и системы) изменений, которые необходимо найти, изложены в плане действий. Например, в программе, целью которой является повышение интереса молодежи к политике, одна из стратегий может заключаться в обучении студентов избирательной системе. Таким образом, некоторые из практических шагов могут заключаться в разработке соответствующих возрасту материалов для учащихся, проведении имитационных выборов кандидатов в местных школах и включении некоторого учебного времени в учебную программу.

Шаги действий разработаны для каждого компонента вмешательства или (сообщества и системы) изменений, которые необходимо найти.К ним относятся:

  • Шаг (-ы) действия: что произойдет
  • Ответственное (ые) лицо (а): Кто и что будет делать
  • Дата завершения: Время каждого этапа действия
  • Необходимые ресурсы: ресурсы и поддержка (как необходимые, так и доступные)
  • Барьеры или сопротивление и план их преодоления!
  • Соавторы: Кому еще следует знать об этой акции

Вот два примера действий, которые показаны на графике, чтобы вы могли легко следить за процессом:

Этап действия Ответственное лицо (а) Срок завершения Необходимые ресурсы Потенциальные барьеры или сопротивление Сотрудники
  • Составить план социального маркетинга
Терри Макнил (из маркетинговой фирмы) Апрель 2006 г. 15000 долларов (оставшиеся пожертвованы) Не ожидается Члены бизнес-группы
  • Попросите местные корпорации ввести гибкий график для родителей и наставников
Мария Суарес (из бизнес-группы) Сентябрь 2008 г. 5 часов; 2-часовая подготовка предложения; 3 часа на встречу и транспорт Corporation: может счесть это дорогим; должен убедить их в выгоде плана для корпорации Члены бизнес-группы и школьной группы

Конечно, как только вы закончите разработку стратегического плана или «VMOSA» для своей организации, вы только начинаете эту работу.Ваш план действий необходимо будет опробовать, протестировать и отредактировать, а затем снова опробовать и отредактировать. Вам нужно будет получить отзывы от членов сообщества, а также добавлять и вычитать элементы вашего плана на основе этих отзывов.

Вкратце

У каждого есть мечта. Но самые успешные люди — и общественные организации — принимают эту мечту и находят способ ее осуществить. VMOSA помогает группам в этом. Этот процесс стратегического планирования помогает группам сообществ определить свою мечту, поставить свои цели, определить способы достижения этих целей и, наконец, разработать практические способы достижения необходимых изменений.

В этом разделе вы получили общее представление о процессе стратегического планирования. Если вы считаете, что ваша организация может извлечь выгоду из использования этого процесса, мы предлагаем вам перейти к следующим разделам этой главы, в которых подробно объясняется, как разработать и разработать свой собственный стратегический план.

Глава 8. Разработка стратегического плана | Раздел 5. Разработка плана действий | Основной раздел

Узнайте, как конкретизировать свое видение, описав стратегии, которые ваша организация будет использовать для достижения своих целей и задач.

  • Что такое план действий?
  • Каковы критерии хорошего плана действий?
  • Почему вам следует разработать план действий?
  • Когда следует разработать план действий?
  • Как написать план действий

Разработка плана действий может помочь тем, кто меняет изменения, воплотить их замыслы в реальность, а также повысить эффективность и подотчетность в организации.План действий описывает способ достижения вашей организацией своих целей с помощью подробных шагов, описывающих, как и когда эти шаги будут предприняты. В этом разделе содержится руководство по разработке и применению плана действий вашей группы.

Что такое план действий?

В некотором смысле план действий — это «героический» поступок: он помогает нам воплотить наши мечты в реальность. План действий — это способ сделать видение вашей организации конкретным. Он описывает, как ваша группа будет использовать свои стратегии для достижения своих целей.План действий состоит из ряда шагов или изменений, которые необходимо осуществить в вашем сообществе.

Каждый шаг действия или изменение, которое необходимо найти, должны включать следующую информацию:

  • Какие действия или изменения произойдут
  • Кто будет выполнять эти изменения
  • Когда они будут иметь место и как долго
  • Какие ресурсы (т.е. деньги, персонал) необходимы для проведения этих изменений
  • Связь (кто что должен знать?)

Каковы критерии хорошего плана действий?

План действий по вашей инициативе должен соответствовать нескольким критериям.

Есть план действий:

  • Полный ? Перечислены ли в нем все шаги или изменения, которые необходимо предпринять во всех соответствующих частях сообщества (например, в школах, бизнесе, правительстве, религиозном сообществе)?
  • Прозрачный ? Очевидно, кто что будет делать и к какому сроку?
  • Текущий ? Отражает ли план действий текущую работу? Предвидит ли он новые возникающие возможности и препятствия?

Почему вам следует разработать план действий?

Есть вдохновляющая поговорка: «Люди не планируют проигрывать. Вместо этого они не могут планировать ». Поскольку вы, конечно, не хотите терпеть неудачу, имеет смысл предпринять все шаги, необходимые для достижения успеха, включая разработку плана действий.

Есть много веских причин для проработки деталей работы вашей организации в плане действий, в том числе:

  • Чтобы укрепить доверие к вашей организации. План действий показывает членам сообщества (включая грантодателей), что ваша организация хорошо организована и привержена делу.
  • Чтобы не упустить ни одной детали
  • Чтобы понять, что можно, а что нельзя делать в вашей организации.
  • Для эффективности: для долгосрочной экономии времени, энергии и ресурсов
  • Для подотчетности: для увеличения шансов, что люди будут делать то, что необходимо.

Когда следует составлять план действий?

В идеале план действий должен быть разработан в течение первых шести месяцев — одного года с момента создания организации.Он разрабатывается после того, как вы определили видение, миссию, цели и стратегии вашей группы. Если вы разработаете план действий, когда будете готовы приступить к работе, он даст вам план для управления вашей организацией или инициативой.

Помните, однако, что план действий всегда находится в стадии разработки. Это не то, что вы можете написать, запереть в ящиках с файлами и забыть. Держите это на виду. Разместите это на видном месте. По мере того, как ваша организация меняется и растет, вы захотите постоянно (обычно ежемесячно) пересматривать свой план действий, чтобы он соответствовал меняющимся потребностям вашей группы и сообщества.

Как написать план действий

Определите, каких людей и секторов сообщества следует изменить и привлечь к поиску решений

Если вы использовали модель VMOSA (видение, миссия, цели, стратегии, планы действий), возможно, вы уже сделали это, когда принимали решение о целях своей группы. Опять же, постарайтесь быть инклюзивным. Большинство проблем здравоохранения и развития, которыми занимаются партнерства на уровне сообществ, относятся к сообществу и, следовательно, требуют решения в масштабах всего сообщества. Возможные секторы включают средства массовой информации, бизнес-сообщество, религиозные организации, школы, молодежные организации, организации социальных услуг, организации здравоохранения и другие.

Некоторые члены сообщества, которых вы можете попросить присоединиться к группе планирования действий, включают:

  • Влиятельные люди из всех частей общества, затронутых вашей инициативой (например, из церквей и синагог, школьной системы, правоохранительных органов и т. Д.)
  • Люди, непосредственно вовлеченные в проблему (e.g. местные старшеклассники и их родители могут быть вовлечены в планирование коалиции, пытающейся сократить злоупотребление подростками психоактивными веществами)
  • Члены общественных организаций
  • Члены различных этнических и культурных групп в вашем сообществе
  • Люди, которых вы знаете, которые интересуются проблемой или вопросом
  • Новички или молодые люди в сообществе, которые еще не участвуют

Давайте рассмотрим некоторых людей, которые были связаны с группой планирования вымышленной Коалиции по снижению рисков (RTR), которая надеется снизить уровень подростковой беременности. Некоторые из членов этой группы планирования включали учителей местной средней школы, местных подростков и их родителей, членов духовенства, консультантов и школьных медсестер, сотрудников окружного управления здравоохранения, а также членов молодежных организаций, сервисных агентств и др. организации, занимающиеся проблемами молодежи.

Созовите группу планирования в вашем районе, чтобы разработать план действий . Это может быть та же группа людей, которая работала с вами над определением стратегии и целей вашей группы.Если вы организовываете новую группу людей, постарайтесь сделать свой комитет по планированию как можно более разнообразным и инклюзивным. Ваша группа должна выглядеть как люди, которых проблема или проблема больше всего затрагивает.

Когда все будут присутствовать, пройдите по номеру вашей организации:

  • Видение
  • Миссия
  • Цели
  • Стратегии
  • Цели и агенты перемен (например, молодежь, родители и опекуны, духовенство)
  • Предлагаемые изменения для каждого сектора сообщества (e. г., школы, религиозная община, обслуживающие организации, организации здравоохранения, правительство)

Разработайте план действий, состоящий из шагов, направленных на все предлагаемые изменения. План должен быть полным, четким и актуальным. Кроме того, план действий должен включать информацию и идеи, которые вы уже собрали во время мозгового штурма о своих целях и стратегиях. Какие шаги вы должны предпринять, чтобы достичь своих целей, продолжая выполнять свое видение и миссию? Пришло время объединить все компоненты VMOSA.Хотя план может касаться общих целей, которые вы хотите достичь, действия помогут вам определить конкретные действия, которые вы предпримете, чтобы воплотить свое видение в реальность. Вот несколько рекомендаций, которым нужно следовать при написании действий.

Члены общественной инициативы захотят определить:

  • Какое действие или изменение произойдут
  • Кто будет выполнять
  • Когда это состоится и как долго
  • Какие ресурсы (т. е.е., деньги, персонал) необходимы для проведения размены
  • Связь (кто что должен знать)

Пример: Шаг действия Коалиции РТР (образец)

Одним из изменений в сообществе, которого добивалась эта коалиция для предотвращения подростковой беременности, было повышение осведомленности о контрацепции и нежелательной беременности в местной средней школе.

  • Какие действия или изменения будут происходить : Развешивание плакатов, дисплеев и другой информации о контрацепции и фактах о нежелательной беременности в коридорах местной средней школы.Плакаты и другая информация станут неотъемлемой частью школы. Плакаты и информация будут регулярно меняться по мере поступления новых материалов.
  • Кто будет его выполнять: Подкомитет, состоящий из родителей и опекунов, учителей, студентов и членов коалиции, будет нести ответственность за обслуживание дисплеев. Коалиция в целом будет работать над поиском финансирования для закупки материалов. Мария и Алекс из инициативной группы школы будут отвечать за исследование и заказ материалов.
  • Когда это состоится и как долго: Коалиция постарается, чтобы плакаты и дисплеи были видны в течение шести недель после принятия решения о шаге действий (19 февраля 2013 г.).
  • Какие ресурсы необходимы для выполнения этого шага: Коалиция обратится в школьный округ с просьбой о финансировании проекта. В противном случае группа будет искать финансирование из других источников, таких как фонды и местные предприятия, для финансирования программы.
  • Сообщение о шаге действия. Директору школы и руководству организации родителей и учителей следует предоставить информацию об этом запланированном изменении.

На заметку об этой части плана действий РТР:

  • Похоже, полный . Хотя этот шаг кажется полностью проработанным, нам нужно будет пересмотреть весь план действий, чтобы увидеть, включены ли все изменения сообщества и системы, которых следует добиваться.
  • Это прозрачный . Мы знаем, кто что и когда сделает.
  • Вроде ток . Нам нужно будет больше узнать о другой текущей работе (а также о новых возможностях и препятствиях), чтобы судить, актуальна ли эта часть плана действий.

Внимательно просмотрите свой завершенный план действий, чтобы убедиться в его полноте. Убедитесь, что каждое предлагаемое изменение поможет выполнить миссию вашей группы. Также убедитесь, что план действий в целом поможет вам выполнить вашу миссию; то есть убедитесь, что вы ничего не упускаете.

Завершить. Одна сложная часть (выяснение, что делать) закончена. Теперь возьми свой план и беги с ним! Помните правило 80-20: успешные усилия — это 80% выполнения запланированных действий и 20% планирования успеха.

Держите всех в курсе происходящего. Сообщите всем участникам, как их вклад был учтен. Никто не любит думать, что ее остроумие и мудрость игнорируются.

Следите за тем, что (и насколько хорошо) вы сделали. Всегда следите за тем, что на самом деле сделала группа. Если изменение сообщества (новая программа или политика) потребовало значительного времени или ресурсов, также неплохо оценить то, что вы сделали, формально или неформально.

Имейте в виду несколько вопросов как для себя, так и для других:

  • Делаем ли мы то, что обещали?
  • У нас это хорошо получается?
  • То, что мы делаем, продвигает миссию?

Вы можете ответить на эти вопросы неформально (задайте себе, поговорите с друзьями и другими людьми), а также формально, с помощью опросов и других методов оценки.

Отметьте хорошо выполненную работу! Празднуйте свои достижения; Вы и те, с кем работаете, заслуживаете этого. Празднование помогает поддерживать энтузиазм и интерес всех к работе, которую они делают.

После того, как вы написали свой план действий: заставить участников делать то, что они обещали

В каждой общественной организации это, несомненно, случалось: вы планируете и назначаете задачи, чтобы все, что вы планировали, было выполнено. Все соглашаются (может быть, даже предлагают) выполнить определенные задачи, и вы все уходите с большим чувством выполненного долга.Проблема? На следующей встрече ничего не было сделано. Что вы можете сделать, кроме того, что рвать волосы?

К счастью, вы можете попробовать несколько вещей. Это особенно сложно в случае с добровольцами, потому что вы не хотите слишком сильно полагаться на кого-то, кто с самого начала жертвует своим временем и энергией. Тем не менее, вы можете упростить участникам задачу (и сложнее избегать работы), не ведя себя как подлый сосед по улице. Вот некоторые из этих нежных напоминаний:

  • Регулярные телефонные звонки от сотрудников или преданных делу добровольцев, спрашивающих других, как они справляются со своими задачами. Это должен быть звонок поддержки, а не звонок «вы делаете то, что должны?». Звонящий может предложить эмоциональную поддержку: «Как дела?» а также посмотреть, нужна ли участнику группы какая-либо другая помощь. Подобный дружеский призыв можно рассматривать как полезный, он дает члену ощущение того, что он является очень важной частью группы, и служит отличным напоминанием о том, что он должен делать то, что он обещал.
  • Распространение плана действий в письменной форме среди всех участников с указанием имен, связанных с конкретными задачами.(Кроме того, это может быть прекрасное время, чтобы попросить обратную связь, прежде чем план станет «официальным».)
  • Обеспечение полноты, четкости и актуальности сроков (с указанием сроков).
  • На регулярных собраниях группы, таких как собрания комитета или собрания совета директоров, просите членов отчитываться о выполнении поставленных перед ними задач. Сделайте это регулярной частью собрания.
  • Отмечайте выполнение поставленных задач. Важно, чтобы выполнение чего-либо действительно что-то значило и признавалось группой в целом.

Регулярно выполняйте план действий. Вы просите участников быть подотчетными и делать дела на регулярной основе. Если они согласны, вы должны помочь им как можно лучше выполнить взятые на себя обязательства.

HRCT сундук | Справочная статья по радиологии

КТ с высоким разрешением (HRCT) грудной клетки , также называемая HRCT грудной клетки или HRCT легких , относится к методике компьютерной томографии, при которой изображения грудной клетки получают и отправляют -обработанный в алгоритме высокочастотной реконструкции.Этот метод позволяет получать изображения с изысканной детализацией легких, которые идеально подходят для оценки диффузного интерстициального заболевания легких. Полный протокол HRCT обычно включает дополнительные сборы:

HRCT особенно полезен при оценке диффузных состояний легких с вовлечением интерстиция, например:

HRCT может использоваться для оценки степени заболевания, мониторинга реакции на лечение и выбора участков биопсии в постановка диффузного интерстициального заболевания легких. Неинформированные специалисты обычно запрашивают КТ грудной клетки «высокого разрешения», полагая, что КТВР представляет собой лучшую версию «стандартной» компьютерной томографии грудной клетки, однако это заблуждение.

Последовательное получение изображений с интервалом

HRCT исторически разрабатывалась для улучшения пространственного разрешения в эпоху сканеров первого поколения (метод последовательного получения изображений), а позже использовалась с аналогичными параметрами в сканерах второго поколения (спиральные сканеры). Сегодня этот метод все еще используется некоторыми учреждениями, даже при сканировании в многодетекторном рядном компьютерном томографе (MDCT), как способ уменьшить облучение пациента. Кроме того, при переходе к полному протоколу HRCT с тремя сборами, дополнительное изображение выдоха и изображения лежа на животе может быть выполнено с последовательным интервалом в дополнение к объемному сканированию на вдохе.

  • тонкие срезы размером <1,5 мм (исходная методика ВРКТ, применяемая в сканерах первого и второго поколения, из-за аппаратных ограничений, имела более толстые срезы, определяемые как <3,0 мм)
  • интервал 1-2 см между двумя наборами изображений
  • доза облучения пациента меньше по сравнению с объемной визуализацией
Измерение объема

В настоящее время MDCT используются повсеместно, и поэтому объемные тонкие срезы стали стандартом. Объемная визуализация с более тонкими срезами позволяет выявить большую степень патологии, а также позволяет реконструировать в любой плоскости.

  • тонкие срезы размером <1,5 мм: обычно 1 мм, но в диапазоне от 0,625 до 1,25 мм
  • постобработка: высокочастотная пространственная частота или алгоритм повышения резкости (алгоритм кости)
    • уменьшает сглаживание изображения
    • увеличивает пространственное разрешение: структуры становятся более резкими и детализированными.
    • полосатых артефактов более очевидны
  • Доза облучения пациента выше
Основные технические протоколы
  • толщина среза: 0.625-1,25 мм
  • время сканирования: 0,5-1 секунда
  • кВ: 120
  • мАс: 100-200
  • коллимация: 1,5-3 мм
  • Размер матрицы : 768 x 768 или самый большой из имеющихся
  • FOV: 35 см
  • Алгоритм реконструкции : высокая пространственная частота
  • Окно : Окно легкого
  • Положение пациента: лежа на спине (обычно) или лежа (при подозрении на ВЗЛ)
  • уровень вдоха: полный вдох (обычно рекомендуется) экспираторное сканирование HRCT у пациентов с обструктивными заболеваниями легких
Снижение дозы облучения

Протоколы КТ с более низкой дозой облучения можно использовать при последующем сканировании известных или молодых пациентов по цене несколько более низкого качества изображения. Большинство пациентов проходят множество исследований для наблюдения за их заболеванием; следовательно, это может привести к значительному снижению дозы облучения. Обычно для этого применяются следующие методы:

  • более низкий мАс (~ 40 мА)
  • последовательный сбор данных с интервалом
    • обычно применяется для дополнительного выдоха и сканирования лежа
    • Некоторые учреждения также применяют эту технику для полного сканирования вдоха у пациентов, которые проходят последующее визуализационное наблюдение
История и этимология

Термин «компьютерная томография высокого разрешения» впервые был использован Todo et al.в 1982 г. Он также описал полезность томографии HRCT при легочных заболеваниях. В 1985 г. Naidich et al., Nakata et al. И Zerhouni et al. описал фундаментальную технику HRCT и опубликовал первый отчет по HRCT.

Регуляция рекрутирования ретромеров в эндосомы за счет последовательного действия Rab5 и Rab7

Abstract

Ретромерный комплекс обеспечивает ретроградный транспорт трансмембранного груза от эндосом к сети транс-Гольджи (TGN). Ретромер млекопитающих состоит из димера сортирующего нексина (SNX), который связывается с фосфатидилинозитол-3-фосфат-обогащенными эндосомными мембранами, и тримером 26/29/35, который участвует в распознавании грузов. Димер SNX млекопитающих необходим, но недостаточен для рекрутирования тримера Vps26 / 29/35 на мембраны. В этом исследовании мы демонстрируем, что гуанозинтрифосфатаза Rab7 способствует этому привлечению. Тример Vps26 / 29/35 специфически связывается с Rab7-гуанозинтрифосфатом (GTP) и локализуется в Rab7-содержащих эндосомных доменах.Вмешательство в функцию Rab7 вызывает диссоциацию тримера Vps26 / 29/35, но не димера SNX от мембран. Это блокирует извлечение маннозо-6-фосфатных рецепторов в TGN и нарушает сортировку катепсина D. Rab5-GTP не связывается с тримером Vps26 / 29/35, но нарушение функции Rab5 вызывает диссоциацию компонентов SNX и Vps26 / 29/35 от мембран за счет ингибирования пути с участием фосфатидилинозитол-3-киназы. Эти находки демонстрируют, что Rab5 и Rab7 действуют согласованно, чтобы регулировать рекрутирование ретромеров в эндосомы.

Введение

Ретромер представляет собой филогенетически консервативный мультисубъединичный комплекс, который обеспечивает ретроградный транспорт трансмембранного груза от эндосом к TGN (Seaman, 2005; Bonifacino and Rojas, 2006; Bonifacino and Hurley, 2008). Наиболее охарактеризованным грузом для ретромера млекопитающих является катионнезависимый маннозо-6-фосфатный рецептор (MPR [CI-MPR]), один из двух рецепторов внутриклеточной сортировки, который участвует в доставке кислых гидролаз в лизосомы (Kornfeld, 1992).CI-MPR связывает вновь синтезированные кислотные гидролазы в TGN и переносит их в покрытых клатрином везикулах к эндосомам, где гидролазы высвобождаются для возможного транспорта в лизосомы. Ретромер извлекает незанятые рецепторы в TGN, где они участвуют в дальнейших циклах сортировки кислотных гидролаз. Истощение ретромерных субъединиц с помощью РНКи препятствует этому извлечению, что приводит к перенаправлению рецепторов к лизосомам и, как следствие, утечке вновь синтезированных кислотных гидролаз во внеклеточную среду (Arighi et al. , 2004; Карлтон и др., 2004; Моряк, 2004 г .; Рохас и др., 2007).

Ретромер млекопитающих состоит из двух биогенетически различных субкомплексов плотно собранных субъединиц: димера, состоящего из еще не определенной комбинации сортирующего нексина 1 (SNX1), SNX2, SNX5 и SNX6 (именуемого здесь субкомплексом SNX) и гетеротример, состоящий из сортировки вакуолярных белков 26 (Vps26), Vps29 и Vps35 (субкомплекс Vps; Haft et al., 2000; Collins et al., 2005; Hierro et al., 2007; Rojas et al., 2007). Недавние исследования начали проливать свет на структуру и функцию различных ретромерных субъединиц. SNX1, SNX2, SNX5 и SNX6 являются членами семейства белков SNX (Carlton and Cullen, 2005; Cullen, 2008), которые характеризуются наличием домена гомологии phox, который связывает фосфатидилинозитол-3-фосфат (PI3P) и другие фосфоинозитиды (Burda et al., 2002; Cozier et al., 2002; Zhong et al., 2002; Carlton et al., 2005a) и домен Bin-Amphiphysin-Rvs, который опосредует димеризацию и связывание с сильно изогнутыми мембранами (Carlton et al. al., 2004; Карлтон и Каллен, 2005). Эти свойства наделяют субкомплекс SNX способностью связываться с эндосомными мембранами независимо от субкомплекса Vps (Rojas et al., 2007).

Подкомплекс Vps, как недавно было показано, состоит из филамента длиной 210 ​​Å, содержащего по одной копии каждого из Vps26, Vps29 и Vps35 (Hierro et al., 2007). На одном конце этого филамента находится Vps26, белок, имеющий структурное сходство с семейством аррестиновых адаптеров сортировки (Shi et al., 2006). Другой конец содержит Vps29 и С-концевую половину Vps35 (Hierro et al., 2007). Vps29 имеет складку металлофосфоэстеразы (Collins et al., 2005; Wang et al., 2005), но небольшую ферментативную активность или ее отсутствие (Collins et al., 2005; Hierro et al., 2007; но см. Damen et al., 2006) вызвано окклюзией предполагаемого активного сайта С-концевой половиной Vps35 и заменой ключевого каталитического остатка His на остаток Phe в предполагаемом активном центре (Hierro et al., 2007). Этот последний домен состоит из подковообразного α-спирального соленоида, напоминающего стволовый домен адаптинов (Hierro et al. , 2007). Оба конца филамента соединены N-концевой половиной Vps35 (Hierro et al., 2007). Молекулярная электронная микроскопия этого домена показала, что он состоит из протяженного α-спирального соленоида (Hierro et al., 2007). Несколько линий доказательств указывают на то, что субкомплекс Vps функционирует, чтобы распознавать сигналы сортировки в цитозольных хвостах ретроградных грузов, таких как MPRs (Nothwehr et al., 1999, 2000; Arighi et al., 2004; Seaman, 2007). В частности, предполагается, что субъединица Vps35 взаимодействует с сигналами ретроградной сортировки (Nothwehr et al., 2000; Arighi et al., 2004), хотя окончательные структурные доказательства таких взаимодействий все еще отсутствуют.

Подкомплекс Vps, по-видимому, не способен напрямую взаимодействовать с мембранными липидами (Collins et al., 2005; Shi et al., 2006). Вместо этого ему необходим субкомплекс SNX для рекрутирования на мембраны (Rojas et al., 2007). В самом деле, истощение субъединиц субкомплекса SNX с помощью RNAi приводит к диссоциации субкомплекса Vps от мембран (Rojas et al. , 2007). Было высказано предположение, что взаимодействия между двумя подкомплексами происходят между относительно неструктурированными N-концевыми расширениями SNX1 и SNX2 (Gullapalli et al., 2004) и несколько сайтов на Vps29 и Vps35 (Haft et al., 2000; Collins et al., 2005). Однако в клетках млекопитающих субкомплексы SNX и Vps существуют как отдельные объекты в цитозольных и детергентных экстрактах клеток (Rojas et al., 2007) и, по-видимому, не способны связываться друг с другом in vitro (Collins et al., 2005; Рохас и др., 2007). Фактически, единственное свидетельство связывания этих субкомплексов происходит из слабых взаимодействий, обнаруженных в дрожжевой двугибридной системе (Haft et al., 2000; Rojas et al., 2007) и соосаждение сверхэкспрессированных белков (Gullapalli et al., 2004). Это указывает на то, что др., Еще не идентифицированные факторы могут вносить вклад в рекрутирование субкомплекса Vps на мембраны.

В этом исследовании мы сообщаем, что малая GTPase Rab7 является регулятором рекрутирования субкомплекса Vps на мембраны. Мы обнаружили эту роль в ходе экспериментов по аффинной очистке, направленных на идентификацию белков, которые взаимодействуют с эндосомными Rab. Иммуноблот-анализ выявил присутствие ретромерного субкомплекса Vps среди белков, элюированных из колонки с GST-Rab7, нагруженной негидролизуемым аналогом GTP гуанилил-5′-имидодифосфатом (GMP-PNP).Это взаимодействие было зависимым от гуанинового нуклеотида и специфичным для Rab7 среди других эндосомных Rab. Кроме того, эксперименты с GST-pull-down с очищенными рекомбинантными белками показали, что взаимодействие между Rab7 и субкомплексом Vps является прямым. Далее мы продемонстрировали, что субкомплекс Vps локализуется в эндосомальных доменах, которые содержат Rab7, и что истощение или доминантно-негативное вмешательство Rab7 вызывает диссоциацию субкомплекса Vps от мембран, ингибирование ретроградного транспорта CI-MPR и пропуск кислотной гидролазы катепсина. Д.Кроме того, мы обнаружили, что Rab5 косвенно способствует привлечению ретромера к мембранам, скорее всего, посредством активации пути, включающего Rab5 эффекторную фосфатидилинозитол 3-киназу (PI3K) и субкомплекс SNX. Т.о., и Rab5, и Rab7 действуют последовательно, чтобы обеспечить рекрутирование ретромеров в эндосомы и его функцию в ретроградном движении.

Результаты

Гуаниннуклеотидзависимое взаимодействие Rab7 с ретромерным субкомплексом Vps

В ходе исследований, направленных на идентификацию эффекторов Rab с помощью аффинной очистки с последующей масс-спектрометрией и / или иммуноблот-анализом для белков-кандидатов, мы обнаружили, что три субъединицы субкомплекса ретромеров Vps млекопитающих, Vps26, Vps29 и Vps35, связанные с GST-Rab7 в присутствии негидролизуемого аналога GTP, GMP-PNP ().Это связывание было зависимым от гуанинового нуклеотида, так как оно не обнаруживалось в присутствии GDP (). Кроме того, он был специфичным для Rab7, потому что субъединицы субкомплекса Vps не связывались с GST-Rab4a, -Rab5a, -Rab9a, -Rab27a или -Rab37a, причем все они были загружены GMP-PNP (). В отличие от субкомплекса Vps, SNX1 и SNX2 не связывались с загруженным GMP-PNP GST-Rab7 (неопубликованные данные).

Привязка ретромерного подкомплекса Vps к активному Rab7. (A) Экстракт микросом Triton X-100 инкубировали с эквивалентными количествами указанных белков GST-Rab, предварительно загруженных GMP-PNP или GDP.Связанные белки элюировали в буфере для образцов Лэммли и анализировали с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга (IB) с антителами к субъединицам Vps26, Vps29 или Vps35 ретромера (вверху). Первая полоса представляет 20% ввода. Приблизительные молекулярные массы различных белков указаны в килодальтонах. Звездочки указывают на загрязняющие белки, обнаруженные во всех препаратах GST. (B) Клетки COS-7 трансфицировали плазмидами, кодирующими myc-Vps26, FLAG-Vps29 и (HA) 3 -Vps35, либо индивидуально, либо в комбинациях, указанных на рисунке.Лизаты этих клеток инкубировали с шариками, связанными с GST-Rab7-GMP-PNP. Входящие и связанные белки анализировали с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга с антителами к тегам myc, FLAG и HA (вверху). (C) Иммобилизованный GST, GST-Rab7 или GST-Rab9a, предварительно загруженный GDP или GTPγS, инкубировали с рекомбинантным тримером Vps26 / 29/35. Связанные белки элюировали и анализировали с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга с антителами к Vps29, Vps26 и Vps35 (вверху). Ввод составляет 1,8% от общего тримерного рекомбинантного Vps26 / 29/35, используемого на реакцию.На нижних панелях показано окрашивание белков GST, использованных в этих экспериментах, с помощью SDS-PAGE / кумасси синим.

Чтобы дополнительно охарактеризовать это взаимодействие, мы выполнили GST извлечения экстрактов из клеток COS-7, экспрессирующих различные комбинации меченных эпитопом форм Vps26, Vps29 и Vps35. Было обнаружено, что небольшие количества HA-Vps35 связываются с GST-Rab7-GMP-PNP при экспрессии только HA-Vps35 или в комбинации с myc-Vps26 или FLAG-Vps29 (). Однако гораздо большие количества HA-Vps35 вместе с myc-Vps26 или FLAG-Vps29 были извлечены из клеток, коэкспрессирующих все три субъединицы ().Ни один из этих видов не связывается с GST или GST-Rab4a-GMP-PNP (неопубликованные данные), что указывает на то, что вышеупомянутые выпадения были специфичными. Эти результаты показали, что Vps35 может быть субъединицей, которая опосредует связывание с Rab7. Однако для оптимального связывания требуется экспрессия всех трех субъединиц, вероятно, из-за необходимости сборки субкомплекса Vps для правильной укладки Vps35, как ранее было обнаружено для рекомбинантных белков (Hierro et al., 2007).

Чтобы определить, было ли взаимодействие Rab7 с тримером Vps26 / 29/35 прямым, мы выполнили анализ GST pull-down со всеми очищенными рекомбинантными белками.Мы наблюдали, что GST-Rab7, но не GST или GST-Rab9a, разрушает рекомбинантный тример Vps26 / 29/35 в присутствии другого негидролизуемого аналога GTP, GTPγS, но не в присутствии GDP (). Эти находки продемонстрировали, что взаимодействие Rab7-Vps26 / 29/35 является прямым и GTP-зависимым, таким образом указывая на то, что ретромер является истинным эффектором Rab7.

Совместная локализация Rab7 с ретромером

Специфическое гуанин-нуклеотид-зависимое взаимодействие Rab7 с ретромером Vps субкомплексом побудило нас исследовать с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии, колокализуются ли эти белки внутри клеток.Поскольку иммуноокрашивание клеток HeLa на эндогенный Rab7 давало очень слабый сигнал, мы трансфицировали клетки плазмидой, кодирующей Rab7, меченный GFP. Клетки иммуноокрашивали на эндогенный ретромер с использованием антитела к Vps26 и исследовали с помощью конфокальной микроскопии. Используя эту методологию, мы наблюдали значительную совместную локализацию (48 ± 10%, n = 24 клетки) эндогенного Vps26 с GFP-Rab7 на везикулярных структурах, разбросанных по цитоплазме (). Мы также наблюдали локализацию (38 ± 9%, n = 24 клетки) эндогенных Vps26 в GFP-Rab5a-позитивных структурах (), как описано ранее (Arighi et al., 2004; Моряк, 2004 г.). Аналогичные результаты были получены для совместной локализации эндогенного SNX1 с GFP-Rab7 и GFP-Rab5a (неопубликованные данные).

Иммунофлуоресцентная микроскопия, показывающая локализацию Vps26 в Rab7- и Rab5-положительных эндосомах. Клетки HeLa трансфицировали плазмидами, кодирующими GFP-Rab7 (A – C) или GFP-Rab5a (D – F), фиксировали, пермеабилизировали и иммуноокрашивали кроличьими поликлональными антителами к Vps26 с последующим введением конъюгированных с Alexa Fluor 594 ослиных анти-кроличьих IgG. . Клетки исследовали с помощью конфокальной микроскопии.(A и D) Флуоресценция GFP, зеленый канал. (B и E) Флуоресценция Alexa Fluor 594, красный канал. (C и F) Объединенные изображения; желтый указывает на совместную локализацию. Стрелки указывают примеры очагов, в которых колокализуются белки. Пруток, 10 мкм.

Чтобы оценить динамику ассоциации ретромера с Rab7- и Rab5-содержащими эндосомами в живых клетках, мы провели покадровую флуоресцентную микроскопию клеток, трансфицированных плазмидами, кодирующими Vps29-YFP и CFP-Rab7 или CFP-Rab5a (и видео 1–6, доступно по адресу http: // www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200804048/DC1). В соответствии с вышеупомянутыми экспериментами по иммунофлуоресцентной микроскопии мы визуализировали многочисленные эндосомальные везикулы, которые содержали как Vps29-YFP, так и CFP-Rab7 (). Более того, Vps29-YFP почти всегда обнаруживался на доменах эндосомных везикул, которые также содержали CFP-Rab7 (). Эти домены были очень динамичными и подвергались агрегации и фрагментации, но Vps29-YFP оставался совпадающим с CFP-Rab7 на протяжении всех этих изменений. Исключением был набор длинных канальцев, которые исходили и в конечном итоге отделялись от эндосом; эти канальцы неизменно содержали Vps29-YFP (зеленые стрелки), но не CFP-Rab7 (красные стрелки).Однако канальцы, по-видимому, возникли из эндосомных очагов, где CFP-Rab7 был наиболее сконцентрирован ().

Визуализация живых клеток, показывающая локализацию Vps29-YFP в эндосомальных доменах, которые содержат CFP-Rab7, но не CFP-Rab5a. Клетки HeLa, котрансфицированные плазмидами, кодирующими Vps29-YFP (зеленый) и либо CFP-Rab7 (A – C), либо CFP-Rab5a (D – F; красный), получали с помощью покадровой флуоресцентной микроскопии. Изображения на этом рисунке были взяты из видео 1–6 (доступно по адресу http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200804048 / DC1). Объединение зеленого и красного изображений сгенерировало третье изображение в A и D и изображения в нижних рядах B, C, E и F. Желтый цвет указывает на перекрывающуюся локализацию зеленых и красных объектов. Примеры колокализации обозначены желтыми стрелками. Изображения в A и серии в B и C показывают локализацию Vps29-YFP в доменах, которые содержат CFP-Rab7 (обозначены зелеными и красными стрелками на изображениях отдельных каналов или желтыми стрелками на изображениях слияния). В серии C показана эндосома, в которой Vps29-YFP (зеленые стрелки) обогащен на отделяющемся канальце, не содержащем CFP-Rab7 (красные стрелки).Изображения в D и серии в E и F показывают, что Vps29-YFP (зеленые стрелки) и CFP-Rab5a (красные стрелки) локализованы в разных эндосомных доменах. Ряд в F показывает Vps29-YFP-положительную эндосому с небольшим количеством CFP-Rab5 или без него (зеленые стрелки). Время после начала визуализации (в секундах) показано в нижнем левом углу каждой панели. Штанги: (A и D) 5 мкм; (B, C, E и F) 2 мкм.

Vps29-YFP также был обнаружен в ассоциации с эндосомальными пузырьками, содержащими CFP-Rab5a (). Однако эти два белка в значительной степени были разделены на разные домены.Эти домены также были очень подвижными и претерпевали изменения с течением времени, но лишь изредка Vps29-YFP совпадал с CFP-Rab5a (). Vps29-YFP-содержащие канальцы действительно формировались из CFP-Rab5a-позитивных эндосом, но сами канальцы лишены CFP-Rab5a (Video 4).

Хотя и Vps29-YFP, и CFP-Rab7 украшали ограничивающую мембрану эндосомных пузырьков, они чаще всего концентрировались в фокусах, которые, по-видимому, выпирали из мембраны (). Для изучения ультраструктуры этих очагов была проведена иммуноэлектронная микроскопия.Клетки HeLa трансфицировали плазмидой, кодирующей GFP-Rab7, а затем дважды иммуно-золотым метили для эндогенных Vps26 (15-нм золото) и GFP (10-нм золото;). Оба белка были обнаружены на множестве зачатков и канальцев, которые исходили из вакуолярной части эндосом () и появлялись в виде скопления канальцев на внутренних участках (). Эти структуры характерны для канальцевой эндосомной сети (Bonifacino and Rojas, 2006), которая опосредует ретромер-зависимую сортировку MPR в TGN, вероятно, через длинные канальцы, отходящие от эндосом в экспериментах по визуализации живых клеток (; Zhong et al., 2002; Ариги и др., 2004; Карлтон и др., 2004, 2005b; Popoff et al., 2007).

Локализация GFP-Rab7 и Vps26 с помощью иммуноэлектронной микроскопии. Ультратонкие криосрезы клеток HeLa, экспрессирующих GFP-Rab7 дикого типа, были помечены иммунным золотом антителами к GFP (частицы золота 10 нм) и Vps26 (частицы золота 15 нм). Стрелки указывают на присутствие GFP-Rab7 на зачатках, прилегающих к вакуолярной части эндосом (A), и на канальцах (B). Канальцы и почки также помечены для Vps26. Барс, 200 нм.

Необходимость Rab7 для ассоциации ретромеров с мембранами

Взаимодействие и совместная локализация Rab7 с субкомплексом ретромеров Vps указывает на вероятную функциональную взаимосвязь между этими белками. Rab GTPases, такие как Rab7, совершают цикл между GTP-связанными, мембраносвязанными и GDP-связанными состояниями цитозоля и при этом функционируют, регулируя рекрутирование эффекторных белков на мембраны. Чтобы определить, играет ли Rab7 роль в привлечении ретромеров к мембранам, мы использовали RNAi для истощения Rab7 из клеток HeLa ().Иммунофлуоресцентная микроскопия показала, что это истощение не влияет на распределение комплексов адаптерных белков (AP) AP-3 () и AP-1 (), которые связаны со специфическими доменами эндосомальной сети канальцев (Futter et al., 1998 ; Peden et al., 2004; Theos et al., 2005), но вызвали практически полную потерю эндосомального окрашивания для Vps26 (). Эта потеря была вызвана диссоциацией от мембран, а не деградацией, потому что уровни белка Vps26 не изменились из-за истощения Rab7 ().Эффекты истощения Rab7 на локализацию Vps26 были специфическими, потому что комбинированное истощение также эндосомных паралогов Rab4a и Rab4b () не изменяло распределение Vps26 (). Более того, трансфекция клеток, истощенных по Rab7, плазмидой, кодирующей устойчивую к РНКи формой GFP-Rab7 (, стрелки), но не плазмидой, кодирующей GFP (), частично восстанавливала ассоциацию Vps26 с эндосомами. Интересно, что SNX1 () и SNX2 () сохраняют свою ассоциацию с эндосомами в Rab7-истощенных клетках, хотя эндосомы кажутся увеличенными и более рассредоточенными.Эти наблюдения подчеркнули другое важное различие в свойствах субкомплексов Vps и SNX ретромера в том, что только субкомплекс Vps нуждается в Rab7 для ассоциации с эндосомами.

РНКи-опосредованное истощение Rab7 вызывает диссоциацию Vps26 от эндосом. (A) Клетки HeLa обрабатывали дважды с 24-часовыми интервалами контрольной, неактивной миРНК или миРНК для Rab7, Rab4 (нацеленные как на изоформы a, так и на b) или Vps26. Экстракты клеток анализировали с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга с использованием антител к Rab7, Rab4, Vps26 или актину (контроль нагрузки), как показано на рисунке.(B – Q) Клетки HeLa, обработанные, как в A, с контролем (B, C, F, G, J, K, N и O) или миРНК Rab7 (D, E, H, I, L, M, P и Q) были иммуноокрашены на Vps26 (B, D, F, H, J, L, N и P) и AP-3 (C и E), AP-1 (G и I), SNX1 (K и M), и SNX2 (O и Q) с использованием кроличьих поликлональных антител к Vps26 и мышиных моноклональных антител к AP-3 – δ, AP-1 – γ1, SNX1 или SNX2, с последующим использованием конъюгированных с Alexa Fluor 594 ослиных анти кроличьих IgG и Alexa Fluor 488 –Конъюгированные ослиные антимышиные IgG. Изображения были получены с помощью эпифлуоресцентной микроскопии.Пруток, 10 мкм.

Специфичность и восстановление диссоциации Vps26 от мембран в клетках, обработанных РНКи. Клетки HeLa обрабатывали дважды с 24-часовыми интервалами неактивной миРНК (контроль; A) или миРНК как для Rab4a, так и для Rab4b (B) или для Rab7 (C – F). Через 36 часов после второй обработки siRNA для Rab7 некоторые клетки трансфицировали плазмидами, кодирующими RNAi-устойчивый (т.е. собачий) GFP-Rab7 (C и E) или GFP (D и F). Примеры клеток, экспрессирующих GFP или собачий GFP-Rab7, указаны стрелками.Распределение Vps26 (A – D) в клетках оценивали с помощью непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием кроличьих поликлональных антител к Vps26 с последующим использованием конъюгированного с Alexa Fluor 594 ослиного антикроличьего IgG. Изображения были получены с помощью эпифлуоресцентной микроскопии. Пруток, 10 мкм.

Доминантно-отрицательная сверхэкспрессия показывает роль Rab5 в рекрутировании ретромеров на мембраны

В дополнение к РНКи, другим широко используемым подходом для проверки зависимости клеточных процессов от малых GTPases является сверхэкспрессия доминантно-отрицательных GDP-заблокированных форм белки.Использование этого подхода показало, что доминантно-отрицательный GFP-Rab7-T22N (, стрелки), но не доминантно-отрицательный GFP-Rab4a-S22N (, стрелки), вызывает диссоциацию Vps26 от эндосом (до 26% уровней в контрольных клетках; рис. S1 E, доступно по адресу http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200804048/DC1). Напротив, на ассоциацию SNX1 с эндосомами не влияла избыточная экспрессия GFP-Rab7-T22N, хотя внешний вид эндосом был изменен (, стрелки). Эти результаты соответствовали результатам, полученным с использованием РНКи (и).Доминантно-негативный подход был особенно полезен для оценки роли Rab5 в рекрутировании ретромеров, потому что существование трех паралогов Rab5 (a, b и c; Huang et al., 2004) делает RNAi непрактичным. Неожиданно мы обнаружили, что избыточная экспрессия доминантно-отрицательного GFP-Rab5a-S34N приводит к диссоциации Vps26 из эндосом (до 36% уровней в контрольных клетках; стрелки; и фиг. S1 E). В противоположность истощению Rab7 или доминантно-отрицательной сверхэкспрессии, однако, доминантно-отрицательная сверхэкспрессия GFP-Rab5a-S34N также вызывает диссоциацию SNX1 от эндосом (, стрелки).Поскольку Rab5 не взаимодействует с ретромером (), эти результаты, вероятно, связаны с тем фактом, что Rab5 активирует эндосомный PI3K (Christoforidis et al., 1999b), который продуцирует PI3P, важный кофактор ассоциации SNX1 и SNX2 с мембранами (Cozier et al. , 2002; Карлтон и др., 2004). В свою очередь, SNX1 и SNX2 делают возможным рекрутирование ретромерного субкомплекса Vps на мембраны (Rojas et al., 2007).

Доминантно-отрицательные формы Rab5 или Rab7 изменяют ассоциацию ретромера с эндосомами. (A – I) клетки HeLa трансфицировали плазмидами, кодирующими GFP-Rab4a – S22N (A – C), GFP-Rab5a – S34N (D – F), GFP-Rab7 – T22N (G – I) или GFP-Rab7. –Q67L. Через 8 часов после трансфекции клеточное распределение Vps26 (B, E и H) и SNX1 (C, F и I) было проанализировано с помощью непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием кроличьих поликлональных антител к Vps26 и мышиных моноклональных антител к SNX1 с последующим анализом Alexa. Конъюгированные с Fluor 594 ослиные анти-кроличьи IgG и Alexa Fluor 647-конъюгированные ослиные антимышиные IgG. (J – L) Клетки обрабатывали 200 нМ вортманнина в ДМСО в течение 30 минут при 37 ° C, а распределение Vps26 и SNX1 анализировали непрямым иммунофлуоресцентным окрашиванием с использованием соответствующих первичных антител и флуоресцентно меченных вторичных антител.Изображения были получены с помощью эпифлуоресцентной микроскопии. Стрелки указывают на клетки, экспрессирующие GFP-Rab. Пруток, 10 мкм.

Чтобы проанализировать взаимодействие между PI3K и Rab7 в регуляции рекрутирования ретромеров на мембраны, мы сверхэкспрессировали конститутивно активную GTP-заблокированную форму Rab7 (GFP-Rab7-Q67L) и исследовали эффекты добавления ингибитора PI3K вортманнина. В контрольных клетках добавление вортманнина вызывало диссоциацию как Vps26 (до 28% от уровней в необработанных клетках), так и SNX1 с мембран (; и рис.S1), как сообщалось ранее (Arighi et al., 2004; Rojas et al., 2007). Однако в клетках, сверхэкспрессирующих GFP-Rab7-Q67L, Vps26 (, стрелки; и фиг. S1), но не SNX1 (, стрелки; и фиг. S1), оставались частично связанными с мембранами в присутствии вортманнина (76% уровней в необработанных ячеек; Рис. S1 E). Эти результаты показали, что нефизиологически высокий уровень активности GFP-Rab7-Q67L может перекрывать отсутствие PI3P для рекрутирования ретромерного субкомплекса Vps, но не субкомплекса SNX в эндосомы.Т.о., взаимодействие с Rab7 и регуляция с помощью Rab5 посредством пути PI3K – PI3P – SNX1 / 2 взаимодействуют, чтобы рекрутировать ретромерный субкомплекс Vps на мембраны.

Участие Rab7 в транспортировке MPRs и их груза кислой гидролазы

Поскольку ретромер функционирует в ретроградном транспорте CI-MPR от эндосом к TGN, мы ожидали, что вмешательство Rab7 изменит транспортировку рецепторов. В самом деле, мы обнаружили, что стационарное распределение CI-MPR изменяется от соседнего кластера маленьких пузырьков () к более диспергированному скоплению больших пузырьков () после истощения Rab7 с помощью RNAi.Инкубация контрольных живых клеток с антителом к ​​CI-MPR при 37 ° C показала, что рецепторы клеточной поверхности были интернализованы и подверглись ретроградному транспорту для достижения распределения, аналогичного таковому в устойчивом состоянии (т.е. смесь эндосом и TGN; Seaman , 2004; Рохас и др., 2007). Однако в клетках, истощенных по Rab7, интернализованный CI-MPR оставался захваченным в увеличенных периферических эндосомах (). Эти эндосомы содержали рецептор трансферрина (TfR;), что позволяет идентифицировать их как ранние эндосомы. В отличие от истощения ретромеров (Arighi et al., 2004; Rojas et al., 2007), однако истощение Rab7 не влияет на уровни CI-MPR (), указывая тем самым, что рецептор не доставляется в лизосомы для деградации, а накапливается в ранних эндосомах.

Истощение Rab7 блокирует транспорт CI-MPR от эндосом к TGN. Клетки HeLa обрабатывали дважды с 24-часовыми интервалами неактивной миРНК (контроль; A, C, E и G) или миРНК для Rab7 (B, D, F и H – N). Через 48 часов после обработки установившееся распределение CI-MPR (A – D) оценивали с помощью непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания фиксированных клеток с использованием кроличьих поликлональных антител к цитозольному хвосту CI-MPR с последующим введением конъюгированных с Alexa Fluor 488 ослиных анти– кроличий IgG.C и D соответствуют изображениям с большим увеличением CI-MPR-положительных структур из контрольных или истощенных по Rab7 клеток, соответственно. Живые контрольные клетки (E и G) или клетки с истощенным Rab7 (F и H – N) инкубировали с антителом к ​​люминальному домену CI-MPR в течение 2 часов при 37 ° C. Клетки промывали, фиксировали, пермеабилизировали и окрашивали конъюгированным с Alexa Fluor 488 ослиным антимышиным IgG для обнаружения интернализованных антител к CI-MPR (E – H, J и M). G и H показывают изображения с большим увеличением для контрольных (E) или истощенных по Rab7 клеток (F), соответственно.Клетки в I – N дополнительно окрашивали кроличьими поликлональными антителами к TfR (I – K) или гигантину (L – N), а затем с помощью Alexa Fluor 594, конъюгированных с ослиным анти-кроличьим IgG. Изображения в A – H были получены с помощью эпифлуоресцентного микроскопа, а изображения в I – N — с помощью конфокального микроскопа. (K и N) Для объединенных изображений желтый цвет означает совместную локализацию. Стрелки в I – K указывают примеры очагов, в которых белки колокализуются. (O) Экстракты клеток HeLa, обработанные миРНК к белкам, указанным вверху, были проанализированы с помощью SDS-PAGE в градиенте 4–20% акриламида и иммуноблоттинга (IB) с антителами к белкам, указанным справа.Загружали равные количества общего белка. Планки: (A, B, E и F) 15 мкм; (C, D, G и H) 1,5 мкм; (I – N) 10 мкм.

Захват CI-MPR в ранних эндосомах должен приводить к его истощению из TGN, что приводит к неправильной сортировке вновь синтезированных кислотных гидролаз. Иммуноблот-анализ одной такой гидролазы, катепсина D, показал, что это действительно так. В контрольных клетках большая часть катепсина D находилась в зрелой форме 31 кДа с небольшими количествами предшественника 53 кДа и промежуточных форм 47 кДа ().Только следовые количества формы-предшественника секретировались в среду контрольных клеток (). Этот эффективный процессинг и внутриклеточное удержание катепсина D отражает целостность нормального механизма доставки фермента от TGN на всем пути к лизосомам. Истощение Rab7, как и истощение Vps26 (Seaman, 2004), вызывало значительное увеличение количества предшественников и промежуточных форм, присутствующих в клетках, а также предшественников, секретируемых в среду (), что указывало на нарушение транспорта фермента в лизосомы.Эти результаты согласуются с ролью Rab7 в регуляции функции ретромеров и сортировки CI-MPR в эндосомах.

Истощение Rab7 нарушает процессинг катепсина D. Клетки HeLa обрабатывали дважды с 24-часовыми интервалами неактивными миРНК (контроль; дорожка 1) или миРНК для белков, указанных вверху. Через 24 часа после второго раунда обработки миРНК клетки промывали PBS и инкубировали в бессывороточной культуральной среде в течение 24 часов. Среду собирали и осаждали трихлоруксусной кислотой, и полученные осадки растворяли в буфере для образцов Лэммли.Экстракты клеток и образцы сред анализировали с помощью SDS-PAGE в градиенте 4-20% акриламида и иммуноблоттинга с кроличьими поликлональными антителами к катепсину D. На каждую дорожку наносили равные количества общего белка. Блоты также зондировали антителом к ​​актину в качестве контроля нагрузки. Указаны положения маркеров молекулярной массы (в килодальтонах) и предшественников (pCatD), промежуточных (iCatD) и зрелых (mCatD) форм катепсина D.

Discussion

Результаты нашего исследования показывают, что Rab5 и Rab7 функционируют последовательным образом, чтобы регулировать рекрутирование ретромерного субкомплекса Vps в эндосомы.Rab5 не связывает субкомплекс Vps (), хотя избыточная экспрессия доминантно-негативного Rab5 вызывает диссоциацию субкомплекса от эндосом (). Напротив, Rab7 связывает ретромер зависимым от гуаниновых нуклеотидов способом (). Кроме того, истощение Rab7 с помощью RNAi (и) или избыточная экспрессия доминантно-отрицательного Rab7 () приводит к диссоциации субкомплекса Vps с мембран. Эти последние нарушения также препятствуют перемещению CI-MPR () и его груза, катепсина D (), в соответствии с предыдущими выводами (Press et al., 1998). Т.о. Rab7 представляет собой недостающее звено в механизме, который контролирует рекрутирование ретромеров в эндосомы и его функцию в сортировке грузов. Эти находки расширяют диапазон процессов, которые, как известно, регулируются с помощью Rab5 и Rab7, за счет вовлечения этих Rabs в ретроградный транспорт от эндосом к TGN.

Модель регуляции ретромера с помощью Rab5 и Rab7

изображает модель механизма рекрутирования ретромерного комплекса млекопитающих в эндосомы на основе данных, представленных здесь и в предыдущих исследованиях.Обмен GTP на GDP заставляет Rab5 связываться с ранними эндосомами (Ullrich et al., 1994) и рекрутировать большое количество эффекторных белков (Christoforidis et al., 1999a). Ключевым эффектором Rab5 является PI3K класса III (Christoforidis et al., 1999b), который в клетках млекопитающих состоит из каталитической субъединицы Vps34 и регуляторной субъединицы p150 (Panaretou et al., 1997). PI3K фосфорилирует фосфатидилинозитол до PI3P, фосфоинозитида, который высоко обогащен эндосомальными мембранами (Gillooly et al., 2000). PI3P, в свою очередь, задействует множество других нижестоящих эффекторов, среди которых компоненты ретромерного субкомплекса SNX (Burda et al., 2002; Cozier et al., 2002; Zhong et al., 2002, 2005; Arighi et al. ., 2004; Карлтон и др., 2004, 2005b). Эти белки связываются с PI3P через свои домены гомологии phox и с изогнутыми мембранами через свои Bin-Amphiphysin-Rvs домены в процессе, который упоминается как обнаружение совпадений (Carlton et al., 2004; Carlton and Cullen, 2005). Субкомплекс SNX способствует рекрутированию субкомплекса Vps, вероятно, благодаря взаимодействиям между в значительной степени неструктурированными N-концевыми расширениями (Gullapalli et al., 2004) и несколько сайтов связывания на субъединицах Vps29 и Vps35 (Collins et al., 2005). Однако эти взаимодействия слишком слабы, чтобы полностью объяснить ассоциацию субкомплекса Vps с эндосомами (Rojas et al., 2007). Вот где в игру вступает Rab7. Другим эффектором Rab5 является гомотипический комплекс белков слияния и вакуолей с Vps-C, который функционирует как фактор обмена гуаниновых нуклеотидов Rab7 (Rink et al., 2005). Активация Rab7 путем обмена GTP на GDP приводит к связыванию Rab7-GTP с мембранами, обеспечивая, таким образом, дополнительную точку прикрепления для субкомплекса Vps для связывания с эндосомами.Это взаимодействие субкомплекса SNX и Rab7 представляет собой другой уровень обнаружения совпадений, который дополнительно определяет рекрутирование субкомплекса Vps в определенные эндосомные домены. Rab7 также взаимодействует с PI3K и активирует его (Stein et al., 2003), обеспечивая устойчивую продукцию PI3P для рекрутирования субкомплекса SNX после диссоциации Rab5 от эндосом. Относительные вклады белков SNX и Rab7 в рекрутирование субкомплекса Vps варьируют у других организмов. В дрожжах Saccharomyces cerevisiae два ортолога SNX1 / 2, Vps5p и Vps17p, гораздо более тесно связаны с соответствующими субъединицами субкомплекса Vps до такой степени, что все пять субъединиц могут быть соосаждены из клеточных экстрактов (Seaman et al., 1998; Gokool et al., 2007). На другом конце диапазона находится Entamoeba histolytica , который имеет субкомплекс Vps, который взаимодействует с Rab7, но, по-видимому, не имеет SNX-подобных белков, кодируемых в его геноме (Nakada-Tsukui et al., 2005). Взаимодействие E. histolytica Rab7 с субкомплексом Vps имеет еще одну особенность, которая кажется уникальной для этого организма в том, что связывание Rab7 требует длинного С-концевого удлинения Vps26, которого нет в ортологах млекопитающих и дрожжей (Nakada-Tsukui et al. al., 2005). Это контрастирует с взаимодействием белков млекопитающих, которое включает связывание Rab7 с полностью собранным субкомплексом Vps, вероятно, посредством прямого контакта с Vps35 ().

Схематическое изображение регуляции ретромера Rab5 и Rab7. На схеме изображен участок эндосомы с ее вакуолярным и трубчатым аспектами. Последовательность реакций представлена ​​в контексте прогрессии от Rab5- к Rab7-положительным эндосомам и от вакуолярного к канальцевому аспекту.Подробности этой модели описаны в разделе «Обсуждение». БАР, Бин – Амфифизин – Rvs; HOPS, гомотипическое слияние и сортировка белков вакуолей; PX, гомология фотона.

Эндосомные домены, участвующие в функции ретромера

Вышеупомянутые шаги происходят, когда эндосомы подвергаются процессу превращения Rab (Rink et al., 2005), в котором Rab5 заменяется на Rab7 во время созревания эндосом. Rab5 связан с плазматической мембраной (Sato et al., 2005) и ранними эндосомами (Chavrier et al., 1990). Именно на этой ранней эндосомной стадии PI3K начинает продуцировать PI3P и что субкомплекс SNX может быть сначала задействован в эндосомах. Только в течение короткого интервала времени, когда Rab5 заменяется Rab7, оба Rabs сосуществуют на одной и той же эндосоме (Rink et al., 2005; Vonderheit and Helenius, 2005). Прибытие Rab7 завершает набор регуляторов, необходимых для рекрутирования субкомплекса Vps на мембраны. После диссоциации Rab5 Rab7 принимает на себя полный контроль рекрутирования субкомплекса Vps посредством продолжающейся активации пути PI3K – PI3P – SNX и прямого взаимодействия с субкомплексом Vps ().Это совпадение событий, регулируемых Rab7, объясняет преобладающую локализацию субкомплекса Vps в доменах Rab7 (и Videos 1-6). Все эти события происходят, когда белки связаны с вакуолярным аспектом эндосом. Однако и Rab7, и ретромер также обнаруживаются на извилистом наборе зачатков и канальцев, смежных с вакуолярным аспектом эндосом (). В какой-то момент и подкомплексы SNX и Vps ретромера начинают покидать эндосомы на длинных трубчатых отростках, которые в конечном итоге отслаиваются (и Videos 3 и 4).Популяция эндосом носителей TGN также формируется из таких сайтов (Mari et al., 2008). Этот процесс, вероятно, начинается на стадии переходных Rab5-Rab7 эндосом, т.к. можно видеть, что некоторые ретромерные канальцы исходят из Rab5-позитивных эндосом (Video 4). Однако переход в статус Rab7 вызывает усиление образования ретромеров-канальцев. Примечательно, что Rab7 не сопровождает ретромер в длинные канальцы (и видео 3), указывая тем самым, что стабилизирующая роль Rab7 д. Быть взята на себя некоторым другим фактором.Эту роль, вероятно, выполняют белки груза, такие как CI-MPR, как и в случае др. Взаимодействий груз-адаптер (; Hirst et al., 2007).

Rab7 как главный регулятор множественных эндосомных процессов

Rab7 имеет несколько других эффекторов в дополнение к ретромерному и гомотипическому слиянию и сортировке белков вакуолей — Vps-C. Среди них Rab-взаимодействующий лизосомный белок (Cantalupo et al., 2001) и ORP1L (Johansson et al., 2005), которые образуют комплекс, который взаимодействует с динеин-динактиновыми моторами, чтобы влиять на минус-направленное отслеживание поздних эндосом на микротрубочках (Йоханссон и др., 2007). Другим эффектором Rab7 является Rabring7, убиквитинлигаза, которая способствует нацеливанию на интернализованные рецепторы EGF для деградации лизосом (Sakane et al., 2007). Примечательно, что все эти эффекторы, кроме ретромера, как известно, опосредуют процессы, которые происходят в вакуолярной части поздних эндосом и приводят к лизосомам. Таким образом, наши находки раскрывают новую роль Rab7 в контроле существенно отличного процесса, отвода грузов от лизосом в рециркулирующие канальцы. Rab7 не только контролирует этот ретроградный транспортный путь, но он фактически может быть обнаружен в трубчатой ​​сети, смежной с эндосомами ().Таким образом, Rab7 действует как главный управляющий переключатель, который регулирует несколько эндосомных процессов. Наряду с этим, Rab7, как недавно было показано, модулирует ретроградный аксональный транспорт пузырьков, содержащих нейротрофины и их рецепторы в моторных нейронах (Deinhardt et al., 2006). Возможно, именно из-за участия Rab7 в путях транспорта белков, которые ведут как к лизосомам, так и от них, вмешательство в функцию Rab7 не приводит к нацеливанию CI-MPR на лизосомы, как в случае истощения ретромеров (Arighi et al. ., 2004; Карлтон и др., 2004; Моряк, 2004 г .; Rojas et al., 2007), но в его накоплении в эндосомах ().

Эндосомные сайты извлечения в TGN

Извлечение незанятых CI-MPR в TGN долгое время считалось происходящим из поздних эндосом. В самом деле, ансамбль позднего эндосомного Rab9 и его эффектора TIP47, как было показано, играют роль в этом процессе (Carroll et al., 2001). Однако были также свидетельства того, что по крайней мере некоторое извлечение происходило из ранних эндосом (Press et al., 1998). Эта последняя точка зрения была подкреплена демонстрацией того, что ретромер млекопитающих, который обеспечивает извлечение CI-MPR, ассоциирован с популяцией эндосом, которые имеют морфологические особенности промежуточных звеньев созревания от ранних до поздних эндосом (Arighi et al., 2004; Carlton et al., 2004; Seaman, 2004; Bujny et al., 2007; Popoff et al., 2007). Это согласуется с открытием, что некоторые ретромеры локализуются в Rab5-положительных эндосомах (и видео 4-6; Gullapalli et al., 2004). Даже ретромер S. cerevisiae теперь, как полагают, локализуется в трубчатых элементах, некоторые из которых могут происходить из ранних эндосом (Strochlic et al., 2007). Таким образом, оказывается, что извлечение CI-MPR происходит из континуума созревающих эндосом, который начинается в ранних эндосомах посредством пути Rab7-ретромер и заканчивается в поздних эндосомах посредством пути Rab9-TIP47.

Материалы и методы

Процедуры рекомбинантной ДНК

Конструирование GST-Rab4a, GST-Rab5a, GST-Rab7 и GST-Rab27a было описано ранее (Neeft et al., 2005). Конструкция GST-Rab9a была предоставлена ​​S. Pfeffer (Стэнфордский университет, Стэнфорд, Калифорния). КДНК Rab37a была получена от E. Masuda (Rigel Inc., Сан-Франциско, Калифорния) и лигирована в рамке считывания с сайтами BamHI и EcoRI pGEX1λT. Конструкцию GFP-Rab5a получали путем клонирования в рамке считывания собачьей кДНК Rab5a (предоставленной M. Zerial, Max Planck Institute, Дрезден, Германия) в сайты KpnI и BamHI вектора pEGFP-C1 (BD Biosciences). Комплементарные ДНК, кодирующие Rab7 и Rab4a, амплифицировали с помощью ПЦР из библиотеки кДНК собак и клонировали в рамке считывания в сайты KpnI-ApaI и BglII-KpnI, соответственно, вектора pEGFP-C1.Набор QuikChange Site-Directed Mutagenesis (Stratagene) был использован для получения следующих мутантов: GFP-Rab4a-S22N, GFP-Rab5a-S34N, GFP-Rab7-T22N и GFP-Rab7-Q67L. Конструкцию CFP-Rab5a получали, как описано ранее (Sonnichsen et al., 2000). Конструкция Vps29-YFP была создана путем ПЦР-амплификации человеческого Vps29 (остатки 1–182; стоп-кодон TAA в положении 183 был изменен на TAT, кодирующий остаток тирозина) и клонированием в сайты EcoRI и BamHI вектора pEYFP-N1. (BD Biosciences).Конструкция pEF-BOS-FLAG-Vps29 была получена с помощью ПЦР-амплификации полноразмерной кДНК Vps29 человека из ранее описанной конструкции pcDNA3.1-Vps29-myc и клонирована в сайт NotI (на 5′- и 3′-концах) вектор pEF-BOS. Полноразмерную кДНК Vps26 человека клонировали в рамке считывания в сайты BamHI и EcoRI вектора pRK5myc. (HA) 3 -Vps35-pEF6 / V5 был описан ранее (Hierro et al., 2007).

GST аффинная очистка и эксперименты с понижением

Мембранный экстракт получали гомогенизацией 100 г почек свиньи в 1 объеме 20 мМ Hepes, pH 7.5, 100 мМ NaCl, 5 мМ MgCl 2 и 1 мМ DTT (буфер A) с добавлением 10 мкг / мл ДНКазы, 10 мкг / мл РНКазы, 1 мМ PMSF, 10 мкг / мл апротинина, 1 мкг / мл пепстатина и 5 мкг / мл лейпептина при 4 ° C. Нерастворимый материал удаляли центрифугированием в течение 45 мин при 20000 г . Супернатант повторно центрифугировали в течение 1 ч при 100000 г для сбора мембранной фракции. Осадок ресуспендировали в 10 мл буфера А, содержащего 1% (вес / объем) Triton X-100, и экстрагировали в течение 30 мин на льду. Экстракт разбавляли в пять раз буфером А и диализовали в течение ночи против 5 мМ MgCl 2 , 1 мМ DTT и 0.2% (вес / объем) Triton X-100 в PBS. Экстракт повторно центрифугировали при 100000 г и использовали для анализов связывания. Слитые белки GST-Rab были продуцированы в Escherichia coli BL21 (DE3) -CodonPlus-RIL (Stratagene). Детали этой очистки были описаны ранее (Neeft et al., 2005). Обмен гуаниновых нуклеотидов на иммобилизованных белках GST-Rab выполняли, как описано ранее (Christoforidis and Zerial, 2000; Neeft et al., 2005). Иммобилизованные белки GST-Rab, нагруженные GMP-PNP или GDP, инкубировали с экстрактом мембран почек при 4 ° C путем вращения «конец за концом».Через 2 часа шарики промывали четыре раза по 1 мл буфера А, содержащего 20 мкМ GMP-PNP или GDP, дважды по 1 мл буфера А с добавлением соответствующего нуклеотида и 250 мМ NaCl и, наконец, дважды по 1 мл 20 мкМ мМ Hepes, pH 7,5, 250 мМ NaCl и 1 мМ DTT. Связанные белки анализировали с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга.

Для экспериментов «pull down» мы трансфицировали по отдельности или вместе pRK5-myc-Vps26, pEF-BOS-FLAG-Vps29 и pEF-HA-Vps35 в клетки COS-7 с использованием липофектамина-2000 (Invitrogen).Через 24 часа клетки промывали ледяным PBS и лизировали в 20 мМ Hepes, pH 7,5, 100 мМ NaCl, 5 мМ MgCl 2 и 0,2% (вес / объем) NP-40 в течение 10 минут на льду. . Лизаты центрифугировали в течение 10 мин при 15 700 g в настольной центрифуге (Eppendorf). Супернатанты собирали и затем инкубировали с GST-Rab7-GMP-PNP (или GST или GST-Rab4a-GMP-PNP в качестве отрицательного контроля), связанными с гранулами глутатион-агарозы в течение 2 часов в устройстве «конец за концом». Затем образцы промывали шесть раз буфером для лизиса, избыток буфера сливали с помощью 30.Игла 5 размера и связанные белки элюировали кипячением в буфере для образцов Лэммли. Образцы анализировали с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга с кроличьими поликлональными антителами к тегам myc, FLAG и HA.

Для экспериментов по связыванию in vitro с очищенными рекомбинантными белками GST-Rab7 и GST-Rab9a были продуцированы в E. coli BL21 (DE3) с использованием автоиндукционной среды ZYM-5052 при 25 ° C (C-концевые 23 аминокислотных остатка from Rab9a были удалены для повышения урожайности). Белки GST-Rab были иммобилизованы на гранулах глутатион-сефароза 4B, элюированы в соответствии с инструкциями производителя, сконцентрированы с помощью центрифужного концентратора (Amicon-15; Millipore) и очищены на колонке для гель-фильтрации Superdex 200 16/60.Для анализов методом «pull-down» 60 нмоль каждого GST-Rab иммобилизовали путем инкубации с 40 мкл гранул глутатион-сефароза 4B в PBS, 5 мМ MgCl 2 , 1 мМ DTT, 0,1% (вес / объем) NP-40, и 20 мкМ ВВП. 300 нмоль рекомбинантного тримера Vps35 / 26/29, который был получен и очищен, как описано ранее (Hierro et al., 2007), инкубировали в буфере A, содержащем 0,05% (вес / объем) BSA и 100 мкМ соответствующего нуклеотида с 60 нмоль иммобилизованного GST, GST-Rab7 или GST-Rab9a, нагруженного GDP или GTPγS, как описано ранее (Christoforidis and Zerial, 2000), в устройстве для вращения от конца к концу при 4 ° C.Через 2 ч образцы дважды промывали буфером A со 100 мкМ соответствующего нуклеотида, дважды буфером A, содержащим 250 мМ NaCl и 100 мкМ соответствующего нуклеотида, и один раз 20 мМ Hepes, pH 7,5, 250 мМ NaCl, 1 мМ DTT и 100 мкМ соответствующего нуклеотида. Связанный ретромер элюировали 20 мМ Hepes, pH 7,5, 1,5 М NaCl, 20 мМ EDTA, 1 мМ DTT и 5 мМ каждого нуклеотида (GDP для белков, связанных с GTP-S-нагруженным GST-Rab, и наоборот). Элюаты смешивали с равным объемом буфера для образцов NuPAGE и обрабатывали для SDS-PAGE и иммуноблоттинга.

Антитела

Мы использовали моноклональные антитела мыши к следующим белкам: Rab4, SNX1, SNX2, AP-1 – γ1 и актин (BD Biosciences), CI-MPR (люминальный домен; AbD Serotec) и AP-3– δ (SA4; банк гибридом исследований развития). Мы также использовали кроличьи поликлональные антитела к следующим белкам: Rab7 (предоставлено G. Schiavo, Cancer Research UK, Лондон, Великобритания; Deinhardt et al., 2006), цитозольный хвост CI-MPR (Kametaka et al., 2005), Vps26 , Vps29 и Vps35 (предоставлено CR Haft, Национальными институтами здравоохранения, Bethesda, MD; Haft et al., 2000), катепсин D (EMD), GFP (Invitrogen), гигантин (Covance) и TfR (Millipore). Козье антитело к пептиду Vps29 DDVKVRIEYKKD было получено от Genetex, Inc. Поликлональные антитела к тегам myc и FLAG были получены от Sigma-Aldrich, а антитело HA было получено от Upstate Cell Signaling. Ослиный антимышиный IgG, конъюгированный с Alexa Fluor 488, ослиный антимышиный IgG, конъюгированный с Alexa Fluor 594, и ослиный антимышиный IgG, конъюгированный с Alexa Fluor 647, были приобретены у Invitrogen.Конъюгированные с пероксидазой хрена антитела против мышиных и кроличьих IgG были приобретены в компании GE Healthcare.

Трансфекция клеток, иммунофлуоресцентная микроскопия и количественный анализ

Для экспрессии белков, меченных GFP, клетки HeLa (Американская коллекция типовых культур), выращенные на покровных стеклах до 50% слияния, трансфицировали в 24-луночных планшетах с 0,8 мкг плазмид, кодирующих GFP , GFP-Rab7, GFP-Rab5a, GFP-Rab7-Q67L, GFP-Rab4a-S22N, GFP-Rab5a-S34N или GFP-Rab7-T22N с использованием липофектамина-2000.В некоторых экспериментах контрольные клетки или клетки, экспрессирующие GFP-Rab7-Q67L, инкубировали с 0,1% ДМСО или 200 нМ вортманнина в ДМСО в течение 30 мин. Клетки фиксировали, пермеабилизировали и иммуноокрашивали кроличьими поликлональными антителами к Vps26, а затем — конъюгированным с Alexa Fluor 594 ослиным анти-кроличьим IgG. Для анализов поглощения антител CI-MPR клетки дважды промывали MEM / BSA и инкубировали с мышиным моноклональным антителом к ​​люминальному домену 10 мкг / мл CI-MPR в MEM / BSA в течение 2 часов при 37 ° C (Rojas et al. , 2007).Процедуры иммунофлуоресцентного окрашивания фиксированных и проницаемых клеток выполняли, как описано ранее (Rojas et al., 2007).

Колокализационные изображения, представленные в и были получены с использованием конфокального микроскопа (TCS SP-2; Leica), оснащенного 488 нм Ar – Kr, 543/594 нм He – Ne и 633 нм He – Ne лазерами. Изображения были получены в последовательном режиме с использованием масляного объектива 63 × Plan Apochromat NA 1.4 и соответствующей комбинации фильтров. Использовались следующие настройки: фотоумножители на 400–700 В, Эйри = 1, масштабирование = 3–4 и фильтр Калмана ( n = 4).Изображения, представленные на и, были получены с помощью эпифлуоресцентного микроскопа (AX10; Carl Zeiss, Inc.) с масляным объективом Plan Apochromat 63 × NA 1.3, снабженного камерой устройства с зарядовой связью (AxioCamMRm; Carl Zeiss, Inc.). Все изображения были сохранены в виде файлов TIFF, контраст был отрегулирован с помощью Photoshop (версия 7.0; Adobe), а изображения были импортированы в Illustrator (CS; Adobe).

Для количественной оценки совместной локализации Vps26 с GFP-Rab7 или GFP-Rab5a каждый набор изображений корректировался на перекрестные помехи.Были получены конфокальные срезы размером 512 × 512 пикселей (ширина и высота вокселя 100–150 нм, глубина вокселя 250–300 нм) по всему объему 24 ячеек (8 бит). После определения порога изображения степень колокализации была получена путем расчета коэффициентов Мандерса (M 1 ) и соответствующего стандартного отклонения (Bolte and Cordelieres, 2006) с помощью плагина анализа корреляции интенсивности, разработанного для программного обеспечения ImageJ 1.36b (National Институты здоровья). Процент совместной локализации был получен путем умножения M 1 на 100.

Для количественного определения цитозольных и мембраносвязанных уровней Vps26 мы измерили среднюю общую интенсивность флуоресценции от DMSO-обработанных клеток, клеток, трансфицированных GFP-Rab5aS34N, клеток, трансфицированных GFP-Rab7-T22N и нетрансфицированных или GFP-Rab7– Q67L-трансфицированные клетки, обработанные вортманнином. Мы воспользовались тем фактом, что эндогенные цитозольные белки, но не связанные с мембраной белки, частично экстрагируются при иммунофлуоресцентном окрашивании фиксированных проницаемых клеток (Reinacher-Schick and Gumbiner, 2001).Таким образом, мы захватили конфокальные (8-битные) сечения размером 512 × 512 пикселей по всему объему ячеек. Используя программу ImageJ 1.36b, мы получили 32-битные стеки из отдельных конфокальных секций. Мы измерили среднюю общую интенсивность флуоресценции на площадь поверхности клетки и соответствующее стандартное отклонение сигнала флуоресценции клеточного Vps26 по крайней мере 25 отдельных клеток для каждого состояния.

Замедленная флуоресцентная микроскопия

Клетки HeLa, выращенные до 40-50% конфлюэнтности на 35-миллиметровых культуральных чашках со стеклянным дном (MatTek Corporation), трансфицировали плазмидой, кодирующей Vps29-YFP.Через 24 часа после трансфекции клетки трансфицировали плазмидами, кодирующими CFP-Rab5a или CFP-Rab7. Трансфекцию проводили с использованием липофектамина-2000. Через 12 часов после второго раунда трансфекции клетки визуализировали, как описано ранее (Mardones et al., 2007). Вкратце, культуральную среду заменили на среду, забуференную Hepes без фенолового красного (Invitrogen), и клетки поддерживали при 37 ° C с использованием инкубатора для стадий (ASI 400 Air Stream; Nevtek). Покадровые флуоресцентные изображения получали с помощью конфокального сканера (Ultraview; PerkinElmer) на инвертированном микроскопе (Eclipse TE2000-S; Nikon), оборудованном PlanApo 100 × NA 1.Масляный иммерсионный объектив 40 (Nikon) и 12-битная камера с зарядовой связью (ORCA; Hamamatsu Photonics). Захват изображения и сбор данных выполняли с использованием программного обеспечения Ultraview LCI (PerkinElmer). Изображения были получены в режимах бинирования 2 × 2 для увеличения отношения сигнал / шум с интервалами 0,25–1 с. Изображения последовательностей были экспортированы как отдельные файлы TIFF, а видеоролики Quicktime были созданы с использованием ImageJ 1.36b. Для подготовки рисунков отдельные кадры обрабатывались в программе Photoshop (версия 7.0).

Электронная микроскопия

Клетки HeLa, трансфицированные GFP-Rab7, фиксировали 2% (мас. / Об.) Параформальдегидом или смесью 2% (мас. / Об.) Параформальдегида и 0.2% (вес / объем) глутарового альдегида в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, pH 7,4. Осадки клеток обрабатывали для ультракриомикротомии, как описано ранее (Raposo et al., 1997). Ультратонкие криосрезы были помечены одно- или двукратным иммунным золотом указанными антителами и с использованием протеина А, конъюгированного с частицами золота 10 или 15 нм (Центр клеточной микроскопии, Утрехтская медицинская школа). Срезы анализировали под электронным микроскопом (Philips CM120; FEI), а цифровые снимки производили с помощью цифровой камеры (Keen View; Soft Imaging System).

РНКи

Клетки HeLa, выросшие до 30% конфлюэнтности, трансфицировали дважды с 24-часовыми интервалами 80 пмоль миРНК-олигонуклеотидами (реагенты SMARTpool для Vps26, Rab7, Rab4a, Rab4b и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы [контроль] Scientific; Thermo Fisher Scientific; Thermo Fisher Scientific; ) с использованием олигофектамина (Invitrogen). Для большинства экспериментов клетки анализировали через 48 ч после второго раунда трансфекции. В экспериментах по спасению кДНК, кодирующая собачий GFP-Rab7 или только GFP, трансфицировали с использованием липофектамина-2000 в клетки, истощенные по Rab7, через 36 часов после второй обработки миРНК.Через 12 ч после трансфекции клетки фиксировали и обрабатывали для иммунофлуоресцентной микроскопии.

Другие процедуры

Анализы процессинга и секреции катепсина D, SDS-PAGE и иммуноблоттинг выполняли, как описано ранее (Mardones et al., 2007).

Дополнительные материалы онлайн

На рис. S1 показано влияние вортманнина на ассоциацию ретромера с мембранами. Видео 1–6 представляют собой покадровые эксперименты с клетками HeLa, котрансфицированными плазмидами, кодирующими Vps29-YFP и либо CFP-Rab5a (видео 1-3), либо CFP-Rab7 (видео 4-6), как описано в разделе «Материалы и методы».Дополнительные онлайн-материалы доступны по адресу http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200804048/DC1.

Междисциплинарный смешанный подход к пониманию того, как трансформации среды розничной торговли продуктами питания влияют на выбор и потребление продуктов среди городской бедноты: опыт Вьетнама

Abstract

Отсутствие продовольственной безопасности среди городской бедноты при модернизации азиатских мегаполисов является критической проблемой. Общеизвестно, что в городских районах Азии бедные слои населения не имеют продовольственной безопасности. По всей Азии среда розничной торговли продуктами питания быстро трансформируется, и супермаркеты все чаще заменяют традиционные продукты питания, такие как рынки и уличные торговцы, от которых зависит городская беднота.Вопрос в том, как эти преобразования влияют на рацион городской бедноты? Что движет их выбором еды? Каковы их повседневные покупки и как это влияет на их диетическое питание? Чтобы исследовать это, мы разработали междисциплинарное исследование питания и социальных практик с последовательным количественно-качественным смешанным методом. Основываясь на эмпирических данных из Ханоя, Вьетнам, исследование связывает (i) выбор продуктов питания и измеряемое диетическое потребление с (ii) средой розничной торговли продуктами питания через (iii) практикой покупки продуктов и предпочтениями 400 женщин репродуктивного возраста в контексте ( iv) их преобразующий городской образ жизни.Включенные методы включают в себя розничную перепись с GPS-координатами для картирования среды розничной торговли продуктами питания, обследование домашних хозяйств, круглосуточное напоминание о диете, опросы домашних хозяйств нескольких поколений и походы по магазинам. Мы демонстрируем, что интегрированные социологические и питательные аспекты продуктивны, поскольку позволяют быстро собирать доказательства для понимания сложных компромиссов между безопасностью пищевых продуктов и питанием в повседневной практике потребления продуктов питания. Мы описываем и размышляем о нашем теоретическом сочетании исследований рациона питания и социальных практик, а также о нашем целостном смешанном методе, который, помимо сочетания количественных и качественных методов, также дает голос городской бедноте из первых рук.

Ключевые слова

Питание

Социальные практики

Смешанные методы

Потребление

Безопасность пищевых продуктов

Пищевая среда

Рекомендуемые статьиЦитирующие статьи (0)

Просмотреть аннотацию

© 2019 Авторы. Опубликовано Elsevier Ltd.

Рекомендуемые статьи

Цитирование статей

Систематический обзор литературы по приложениям на основе блокчейна: текущий статус, классификация и открытые вопросы

Основные моменты

Систематический обзор приложений на основе блокчейна в нескольких доменах.

Мы исследуем текущее состояние технологии блокчейн.

Мы определяем характеристики, которые могут революционизировать практику «обычного ведения бизнеса».

Мы предоставляем основу для определения пригодности блокчейна для каждого приложения.

Реферат

Эта работа представляет собой систематический обзор литературы по приложениям на основе блокчейнов в различных областях.Цель состоит в том, чтобы исследовать текущее состояние технологии блокчейн и ее приложений и подчеркнуть, как конкретные характеристики этой прорывной технологии могут революционизировать практику «обычного ведения бизнеса». С этой целью в этот обзор включены теоретические основы многочисленных исследовательских работ, опубликованных в ведущих научных журналах за последнее десятилетие, а также несколько отчетов из серой литературы в качестве средства оптимизации нашей оценки и отражения постоянно расширяющейся области блокчейнов.Основываясь на структурированном, систематическом обзоре и тематическом анализе содержания обнаруженной литературы, мы представляем исчерпывающую классификацию приложений с поддержкой блокчейна в различных секторах, таких как цепочка поставок, бизнес, здравоохранение, Интернет вещей, конфиденциальность и управление данными, и определяем ключевые темы, тенденции и новые области для исследований. Мы также указываем на недостатки, выявленные в соответствующей литературе, в частности на ограничения технологии блокчейн и на то, как эти ограничения возникают в различных секторах и отраслях.Основываясь на этих выводах, мы выявляем различные пробелы в исследованиях и будущие исследовательские направления, которые, как ожидается, будут иметь большое значение как для ученых, так и для практиков.

Ключевые слова

Блокчейн

Классификация

Приложения

Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0)

Просмотреть аннотацию

© 2018 Авторы. Опубликовано Elsevier Ltd.

Рекомендуемые статьи

Цитирование статей

Что такое план действий при инциденте?

План действий при инцидентах (IAP) формально документирует цели инцидента (известные как цели контроля в NIMS), цели рабочего периода и стратегию реагирования, определенную командой инцидента во время планирования реагирования.Он содержит общие тактики для достижения целей и задач в рамках общей стратегии, а также предоставляет важную информацию о событиях и параметрах реакции. Не менее важно, что IAP способствует распространению важной информации о состоянии самих средств реагирования. Поскольку параметры инцидентов меняются, планы действий необходимо пересматривать на регулярной основе (по крайней мере, один раз за рабочий период), чтобы поддерживать согласованные и актуальные инструкции по всей системе.

Для включения в IAP необходимо рассмотреть следующее:

  • Цели инцидента (где система реагирования хочет быть в конце ответа)
  • Цели операционного периода (основные области, которые должны быть рассмотрены в указанный операционный период для достижения целей или задач контроля)
  • Стратегии реагирования (приоритеты и общий подход к достижению целей)
  • Тактика реагирования (методы, разработанные Операциями для достижения целей)
  • Организационный список с диаграммой ICS, показывающей основные роли и отношения
  • Список заданий с конкретными задачами
  • Обновления и оценки критической ситуации
  • Обновления состояния составных ресурсов
  • План охраны труда и техники безопасности (для предотвращения травм или болезней лиц, оказывающих помощь)
  • План коммуникаций (как функциональные области могут обмениваться информацией)
  • План логистики (e.g., процедуры поддержки операций с оборудованием, расходными материалами и т. д.)
  • Медицинский план для респондентов (руководство по оказанию помощи лицам, оказывающим помощь)
  • Карта происшествия (т. Е. Карта места происшествия)
  • Планы дополнительных компонентов, указанные в инциденте.

Ниже приводится пример плана действий отдельной организации здравоохранения (HCO), который может появиться после планирования реагирования группой управления инцидентами HCO. Это предназначено только для того, чтобы дать читателю общее представление о том, как компоненты из вышеприведенного списка могут быть описаны в плане действий HCO во время аварийного реагирования.В действительности информация, включенная в план действий, будет варьироваться в зависимости от обстоятельств инцидента и типа средств реагирования.

Примеры рекомендаций для плана действий HCO при инцидентах

Сценарий: вспышка инфекционного заболевания с ограниченным числом пациентов.

  • Цель HCO: защитить учреждение, персонал и пациентов, не попавших в аварию, от воздействия опасности (т. Е. Инфекционного заболевания), обеспечивая при этом оптимальную помощь жертвам инцидента и поддерживая нормальную медицинскую деятельность.
  • Объективы
  • HCO:
    • Обеспечение безопасности персонала HCO
    • Обеспечение безопасности пациентов без происшествий
    • Оказывать помощь инфицированным, контактировавшим или обеспокоенным пациентам.
  • Стратегии и тактика HCO:
    • Активировать соответствующие ресурсы в больнице для удовлетворения общих потребностей в увеличении количества пациентов (группа управления инцидентами, отделение неотложной помощи (ED), персонал лаборатории и т. Д.)
    • Установить операционный период для планирования реагирования HCO
    • Безопасные входы в HCO для контроля входа инфицированных / заразных пациентов
      • Разместите таблички с понятными инструкциями для потенциальных жертв происшествий, чтобы снизить вероятность передачи болезни.
      • Поставьте охрану у каждого входа (с индивидуальными средствами защиты (СИЗ)) для отслеживания цели посещения. [1]
      • Проинструктируйте персонал по сортировке ED и обеспечьте их СИЗ.
    • Наблюдать за персоналом на предмет признаков / симптомов заболевания (услуги, предоставляемые персоналом HCO по охране труда)
      • Руководитель подразделения для проверки при смене смены.
    • Обеспечение инфекционного контроля
      • Раздайте СИЗ персоналу HCO
      • Инструктировать персонал HCO по использованию СИЗ
      • Инструктировать персонал о процедурах, связанных с высоким риском передачи возбудителя.
  • Назначено
  • ресурсов HCO:
    • Сотрудники службы безопасности (присвоены номера)
    • ED (включая персонал для увеличения ответа в ED)
    • Персонал гигиены труда (для наблюдения за здоровьем сотрудников)
    • Персонал инфекционного контроля (помощь с инструкциями и доставкой СИЗ)
    • Кадровый резерв Персонал, доступный для выполнения вышеуказанных заданий.
  • Обновления событий
  • HCO:
    • Информация, относящаяся к внутренней деятельности предприятия:
      • Количество пациентов, прошедших обследование и выписанных в отделение неотложной помощи за последние 24 часа
      • Количество госпитализированных пациентов с подозрением на заболевание
      • Количество пациентов, поступивших с подтвержденным заболеванием (помещенных в когортную изоляцию)
      • Информация об известной передаче болезни от пациента к персоналу (или ее отсутствии)
      • Обновленные определения случая, факторы риска заражения и другая новая информация.
    • Информация, относящаяся к внешним операциям:
      • Количество пациентов, прошедших скрининг во всех юрисдикционных и региональных отделениях неотложной помощи за последние 24 часа;
      • Количество пациентов, поступивших с подозрением на заболевание во все юрисдикционные и региональные отделения.
      • Количество пациентов, поступивших с подтвержденным заболеванием во все региональные и региональные отделения
      • Количество случаев заболеваний внутрибольничным персоналом и персоналом больниц в подведомственных и региональных ОЗ
      • Описание ответа уровня 3 на сегодняшний день (включая более высокие уровни, если это уместно).
  • Обновления раздела:
    • Команда инцидента
    • Операции: особый упор на укомплектование персоналом
    • Логистика: с упором на то, где и как получить СИЗ и профилактику
    • Планирование: упор на включение отчетов по функциональным областям в заранее назначенное время
    • Администрация / финансы
  • Сообщение о безопасности:
    • Скоординировано с коалицией здравоохранения (уровень 2) и юрисдикционными властями (уровень 3) для распространения единого сообщения для персонала HCO в юрисдикции
    • Охватывает инфекционный контроль, СИЗ, профилактику, длительный стресс-инцидент и другие темы.
  • Коммуникационное сообщение:
    • Внутренний: метод связи для срочных сообщений и регулярных обновлений функциональной области.
    • Внешний: объясняет различия в каналах связи по стратегическим вопросам (контакт с внешними агентствами через функцию управления HCO) и по тактическим вопросам (прямой контакт с внешними респондентами).
  • Прогнозы событий: есть.

  1. Это демонстрирует важность обмена планами действий при инцидентах, которые содержат общие стратегии и конкретные тактики.Если у одного HCO персонал носит СИЗ, а у других HCO нет, персонал и широкая общественность будут сбиты с толку и потенциально потеряют доверие к управлению инцидентами в HCO.

<< Предыдущая --------- Начало страницы --------- Следующая >>

.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *