Методика домана карточки: Методика Домана — раннее развитие детей по методу Глена Домана

Содержание

Картки Домана. Як займатися?

Детство – замечательное время открытий, время изучения мира. Именно в этот период, на ребенка ежеминутно обрушивается масса информации. Изучая ее, ребенок учится и  развивается. Развитие это происходит очень стремительно, благодаря тому, что у  младенцев и маленьких детей есть уникальная способность легко учиться и на лету запоминать огромные объемы информации.

Обучение для детей раннего возраста – важный навык, необходимый для выживания, а еще – любимое занятие. Малыши любят учиться. И исследуют, изучают  все, не желая откладывать занятия на потом.

И  нам, родителям надо только немножко им помочь в этом.

Советуем вам для более эффективного обучения соблюдать основные правила проведения занятий:

1.С какого возраста начинать занятия?

Начинайте заниматься как можно раньше (с 3-6 месяцев). Первый год жизни – критическое время. Это время, когда мозг растет максимально, но растет за счет использования.   Если  занятия начинаются позже, на втором году, компенсировать  упущенное время в полной мере очень сложно.

2. Настроение во время проведения занятий

И вам, и малышу,  занятия  должны приносить радость. Когда вы сами  в хорошем расположении духа, тогда  даже младенец нескольких месяцев от роду, будет счастлив заниматься. Ведь дети воспринимают не только информацию, но и ваши эмоции. И если вам тоскливо, то  и малыш заскучает во время урока.

3. Как показывать карточки Домана?

Первым делом, напомним о важности выбора темы карточек. Тема должна вызывать интерес у ребенка. Не всегда легко угадать, но стоит присмотреться на чем задерживается взгляд малыша? Что именно его интересует? Животные? Птицы? Насекомые? Транспорт?

Если вы видите, что ошиблись в выборе, не переживайте – просто отложите эти карточки на время.  Чуть попозже, малыш подрастет и  ситуация может кардинально измениться.

Первые занятия  самые важные. Вам необходимо вызвать  интерес и заслужить доверие вашего любимого “ученика”, поэтому прочитайте внимательно рекомендации и визуализируйте уроки.

Итак, приступим:

  • Для первого занятия выберите 5 карточек из одного набора. Перед занятием обязательно произнесите название категории: ” Сейчас мы с тобой познакомимся с “Домашними животными”.
  • Быстро (1-2 секунды) показывайте карточки, четко и громко произнося название. В первые дни можно говорить полностью ” Это домашнее животное называется – кролик.” Потом можно произносить  только название: “Кролик!”
  • Чтобы при демонстрации не тратить время, на обороте каждой карточки можно написать название.  Рекомендуем держать все карточки перед собой и перекладывать их с задней карточки наперед. В таком случае, вы успеете прочесть название на обороте, не заглядывая на саму картинку.
  • После занятия возьмите малыша на руки, обнимите и пусть наградой  за старания, станет мамин поцелуй.
  • За день проведите три занятия с одинаковыми карточками. Промежутки между занятиями должны быть не менее  30 минут и обязательно каждый раз перемешивайте карточки, чтобі избежать механического запоминания.
  • Со второго дня добавьте еще  пять карточек из другой категории – еще три показа в день. Всего будет 6 “занятий”. 3 – со старыми и 3 – с новыми карточками.
  • Если вы видите заинтересованность,  постепенно увеличивайте количество карточек и показов в день. Если малыш устает – не спешите,  остановитесь на комфортном для него и вас количестве карточек и показов.
  • Карточку необходимо показывать около 30 раз, т.е. при трехразовом повторении в день, –   десять дней. После этого, по одной  начинаем откладывать старые карточки и вводить новые.

Начните занятия с пяти карточек на одну тему. Показывайте их три раза в день. На следующий день добавьте еще пять карточек

Для удобства держите  изученные и новые карточки в разных стопках или коробочках. На обратной стороне,  карандашом можно отмечать дату показа карточки.

4. Скорость отображения карточек

Чтобы достичь лучших результатов, нужно демонстрировать карточки с правильной скоростью. Гленн Доман утверждал, что карточки должны меняться очень быстро – 1-2 секунды.

Мозг ребенка до трех с половиной  лет при таком способе мгновенно воспринимает информацию, – бессознательно, правым полушарием мозга. Именно поэтому дети раннего возраста обучаются во много раз быстрее, чем взрослые.

5. Количество повторений

Нет никаких жестких рекомендаций. Доверяйте своему малышу, прислушивайтесь к его «пожеланиям». Количество повторений, выбор тематики, – зависит только от него. Наблюдайте за ним,  и удаляйте любую категорию, к которой малыш проявляет ограниченный интерес, даже если еще не прошло десять дней.

Дети быстро растут и их интересы меняются. Если у вас есть возможность, можно приобрести:  “Мега чемодан”   со всеми тематическими наборами карточек на русском языке или “Велику валізу” со всеми наборами украинских карточек.  Тогда, следя за интересом малыша, вы сможете быстро менять наборы.

6. Общее время показа

Не затягивайте урок. Именно в этом случае вы увидите отклик, и энтузиазм на следующем уроке. Чтобы поощрять воодушевление, вы должны прекращать занятие,  до момента, когда интерес ребенка начнет угасать.

7. Мультисенсорный способ демонстрации карточек

Есть разные способы демонстрации карточек. Один из них – мультисенсорный. Суть этого способа в том, что новая  информация воспринимается детьми легче, если они получают ее через несколько сенсорных каналов.  Это значит, что вы не только произносите слово, но и объясняете его смысл, сопровождаете обучение соответствующими  звуками, демонстрацией действия, эмоции и т.п. Такой способ предпочтительнее для детей, которые плохо реагируют на  традиционное лево-полушарное обучение.

Суть мультисенсорного способа в том, что новая  информация воспринимается детьми легче, если они получают ее через несколько сенсорных каналов.

8. Похвала и одобрение успехов ребенка

Самая важная награда для крохи – ваша похвала и одобрение каждого успешного шага. Чем с большим воодушевлением, вы замечаете маленькие «победы», тем выше самооценка и мотивация, интерес к учебе.

9. Организация и подготовка занятий

Тщательно готовьтесь к урокам. Ваша организованность и последовательность – прежде всего.

10. Недопустимость «тестирования»

Не проверяйте своего ребенка. Даже самые маленькие «ученики» не любят «экзамены», проверка и оценка  знаний,  – тормоз успеха. Ваша задача – предоставить новую информацию, а не контроль.

Еще один секрет успешности занятий – присоединение занятий к основным ежедневным рутинам. Ведь карточки можно не только традиционно показывать. Их можно с помощью пружины, превратить в “книгу”, их можно развесить в комнате, с ними при желании можно и играть.

В этом случае занятия требуют меньше усилий. Например, расположив карточки возле кроватки, вам не надо запоминать время проведения занятия. Когда вы подходите к ребенку, карточки сами напомнят вам об этом. Вам не надо их носить с собой, – они вас ждут.

Как видите, последовательность и правила очень важны, но не бойтесь иногда отходить от правил, присматривайтесь к вашему ребенку, его радость и ваш энтузиазм, должны быть главным индикатором  правильности ваших действий. Если вас или ребенка не радуют занятия – остановитесь. Вы делаете что-то неправильно.

Чувствуйте настроение вашего ребенка, его интерес. Только в этом случае вас ожидает успех.

 

*При копировании материалов ссылка на сайт обязательна. 

Метод Домана — это… Что такое Метод Домана?

Дуглас Доман рассказывает про профиль развития ребёнка.

Метод Домана — серия восстанавливающих (методика Домана-Делакато, «паттернинг»[1]) и обучающих методик для детей с задержками развития и для детей с полноценным развитием, разработанных Гленном Доманом и основанным им Институтом Развития Человеческого Потенциала (англ. The Institutes for the Achievement of Human Potential, IAHP).

Восстанавливающие методики

В сороковые года XX века молодой физиотерапевт Гленн Доман начал разработку программы реабилитации детей с тяжелыми поражениями нервной системы. Основной целью программы была активизация умственной деятельности больных детей через обучение. В своей системе он использовал карточки с красными точками, картинками и словами. Эти карточки показывались ребенку на короткое время, но много раз за день. Постепенно количество карточек увеличивалось. Карточки являлись раздражителями, которые стимулировали резервные здоровые клетки мозга. Уходили месяцы кропотливой работы, прежде чем больные дети начинали развиваться, двигаться, говорить. Умственно отсталые дети, в своем развитии, догоняли своих сверстников. Больные дети начинали ранее положенного срока говорить, считать, писать. Впоследствии методику Домана стали применять как развивающую для обучения здоровых детей.

Развивающие методики

В Институте Развития Человеческого Потенциала под руководством Гленн Домана были разработаны различные восстанавливающие методики для умственно отсталых детей, и обучающие, развивающие методики для обычных детей. В серию методик входит необычно раннее (с первого года жизни) обучение чтению и математике, а также методики физического развития.

Исследования, проведенные учеными, показывают, что ребенок в первые 6 лет жизни получают больше знаний, чем за остальную долгую жизнь. По методикам Домана рекомендуется начинать обучение уже в 3-6 месяцев, поскольку «с 6-7 лет у детей начинается Обучение, а Познание — идет с самого рождения.»

Обучение чтению по методике Домана

Раннее (в два года и даже раньше) обучение чтению при помощи специального набора карточек (карточки Домана) — пожалуй, наиболее распространенное применение методик Глена Домана. Основной идеей обучения является запоминание ребенком слова целиком, вместо складывания его из букв и слогов, основным приемом — многократная кратковременная демонстрация карточки одновременно с произнесением написанного слова.

Критика

Методики Домана являются предметом критики некоторых специалистов. В частности, в журнале Американской ассоциации педиатров были опубликованы статьи[1],[2], утерждающие, что методики основаны на устаревших и упрощенных представлениях о психологии развития, а эффективность методик была поставлена под сомнение.

Примечания

Ссылки

Прежде чем начать занятия. Методика раннего развития Глена Домана. От 0 до 4 лет

Прежде чем начать занятия

Работа с ребенком по методике Домана напоминает создание сложной компьютерной программы. Поэтому каждая частица знаний, которую получит малыш, называется «битом информации».

• Мозг ребенка с самого рождения запрограммирован на обучение.

• Учеба эффективна только в период роста мозга. А мозг человека растет до 7–7,5 лет, но активнее всего он растет в первые три года.

• Все младенцы обладают невероятными способностями к языкам.

• Чем быстрее идет формирование высших отделов (и особенно коры) головного мозга, тем умнее и сообразительнее будет ваш малыш.

Почти с рождения ребенку можно показывать большие карточки с «битами информации». Для обучения чтению используйте карточки со словами. Для обучения математике – карточки, на которых цифра заменена соответствующим количеством точек. Для получения энциклопедических знаний – карточки с картинками.

Такая карточка может изображать животное, насекомое или произведение искусства. Название предмета записывается на обороте, именно его ребенок и должен прочесть. Чем подробнее (по Доману – информативнее) объяснение, тем лучше. Например, надпись «большая галапагосская черепаха» предпочтительнее, чем «черепаха».

Бесспорно, методика Глена Домана полезна и при правильной организации занятий эффективна, хотя, как и у любой методики, у этой системы есть свои минусы. Однако не стоит сразу же отказываться от методики, предложенной Доманом. Помните про правило «золотой середины»? Вот именно его-то и надо соблюдать, умело сочетая элементы этой системы с другими методиками раннего развития, со здравым смыслом, особенностями именно вашего ребенка, а также вашим образом жизни.

Глен Доман утверждает: «Если вы в течение десяти секунд покажете ребенку не просто 10 случайных карточек, а 10 карточек, относящихся к определенной категории, то тем самым предоставите ему возможность составить 3628800 комбинаций из полученных знаний. Теперь он не просто запомнит на всю жизнь десять бит информации, а овладеет целой системой знаний».

Система Домана хороша тем, что ребенок усваивает большой объем информации с легкостью, приятным для него способом, без насилия, угроз и тому подобных «воспитательных» изысков. Для развития творческих и исследовательских способностей родители всегда могут найти другие способы.

Перед началом занятий обязательно обратите внимание на несколько важных моментов.

• Занятия по данной методике потребуют от родителей определенных сил и затрат – ведь в течение длительного времени им придется изготавливать тысячи карточек с точками, словами, изображениями животных, растений, различных предметов.

• В системе Домана ребенок является пассивным объектом обучения. Он сидит, а мама показывает ему то одну, то другую серию карточек, сообщая строго определенный набор сведений о каждой. Не получается диалога и совместного творчества с ребенком.

Не надо отказываться от традиционных «бабушкиных» методов. Давайте малышу слушать как можно больше сказок, песен, стихов, причем они не всегда должны сопровождаться картинками, чтобы мозг малыша научился самостоятельно достраивать зрительный ряд к тексту. Это поможет развить у малыша речь, вовремя сформировать функции интерпретации текста. Не стоит забывать и о таких старинных «развивалках», как традиционные потешки, пестушки, пальчиковые игры.

Ученые считают, что нельзя забывать об эмоциональном и познавательном развитии ребенка, так как нельзя развивать только одну (в данном случае зрительную) составляющую. «Факт» надо пощупать, потрогать и полизать, то есть исследовать его всеми органами чувств, и потом, используя его взаимосвязи с другими «фактами», определить ему место в мире.

• Если использовать при обучении только картинки с подписями, как рекомендует Доман, у ребенка не формируется текстовое мышление: умение самостоятельно читать (или слушать) и анализировать текст, добывать из него необходимую информацию.

• Доман сравнивает человеческий мозг с компьютером, очень совершенным, наделенным огромным запасом памяти, но все-таки компьютером, который для успешной работы необходимо снабдить хорошей базой данных.

Но ребенок – не компьютер, и ему нужно большее, чем некий объем информации.

Итак, если вы решили начать обучение ребенка по методике Глена Домана, прислушайтесь к советам специалистов и опытных родителей.

• Не нужно четко следовать всем рекомендациям; обязательно сочетайте методические разработки Домана с другими занятиями и развивающими играми.

• Ориентируйтесь на реакцию малыша. Доман рекомендует показывать карточки очень быстро, задерживая каждую не более чем на 1–2 секунды. Мозг маленького ребенка работает иначе, чем у взрослого, и малыш как будто бы «фотографирует» картинку, а затем в состоянии покоя обрабатывает полученную информацию. Для детей первого – начала второго года жизни это действительно справедливо. Но полутора-двухгодовалый малыш сам обязательно даст вам понять, что эта методика его уже не устраивает. Скорее всего, он начнет отбирать у вас альбом, подолгу рассматривать картинки, задавать вопросы. Прислушайтесь к своему крохе, и вы обязательно поймете, как именно нужно с ним заниматься.

Положитесь на свою интуицию, ведь любая готовая методика – всего лишь схема, из которой нужно выбирать то, что кажется полезным и нужным именно для вашего малыша.

• Никогда не делайте то, что вам не по душе и что, как вам кажется, не нравится ребенку.

• Не относитесь серьезно к утверждению Домана о том, что единственная потребность ребенка – познавать, а бесполезная игра – это всего лишь родительский способ «отделаться» от малыша. Психологами давно доказано, что игра для ребенка – это моделирование мира и возможность самовыражения.

• Занимайтесь с ребенком по времени столько, сколько у вас получается. Не переживайте, что в ваш распорядок дня не удается вписать трехразовый показ нескольких блоков карточек, большинство физических упражнений и т. п. Стоит напомнить, что изначально методика разрабатывалась для детей, страдающих различными заболеваниями, и родители готовы были «жить для ребенка». Цель их жизни заключалась в том, чтобы поставить их на ноги. Нужны ли такие жертвы здоровому малышу? Будут ли счастливы родители, подчинившие свою жизнь целиком его обучению? И принесет ли это счастье самому ребенку?

• Занимаясь по методике Домана, используйте только то, что вам под силу. В любом случае это будет лучше, чем ничего.

• Не просите ребенка давать вам ответы, играть с вами, читать вам тогда, когда у него нет настроения, только из-за того, что пришло время очередной «порции» знаний.

• Главное – старайтесь как можно больше разговаривать с ребенком на любые темы. Это залог вашего успеха.

• Предоставьте ребенку как можно больше путей получения информации, не ограничивайтесь только карточками. Пусть в распоряжении малыша будут карты, книги, микроскоп, музыкальные инструменты и многое другое, что вы можете позволить. Среда, в которой живет ребенок, должна быть развивающей.

• Информация, которую вы даете маленькому ребенку, должна быть построена на основе принципа «Ребенок и его окружение», и границы ее необходимо расширять в зависимости от возраста ребенка. К примеру, можно показывать малышу карточки с предметами обихода, фруктами и овощами, растениями местности, в которой вы живете, домашними и дикими животными, которых он может увидеть или о которых рассказывается в его книжках. Очень полезны карточки, изображающие, что делают дети (идет, сидит, плавает, пьет из бутылочки, улыбается, спит). Можно сделать серию карточек, на которых будут изображены представители различных профессий: маляр, шофер, рыбак, врач, продавец, клоун и т. д. Все это не только расширяет кругозор малыша, но и развивает его речь. Для удобства использования вставьте карточки в фотоальбомы или папки с прозрачными кармашками – файлами, а картинки подпишите крупными, четкими буквами. Тогда малыш будет не только запоминать картинки, но и постепенно учиться читать.

• Радуйтесь каждому успеху вашего ребенка, даже малейшей попытке проявить себя, особенно если это желание замечено вами впервые.

• Совершенствуйтесь сами, никогда не останавливайтесь на достигнутом, ищите ответы на детские вопросы вместе с малышом, рассуждайте.

• Не нагружайте ребенка бесполезной информацией. Чтобы малопонятные абстрактные факты не «повисали в воздухе», такие занятия хорошо совмещать с чтением любимых книг. Например, читая русские народные сказки, подготовьте серии карточек с животными и растениями, которые в них упоминаются, изображения предметов старинного быта (прялки, веретена, коромысла, лапти и т. д.). Если малыш без конца требует перечитывать «Айболита», самое время рассказать ему, что такое Африка и показать ее на географической карте, сделать и рассмотреть альбом «Звери жарких стран», в котором встретятся изображения животных, вылеченных Айболитом.

• Старайтесь давать ребенку не отдельные факты, а системно организованную информацию; подавайте ее с разных сторон, с разных точек зрения, освещайте одну и ту же тему не только на карточках, но и в играх, плакатах, книгах, других пособиях.

• Маленькие дети намного способнее к обучению, чем кто бы то ни был.

• Маленькие дети уверены в том, что самым замечательным подарком для них является внимание, которое им всецело уделяют взрослые, особенно папа с мамой.

• Самыми лучшими учителями являются родители.

• Они могут учить своего ребенка абсолютно всему, что знают сами, если только это знание истинно и основано на фактах.

• Не устраивайте «проверки знаний»: тестирование выявляет только то, что не усвоено.

• Учение – это игра, которая заканчивается до того, как ребенок устанет.

ЗАМЕТКИ ОПЫТНЫХ РОДИТЕЛЕЙ

Марина Ф.: «Мы с дочкой стали заниматься по Доману с 3-х месяцев. Начали с развития физических способностей. Благодаря этим упражнениям в 3 месяца ходили с поддержкой и ползали, садиться ребенок стал в 4 месяца, сам ходить – в 6,5 месяцев. Причем противники такого развития говорят только о том, что такие занятия якобы вредны для позвоночника ребенка. Скажу сразу, что все упражнения Домана для этого периода развития основаны на движении без нагрузки на позвоночник. Благодаря этим упражнениям и укрепляются мышцы и связки позвоночника. А вопрос: „Зачем ребенку в 3 месяца ползать или в 6 месяцев ходить?“ – я не понимаю. Может, логичнее будет предположить, что вредно пеленать ребенка и не давать ему двигаться? А если ребенок может ходить или ползать, он получает возможность открывать новые горизонты для познания окружающего мира. По крайней мере, мой ребенок был в восторге.

Дальше с 7 месяцев мы стали учиться читать. Для ребенка это была увлекательная игра. Опять же не понимаю тех, кто спрашивает: „А где же детство? Где необходимые детские игры?“ Наше обучение не занимало больше получаса в день, вот вам ответ – целый день на другие игры. Результатом занятий стало то, что ребенок в 1 год 8 месяцев читал детские книжки сам. Причем, чтобы не было проблем с длинными и неизвестными словами, мы, помимо целых слов, выучили еще и все известные слоги. С 10 месяцев учились считать. Сейчас дочке 2 года и 3 месяца, мы считаем до 100, делаем все простые математические действия, начинаем изучать таблицу умножения.

Приведу главный довод, почему я „за“ Домана. Большинство не подготовленных к школе детей к концу первого класса не успевают усвоить простой счет и математические действия, а тут уже второй класс – таблица умножения. Материал усложняется. Дети пытаются понять таблицу умножения, не зная толком счета. И начинается снежный ком: ребенок не усвоил одно, – ему уже другое усваивать надо. И так до выпускного класса. А отшлифованные до идеала начальные знания помогают, а не тормозят усваивание школьной программы. В жизни ребенку легче будет понимать другие простые и сложные вещи».

Данный текст является ознакомительным фрагментом.

Продолжение на ЛитРес

Методика Домана, карточки и глобальное чтение

Очень многие мамы после рождения малыша хотят максимально помочь ребенку использовать потенциал мозга и ищут различные методики, которые помогут это сделать. Сегодня речь о методике Глена Домана.

Глен Доман и глобальное чтение

Сразу же все вспоминают картинки с надписями. Мой первый вопрос — как они их планируют использовать? В оригинале методики они нужны для знакомства ребенка с энциклопедическими знаниями — то есть познакомить ребенка с бабочкой, когда ему 3 месяца. Но точно ли ребенок потом сможет распознать эту бабочку на улице по картинке? Скорее да, потому что мама еще не один раз покажет ее вживую. Со всеми ли названиями так получится — не уверенна, поскольку все таки опыт знакомства с предметами вживую, используя не только зрение, но и тактильную систему явно имеет преимущества. Да и внешний вид живого предмета и картинки может сильно отличатся.

Карточки-картинки для энциклопедических знаний

Глобальное чтение

Если же мама планирует обучать ребенка глобальному ЧТЕНИЮ по Доману — нужны карточки с отдельными словами. У нас такие карточки не соответствуют задуманным размерам (оригинал — 15*66 см, шрифт 7,5 см буквы) и естественно не дадут ожидаемого результата. Поскольку именно размер шрифта и предлагаемого слова ОЧЕНЬ важен в таком маленьком возрасте. Количество таких карточек, как вы понимаете должно быть очень много (методика предполагает их ручное изготовление, что требует колоссального труда родителей). Сейчас это просто сделать на компьютере. Но надо помнить, что слова должны быть в наборах, их представление ребенку происходит в определенной схеме с постоянным добавлением новых слов и убиранием старых. После демонстрация фраз и предложений. Постепенно шрифт уменьшается и изменяется на черный. В день показ 3 раза по 5 комплектов каждый раз. И, конечно, для результата нужна РЕГУЛЯРНОСТЬ и знание всех деталей задумки автора!

Оригинальные карточки на сайте Домана

Если уж говорить о Глене Домане — важно знать, что его основная деятельность заключается в реабилитации детей с повреждением мозга с помощью двигательных упражнений, а точнее восстановление всех этапов развития движения нормального ребенка, начиная от нахождения на полу на животе до прямохождения на двух ногах. И этот опыт мне больше интересен и важен. Поскольку они использовали принцип ОНТОГЕНЕЗА, что мне как биологу очень понятен и близок.

И уже во время реабилитации они случайно у одного из пациентов обнаружили способность читать в раннем возрасте, благодаря усилиям мамы при коррекции и начали применять на своих детях во время лечения. А после использовали этот опыт для развития всех детей.

Как работает методика?

Мозг одновременно видит слово достаточно крупным шрифтом, подходящим для зрительного восприятия в очень маленьком возрасте (еще с ранних месяцев) и слышит достаточно громким голосом и соответственно соединяет информацию из двух каналов, что позволяет узнавать после данные слова и читать. А благодаря карточкам для энциклопедических знаний он постепенно понимает эти слова и сможет понимать текст прочитанного.

В целом данный метод работает, поскольку в раннем возрасте сначала созревает правое полушарие и как раз восприятие слова целиком — это естественно. И в это время учить ребенка читать по буквам как раз очень сложно, поскольку совсем непонятно, что такое отдельная буква «А» и для чего она нужна. А вот слово «банан» куда понятнее и запоминается целиком быстрее, чем отдельный знак «Б».

Я не использовала данную методику и мне сложно понять, как потом ребенок в русском или украинском языке с большим количеством окончаний понимает смысл и детали? Английский же не имеет окончаний. Там нет различия между мама, маме, маму и т.п.


Хотя один из знакомых нейробиологов (Левашов Олег), который как раз изучает зрительную систему мне говорил о плюсах глобального чтения, ведь чтение это в первую очередь ЗРИТЕЛЬНОЕ ВОСПРИЯТИЕ! И непонятно, зачем мы подключаем в работу левое полушарие (аналитическое), разбивая единое слово на буквы.

Тем более, что к глобальному чтению мы все приходим во взрослом возрасте.

Попробуйте прочитать:


По рзелульаттам илссеовадний одонго анлигйсого унвиертисета, не иеемт занчнеия, в кокам пряокде рсапожолена бкувы в солве. Галвоне, чотбы преавя и пслоендяя бквуы блыи на мсете. Осатьлыне бкувы мгоут селдовтаь в плоонм бсепордяке, все-рвано ткест чтаитсея без побрелм. Пичрионй эгото ялвятеся то, что мы не чиатем кдаужю бкуву по отдльенотси, а все солво цликеом.


Мы всё понимаем, поскольку читаем не буквами, а СЛОВАМИ. И ребенок может это делать и в 3 года, если мы будем очень часто показывать ему слово и называть его.

Выбор — за вами!

Поэтому выбор способа обучения чтению — за вами. Я пока придерживаюсь стандартного метода — ведь не зря ребенок перед тем, как построить что-либо сначала это разбирает и только потом снова созидает.
А время, которое необходимо на демонстрацию карточек лучше потрачу на совместную игру, на получение сенсорного опыта и развитие более актуальных процессов для данного возраста ребенка.

Что же касается методики — читайте и слушайте первоисточник, чтобы потом понимать как использовать то, что вам предлагают маркетологи. Поскольку карточки с картинками у нас тоже хорошие — вопрос в том, чтобы понимать, для чего они вам нужны и какие есть альтернативные варианты этого материала.

Автор — Дарья Мешкова, нейропсихолог

Автор публикации

16 Комментарии: 1Публикации: 268Регистрация: 13-09-2016

Методика Глена Домана. Карточки Домана

Глен Доман — врач-физиотерапевт из США, который всю свою жизнь посвятил изучению развития детского мозга. Его методика раннего развития основана на том факте, что для активизации всего мозга достаточно стимуляции одного из органов чувств (зрения или слуха).

А начиналось все с исследований, посвященных лечению и реабилитации больных детей. Им показывали карточки со словами (слова были написаны крупным красным шрифтом) и громко читали написанное. Занятие длилось буквально считанные секунды, но в день подобных уроков должно было пройти несколько десятков. После курса такой «терапии» больные дети начинали читать и — параллельно — двигаться.

Вообще, физическому развитию уделялось много внимания. Доман доказал, что оно стимулирует умственное развитие.

После потрясающих результатов занятий с больными детьми (они догоняли в развитии сверстников), методику стали использовать и для занятий со здоровыми. Результаты впечатляли: маленькие дети с легкостью учились читать, считать, приобретали энциклопедические знания из разных областей. При всем этом их физическое развитие было тоже на высоте.

Хотите, чтобы ваш ребенок гармонично рос и развивался, используя огромный потенциал, дарованный ему природой? Это риторический вопрос, все родители этого хотят. Тогда давайте рассмотрим, как же мы можем ее применять в «домашних условиях».

Методика раннего развития Домана состоит из 4-х основных направлений.

1. Физическое развитие ребенка. Ребенок с рождения должен иметь возможность свободно двигаться. Физиотерапевт предлагает всячески поддерживать и стимулировать ребенка в его попытках ползать, передвигаться на руках, ходить и так далее. По его мнению, динамическая гимнастика для новорожденного, а также любые физические занятия с малышом — это серьезный задел на всю его жизнь.

2. Обучение чтению. Это направление строится на показе ребенку карточек со словами (большие красные буквы на белом фоне). На первом этапе на карточках изображаются предметы из окружения малыша, потом прилагательные, глаголы (действия). Ребенок учится зрительно воспринимать полностью все слово, представляя его значение. Подробнее о методике можно прочитать в книге Домана «Как научить ребенка читать».

3. Обучение счету. Для обучения счету по представляемой методике используются карточки с красными кружками (сначала от 1 до 20). Ребенок видит количественную разницу, знакомится с понятием количества в обход абстрактных — и пока еще сложных для него — цифр. Благодаря этой методике ребенок учится быстро производить вычисления в уме.

4. Формирование «багажа» энциклопедических знаний. Система энциклопедических знаний складывается за счет регулярного показа малышу серий карточек с картинками. К таким карточкам есть определенные требования: картинка должна быть четкая, крупная, достоверная. Фон, на котором изображен предмет, — белый. Размер карточки — 27×27 см. Последняя рекомендация не существенна: многие мамы, которые изготавливают карточки самостоятельно или покупают готовые, используют другие размеры (а при просмотре карточек на экране компьютера, планшета или телефона размеры будут определены непосредственно размерами устройств).

Карточки разделяются на категории, в каждой категории от 10 карточек. Например, «Животные»: кошка, собака, корова и т.д.. Сначала надо просто показывать картинки, а потом раз за разом добавлять предложение с новой информацией об этом предмете (в общей сложности предложений 10—12).

Занятия по методике Домана

Гленн Доман использовал как единицу информации – БИТ.

БИТ – карточка 28*28 см. На ней изображен точный и четкий рисунок с подписью красным цветом. Высота красного шрифта не менее 2,5 см.

БИТ- это изображение точного и четкого рисунка, изображение только одного объекта (возможна хорошая иллюстрация или фото). Каждый рисунок подписан красным шрифтом.

Биты объединяются в категории. Категории – это логически связанные друг с другом 10 или более битов информации. Например: раздел «Биология, животные», категория «домашние животные», бит «фотографии домашних животных».

Занятия лучше организовать в утреннее время, когда малыш выспался, сыт, в хорошем настроении. Это может быть несколько совсем коротких уроков через определенные интервалы времени. Карточки нужно показывать не ближе 45 см от лица ребенка. Необходимо исключить все отвлекающие факторы: посторонний свет, звук и т.д. Ваш голос должен быть четким и громким. Вы должны только показать карточку и назвать слово, затем показать и назвать следующую карточку, но не объяснять, что обозначает это слово. Должен сообщаться факт, а не мнение. На одно занятие по 10 -15 карточек. Начинать нужно с 5 карточек. На одну карточку нужно тратить время около 1 секунды. После освоения 5 карточек, добавлять новые, а старые убирать. Можно возвращаться к старым карточкам по необходимости. Показ 1 бита 3 раза по 30 раз, 10 дней. Обычно, за этот промежуток времени ребенок усваивает 1 бит (1 факт-карточку).

Проводить занятия можно на любом языке, главное, чтобы было правильное произношение и правильно подписан рисунок. Но не стоит это делать вперемешку: проводить занятия сразу на нескольких языках. Необходимо поставить ребенка в известность, что вы будете демонстрировать карточки на иностранном языке. Только после этого начинайте занятие.

Всегда будьте в хорошем настроении, улыбайтесь.

Когда ребенок научится говорить, поставьте перед ним задачу отвечать, что написано на карточке. При каждом правильном ответе, хвалите малыша. Не допускайте неприятных комментариев, если он ответил неправильно. Всегда поддерживайте начинания малыша. Занятия должны проходить регулярно, только тогда Малыш сможет усвоить заданные ему знания.

Методика чтения Домана

Механическое запоминание слов, которые много раз в день показывают Малышам. Например: показывают карточку со словом «БАБУШКА». Нужно отчетливо произносить слово и не надо ничего объяснять (не надо объяснять значение слова). Ребенок не должен складывать буквы в слоги, а затем в слова, просто запоминает слова полностью. Впоследствии видя, это слово в тексте, он воспроизводит его(воспроизводит звук).
Сначала ребенку показывают слова, затем количество слов увеличивается, начинают показывать словосочетания, далее простые предложения и наконец, распространенные предложения.
Чтение книги строится так же, как и работа с карточками. Книга читается взрослым несколько раз в день, не менее 2-3 раз, несколько дней подряд. На каком–то этапе, Малыш самостоятельно захочет прочитать книгу.

Обучение математике

На битах (карточках) рисунок изображает количество точек, а не цифры. Количество точек (кружков) соответствует какой либо цифре. Например: показывают карточку с количеством точек равным – 3, что соответствует цифре «3».
На белом фоне карточки из картона, кружки диаметром около 2,0 см.
Таким образом, его можно познакомить с любой цифрой.
Принцип: узнавать количество точек, решение примеров, узнавать цифры, равенства с цифрами. Кроме того, математические действия в виде «+», «-«, «=» не изображены, а только произносятся вслух. Постепенно у ребенка вырабатывается способность определять количество точек «на глаз», без подсчета, причем многозначными цифрами.
Гленн Доман считает, что если регулярно ребенку показывать карточки с количеством точек, то со временем, он сможет в уме решать арифметические упражнения, причем с большими числами. Когда Малыш пройдет первые 20 цифр, то далее, кроме цифр, ему показывают примеры. Уже через пару месяцев, он сможет самостоятельно решить простой пример.

Интеллектуальное развитие

Вы скажете, зачем тратить такие колоссальные усилия, вкладывать в головки малышей такой огромный объем энциклопедических знаний, умение считать и читать в возрасте трех лет? Гленн Доман считает, что знания – базис для интеллекта, интеллект – врожденный дар, который дан каждому ребенку. Нужно по возможности больше дать ребенку знаний, заполнить его «до краев». Задача взрослых: дать ребенку неограниченные возможности в жизни. А ребенок сам решит, кем ему быть во взрослой жизни.
И, к тому же, все, что вы вкладываете в первые годы, напрямую связано с физическим развитием.

——————-

Эта методика за 6 десятилетий использовалась в воспитании множества детей и завоевала уважение специалистов. Многие из исследователей развития детского мозга брали ее в качестве базы для своих работ. В результате появилось достаточно много практических материалов, которые современные родители могут использовать для своих занятий (это и комплекты «Букварь с пеленок», «Математика с пеленок», множество различных игр, пособий, наборы карточек).

Стоит заметить, что у методики появились и противники, по-разному обосновывающие свою «нелюбовь» к наработкам Домана.

В любом случае, родители сами должны принять решение, подходит ли методика для их малыша. Опираться надо на опыт, реакцию ребенка на занятия и на результаты, которые достигаются в ходе этих занятий.

Развивающие карточки Домана. Методика использования. Отзыв

Про методику Глена Домана в интернете написано очень много. В настоящее время рекламируется огромное количество разных развивающих методик для детей. Методика Домана вызывает очень неоднозначное отношение как педагогов, так и родителей. Одни считают, что не стоит учить малыша очень рано, он и сам всему научится когда придет время. Другие, наоборот, стараются научить годовалого ребенка чуть ли не читать и писать, считая, что таким образом воспитают гения во всех областях, при этом говоря окружающим, что только плохие родители не будут развивать своего ребенка.

Да и детские развивающие центры в своих программах опираются на чью-либо известную методику, привлекая к себе тем самым новых клиентов. Наслушавшись и начитавшись подобных заявлений, тебе уже начинает казаться, что если ты не развиваешь своего ребенка по какой-нибудь популярной программе, то ты не додаешь ему что-то.

Если кто не в курсе, то американский врач-физиотерапевт Глен Доман занимался разработкой восстанавливающих методик для детей c тяжелыми поражениями центральной нервной системы, а уже потом использовал свои знания для создания развивающих методик для обычных детей.

Если совсем коротко, то Доман показывая больным детям карточки с нарисованными на них точками, словами и картинками заставлял функционировать не пораженные клетки головного мозга ребенка.

Методика срабатывала и мозг больных детей начинал функционировать, развиваться. Дети начинали двигаться, говорить. Более того, занимаясь по методике Домана, многие из таких детей догоняли своих здоровых сверстников в интеллектуальном развитии. После этого, методику начали использовать и при обучении здоровых детей. Также согласно его методике, чем интенсивнее будет нагрузка на мозг малыша в первые годы его жизни, тем лучше разовьется его интеллект.

Еще недавно большинство родителей даже не пытались самостоятельно учить своих малышей, заниматься их развитие; однако, в настоящее время таких родителей все меньше и меньше. Все понимают: для того, чтобы преуспеть в жизни, поступить в престижный лицей, а далее университет, ребенку сейчас недостаточно быть обычным. Надо быть особенным, иметь разносторонний кругозор и значительный багаж знаний и навыков.

Я прочитала много отзывов про методику Домана прежде, чем купила его карточки. Его методика мне понравилась по нескольким причинам. Во-первых, она позволяет начать обучение ребенка чуть ли не с рождения (точнее с 3 месяцев). Во-вторых, требует минимальное количество времени, которого у молодых родителей хронически не хватает.

Кроме того, считаю, что нужно дать ребенку максимально возможный объем информации в разных областях, который ему возможно пригодится в современной жизни. Более того, если ребенок попробует себя в разных областях, ему будет проще выбрать то, что ему действительно нравится, определить свой дальнейший жизненный путь. Все дети любят узнавать новое, только иногда родители отбивают такую тягу.

После изучения методики Домана я поняла, что чем больше нагружать ребенка до 3 лет, то тем выше будет его интеллект в будущем.

Однако, начали мы поздно, с 10 месяцев. Я все никак не могла решиться. Честно говоря, я немного опасаюсь таких досрочных развивалок для малыша, мне кажется что это слишком рано. Хотя, безусловно, развивающие игры, в целом, полезны. Просто считаю, что всему — свое время.

Тем не менее, уже сейчас могу сказать, что занятия по методике Домана можно было начать и раньше. Я помню, что ребенок уже в 5 месяцев смотрел картинки в книжках и мультики, так почему бы ему не дать посмотреть карточки.

Наш первый набор карточек — это домашние животные. Впоследствии было еще куплено несколько наборов: дикие животные, транспорт, игрушки, фрукты, овощи, геометрические фигуры и т.д.

Немного о самих карточках — сами карточки картонные, фотографии достаточно качественные, все цвета яркие, фон светлый. Конечно все зависит от конкретного производителя. Сейчас такие карточки штампуют все кому не лень, поэтому конкретные картинки, как и качество материала самих карточек, может отличаться.

Изображения на карточках соответствуют определенной тематике (например, транспорт, игрушки, есть карточки на английском и т.д.). Цена не высокая, это плюсы. Теперь о минусах — картон на карточках тонкий. Но самое неприятное то, что некоторые картинки нарисованы настолько условно, что встретив в реальной джизни такой же предмет, ребенок вряд ли ассоциирует его с изображением ка карточке. Например, увидев в небе настоящий вертолет, ребенок может спросить: «А что это такое летит?»

На сайте Домана очень подробно рассказано как должно происходить обучение. Показывать карточку нужно малышу лишь короткое время, главная задача, чтобы ребенок обратил внимание на нее.

Показ карточки более длительное время может вызвать у ребенка потерю интереса. Показывать карточки нужно по нескольку штук, постепенно добавляя все новый материал и заменяя им старые. Лучше начинать со знакомой малышу тематики, которую он видит вокруг себя (домашние животные, овощи, фрукты, транспорт и т.п.).

В начале я старалась не давать карточки в руки ребенку, но через некоторое время все равно все карточки помялись. Отсюда совет — если есть возможность, то лучше обклеить карточки широким скотчем или специальной пленкой. В противном случае, через несколько занятий от них ничего не останется, особенно когда ребенок маленький. Что касается, папок для карточек, которые продает поставщик, то они не очень удачные, так как ребенок легко вынимает карточки из этих папок. Я вкладывала карточки в файл и заклеивала открытую сторону скотчем, но все равно от нашего первого набора мало что осталось:). Свои первые карточки Домана малыш измял и изжевал:)

В первое время мы не занимались по системе Домана так как нужно и как написано на его сайте. Я просто показывала карточки по теме домашние животные и называла их.

Потом давала карточки ребенку в руки и он их рассматривал сам. Потом карточки убирала. Так мы занимались пару-тройку раз в день.

Через некоторое время карточки поднадоели, хотя некоторых животных ребенок запомнил, мог их сам найти в наборе и пытался выговаривать названия, да и картинки на карточках ребенку нравились.

У нас не было задачи выучить карточки, просто это был дополнительный повод поиграть с ребенком. Если что-то запомнит, то хорошо. Самое первое время ребенок уставал долго смотреть на карточки. Посмотрит пару-тройку карточек и отвернется или разбросает их.

Изображения животных, геометрических фигур и транспорта нам нравятся больше чем фрукты и овощи. Ребенку нравится перебирать карточки, многие из них он уже озвучивает. Узнает предметы, изображенные на карточках не только дома, но и на улице.

Когда говорю «пошли смотреть карточки», он все бросает и бежит к месту где мы обычно занимаемся для новой порции знаний.

Карточки Домана можно изготовить самостоятельно, но они должны отвечать определенным требованиям. На карточке должно быть изображение одного предмета, а внизу крупными буквами подпись этого предмета или явления.

Все карточки объединяются по группам (растения, животные, окружающий мир, транспорт и т.п.). Если вы делаете карточки для использования этой методики самостоятельно, позаботьтесь о том, чтобы изображенные на них картинки, слова или цифры были большими и четкими. Если Вы заметили, что ребенок потерял интерес к игре, сразу же убирайте карточки и переключайтесь на что-то другое

Я занимаюсь с ребенком не целенаправленно, принудительно, а в игровой форме, главное, чтобы ребенку было интересно. Показывать карточки Домана нужно только в том случае, если ребенку это нравится. Не стоит насильно обучать ребенка, так вы только сформируете негативное отношение к процессу обучения.

Если не ставить сверхзадач, то перебирая и озвучивая карточки Домана можно здорово пополнить словарный запас своего ребенка, да и получить удовольствие от общения с ним, получая обратную связь. Все дети любят смотреть на яркие картинки, а карточки Домана именно такие, так что пусть смотрит на них и получает нужные знания об окружающем мире.

Ритм занятий я выбираю сама, ориентируюсь при этом только на реакцию и настроение ребенка. Если ему хочется остановится, то мы останавливаемся и ребенок просто рассматривает карточки. По Доману же карточки нужно показывать очень быстро, не задерживаясь и не давая их в руки ребенку. 

А вообще, только родителям решать стоит ли пользоваться этой методикой или нет. Тем более, что эту методику Домана, как и другие методики необязательно использовать в чистом виде, можно позаимствовать некоторые элементы из разных других наработок, лишь бы это было на пользу вашему малышу.

К сожалению не удалось получить какую-то информацию о том, что что дети, которые занимались по методике Домана стали выдающими людьми во взрослой жизни. авно как нельзя будет в будущем определенно сказать, что ваш ребенок преуспел только лишь благодаря карточкам Домана. Ведь вы же не только их используете для развития вашего малыша. Это эксперимент, плоды которого можно увидеть только спустя годы.

Я сделала свой выбор в пользу использования карточек Домана. Какой выбор сделаете вы, решать только вам самим. 

Приходите на этот сайт через 10 лет и я поделюсь результатами 🙂

Развивающие карточки Домана. Методика использования. Отзыв

Про методику Глена Домана в интернете написано очень много. В настоящее время рекламируется огромное количество разных развивающих методик для детей. Методика Домана вызывает очень неоднозначное отношение как педагогов, так и родителей. Одни считают, что не стоит учить малыша очень рано, он и сам всему научится когда придет время. Другие, наоборот, стараются научить годовалого ребенка чуть ли не читать и писать, считая, что таким образом воспитают гения во всех областях, при этом говоря окружающим, что только плохие родители не будут развивать своего ребенка.

Да и детские развивающие центры в своих программах опираются на чью-либо известную методику, привлекая к себе тем самым новых клиентов. Наслушавшись и начитавшись подобных заявлений, тебе уже начинает казаться, что если ты не развиваешь своего ребенка по какой-нибудь популярной программе, то ты не додаешь ему что-то.

Если кто не в курсе, то американский врач-физиотерапевт Глен Доман занимался разработкой восстанавливающих методик для детей c тяжелыми поражениями центральной нервной системы, а уже потом использовал свои знания для создания развивающих методик для обычных детей.

Если совсем коротко, то Доман показывая больным детям карточки с нарисованными на них точками, словами и картинками заставлял функционировать не пораженные клетки головного мозга ребенка.

Методика срабатывала и мозг больных детей начинал функционировать, развиваться. Дети начинали двигаться, говорить. Более того, занимаясь по методике Домана, многие из таких детей догоняли своих здоровых сверстников в интеллектуальном развитии. После этого, методику начали использовать и при обучении здоровых детей. Также согласно его методике, чем интенсивнее будет нагрузка на мозг малыша в первые годы его жизни, тем лучше разовьется его интеллект.

Еще недавно большинство родителей даже не пытались самостоятельно учить своих малышей, заниматься их развитие; однако, в настоящее время таких родителей все меньше и меньше. Все понимают: для того, чтобы преуспеть в жизни, поступить в престижный лицей, а далее университет, ребенку сейчас недостаточно быть обычным. Надо быть особенным, иметь разносторонний кругозор и значительный багаж знаний и навыков.

Я прочитала много отзывов про методику Домана прежде, чем купила его карточки. Его методика мне понравилась по нескольким причинам. Во-первых, она позволяет начать обучение ребенка чуть ли не с рождения (точнее с 3 месяцев). Во-вторых, требует минимальное количество времени, которого у молодых родителей хронически не хватает.

Кроме того, считаю, что нужно дать ребенку максимально возможный объем информации в разных областях, который ему возможно пригодится в современной жизни. Более того, если ребенок попробует себя в разных областях, ему будет проще выбрать то, что ему действительно нравится, определить свой дальнейший жизненный путь. Все дети любят узнавать новое, только иногда родители отбивают такую тягу.

После изучения методики Домана я поняла, что чем больше нагружать ребенка до 3 лет, то тем выше будет его интеллект в будущем.

Однако, начали мы поздно, с 10 месяцев. Я все никак не могла решиться. Честно говоря, я немного опасаюсь таких досрочных развивалок для малыша, мне кажется что это слишком рано. Хотя, безусловно, развивающие игры, в целом, полезны. Просто считаю, что всему — свое время.

Тем не менее, уже сейчас могу сказать, что занятия по методике Домана можно было начать и раньше. Я помню, что ребенок уже в 5 месяцев смотрел картинки в книжках и мультики, так почему бы ему не дать посмотреть карточки.

Наш первый набор карточек — это домашние животные. Впоследствии было еще куплено несколько наборов: дикие животные, транспорт, игрушки, фрукты, овощи, геометрические фигуры и т.д.

Немного о самих карточках — сами карточки картонные, фотографии достаточно качественные, все цвета яркие, фон светлый. Конечно все зависит от конкретного производителя. Сейчас такие карточки штампуют все кому не лень, поэтому конкретные картинки, как и качество материала самих карточек, может отличаться.

Изображения на карточках соответствуют определенной тематике (например, транспорт, игрушки, есть карточки на английском и т.д.). Цена не высокая, это плюсы. Теперь о минусах — картон на карточках тонкий. Но самое неприятное то, что некоторые картинки нарисованы настолько условно, что встретив в реальной джизни такой же предмет, ребенок вряд ли ассоциирует его с изображением ка карточке. Например, увидев в небе настоящий вертолет, ребенок может спросить: «А что это такое летит?»

На сайте Домана очень подробно рассказано как должно происходить обучение. Показывать карточку нужно малышу лишь короткое время, главная задача, чтобы ребенок обратил внимание на нее.

Показ карточки более длительное время может вызвать у ребенка потерю интереса. Показывать карточки нужно по нескольку штук, постепенно добавляя все новый материал и заменяя им старые. Лучше начинать со знакомой малышу тематики, которую он видит вокруг себя (домашние животные, овощи, фрукты, транспорт и т.п.).

В начале я старалась не давать карточки в руки ребенку, но через некоторое время все равно все карточки помялись. Отсюда совет — если есть возможность, то лучше обклеить карточки широким скотчем или специальной пленкой. В противном случае, через несколько занятий от них ничего не останется, особенно когда ребенок маленький. Что касается, папок для карточек, которые продает поставщик, то они не очень удачные, так как ребенок легко вынимает карточки из этих папок. Я вкладывала карточки в файл и заклеивала открытую сторону скотчем, но все равно от нашего первого набора мало что осталось:). Свои первые карточки Домана малыш измял и изжевал:)

В первое время мы не занимались по системе Домана так как нужно и как написано на его сайте. Я просто показывала карточки по теме домашние животные и называла их.

Потом давала карточки ребенку в руки и он их рассматривал сам. Потом карточки убирала. Так мы занимались пару-тройку раз в день.

Через некоторое время карточки поднадоели, хотя некоторых животных ребенок запомнил, мог их сам найти в наборе и пытался выговаривать названия, да и картинки на карточках ребенку нравились.

У нас не было задачи выучить карточки, просто это был дополнительный повод поиграть с ребенком. Если что-то запомнит, то хорошо. Самое первое время ребенок уставал долго смотреть на карточки. Посмотрит пару-тройку карточек и отвернется или разбросает их.

Изображения животных, геометрических фигур и транспорта нам нравятся больше чем фрукты и овощи. Ребенку нравится перебирать карточки, многие из них он уже озвучивает. Узнает предметы, изображенные на карточках не только дома, но и на улице.

Когда говорю «пошли смотреть карточки», он все бросает и бежит к месту где мы обычно занимаемся для новой порции знаний.

Карточки Домана можно изготовить самостоятельно, но они должны отвечать определенным требованиям. На карточке должно быть изображение одного предмета, а внизу крупными буквами подпись этого предмета или явления.

Все карточки объединяются по группам (растения, животные, окружающий мир, транспорт и т.п.). Если вы делаете карточки для использования этой методики самостоятельно, позаботьтесь о том, чтобы изображенные на них картинки, слова или цифры были большими и четкими. Если Вы заметили, что ребенок потерял интерес к игре, сразу же убирайте карточки и переключайтесь на что-то другое

Я занимаюсь с ребенком не целенаправленно, принудительно, а в игровой форме, главное, чтобы ребенку было интересно. Показывать карточки Домана нужно только в том случае, если ребенку это нравится. Не стоит насильно обучать ребенка, так вы только сформируете негативное отношение к процессу обучения.

Если не ставить сверхзадач, то перебирая и озвучивая карточки Домана можно здорово пополнить словарный запас своего ребенка, да и получить удовольствие от общения с ним, получая обратную связь. Все дети любят смотреть на яркие картинки, а карточки Домана именно такие, так что пусть смотрит на них и получает нужные знания об окружающем мире.

Ритм занятий я выбираю сама, ориентируюсь при этом только на реакцию и настроение ребенка. Если ему хочется остановится, то мы останавливаемся и ребенок просто рассматривает карточки. По Доману же карточки нужно показывать очень быстро, не задерживаясь и не давая их в руки ребенку. 

А вообще, только родителям решать стоит ли пользоваться этой методикой или нет. Тем более, что эту методику Домана, как и другие методики необязательно использовать в чистом виде, можно позаимствовать некоторые элементы из разных других наработок, лишь бы это было на пользу вашему малышу.

К сожалению не удалось получить какую-то информацию о том, что что дети, которые занимались по методике Домана стали выдающими людьми во взрослой жизни. авно как нельзя будет в будущем определенно сказать, что ваш ребенок преуспел только лишь благодаря карточкам Домана. Ведь вы же не только их используете для развития вашего малыша. Это эксперимент, плоды которого можно увидеть только спустя годы.

Я сделала свой выбор в пользу использования карточек Домана. Какой выбор сделаете вы, решать только вам самим. 

Приходите на этот сайт через 10 лет и я поделюсь результатами 🙂

Домен CARD — обзор

2.2 RIG-I-подобные рецепторы (RLR)

В отличие от TLR, RLR расположены в цитозольной фракции клеток млекопитающих и не отделены от своего молекулярного контекста какими-либо мембранными барьерами. RLR повсеместно экспрессируются в различных типах клеток млекопитающих, включая эпителиальные опухолевые клетки (Jensen and Thomsen, 2012; Kato et al., 2005; Ranoa et al., 2016). Активная функция RLR в опухолевых клетках и их рекрутирование в ответ на стресс впервые были продемонстрированы в 2014 г., когда Widau et al.использовали скрининг siRNA для идентификации LGP2 как критического супрессора летального ответа опухолевых клеток на ионизирующее излучение (Widau et al., 2014). Независимо, Boelens et al. продемонстрировали, что РНК-содержащие экзосомы, высвобождаемые стромальными фибробластами, активируют RIG-I в опухолевых клетках и модулируют их ответ на ИР (Boelens et al., 2014).

В нескольких превосходных подробных обзорах описаны биологические, структурные и биохимические свойства PRR нуклеиновых кислот, включая систему RLR (Akira et al., 2006; Диксит и Каган, 2013 г.; Палм и Меджитов, 2009; Роерс и др., 2016; Шли и Хартманн, 2016 г.; Ву и Чен, 2014). Таким образом, мы предоставляем только краткий обзор передачи сигналов RLR. RLR включают три геликазы бокс-РНК DExD/H (РНК-связывающие ферменты с консервативным мотивом Asp-Glu-любая аминокислота-Asp/His (DExD/H)), которые включают LGP2 (Лаборатория генетики и физиологии 2) или DHX58 (Cui et al., 2001), RIG-I (индуцируемый ретиноевой кислотой ген 1 или DDX58) и MDA5 (белок 5, ассоциированный с дифференцировкой меланомы, или IFIh2, или AGS7), которые принадлежат к суперсемейству 2 (SF2) РНК-хеликаз ( Синглтон и др., 2007). Все три белка содержат С-концевой домен (CTD) и РНК-хеликазные/АТФазные домены Hel1, Hel2i и Hel2 (см. рис. 1). RIG-I и MDA5 также содержат N-концевые домены активации и рекрутирования каспаз (домены CARD), ответственные за белок-белковые взаимодействия. Домены CARD используются активированными RIG-I и MDA5 для активации митохондриального противовирусного сигнального белка (MAVS, или IPS1, или VISA), который действует как адапторный белок для сенсоров RLR и инициирует передачу сигналов ниже по течению (Xu et al., 2014). Считается, что LGP2, который не содержит домена CARD, выполняет регуляторные функции, модулируя активность RIG-I и MDA5. Регуляторные свойства LGP2 связаны с его способностью взаимодействовать с белками TRAF ниже MAVS, тем самым подавляя передачу сигналов RLR/MAVS (Parisien et al., 2018). Одновременно LGP2 может положительно регулировать передачу сигналов MDA5 посредством инициации комплексов РНК-MDA5 (Bruns et al., 2014). В целом LGP2 подавляет RIG-I, но в контексте вирусной инфекции может активировать MDA5 в зависимости от типа вируса (Jensen and Thomsen, 2012; Schlee, 2013).Следовательно, RIG-I и MDA5 действуют как первичные сенсоры цитозольных РНК-лигандов, а LGP2 контролирует их активность.

В значительной степени рекрутирование RIG-I или MDA5 в ответ на вирусные или эндогенные РНК определяется типом и структурой активирующих РНК-лигандов и доступностью свободных 5′-концов РНК. RIG-I активируется относительно короткими двухцепочечными молекулами РНК (минимальная длина 10–19 п.н. и до 150–300 п.н.) с трифосфатными группами на 5′-конце (5’ppp) молекулы.Предпочтительные субстраты имеют 5′-тупые концы. Основываясь на кристаллической структуре РНК-связывающего кармана в С-концевом домене RIG-I (CTD), богатая лизином щель в положениях аминокислот 858–861 обеспечивает место стыковки с альфа-, бета- и гамма-фосфатными группами в 5′-конец лиганда дцРНК (Kolakofsky et al., 2012, Wang et al., 2010). Действительно, мутации RIG-I K858A-K861A уменьшали связывание RIG-I с короткими некодирующими эндогенными РНК и, следовательно, отменяли RIG-I-зависимую индукцию IFN-бета-ответа после ИР (Ranoa et al., 2016). Однако в нескольких сообщениях указывается, что удаление 5′-фосфатных групп фосфатазами снижает, но не полностью устраняет IFN-бета-индуцирующую активность различных типов РНК (Boelens et al., 2014, Chiappinelli et al., 2015, Ranoa et al., 2016). Дальнейшие сообщения показали, что RIG-I может также связывать 7mGppp модифицированные РНК с кэпированным 5’ppp концом (кэп 0) и может активироваться расщепленными РНКазой L РНК, которые содержат 5’OH концы (Malathi et al., 2007). В целом эти данные показывают, что RIG-I в первую очередь связывает свободные 5′-концы относительно коротких (19–300 п.н.) дцРНК.Наличие трифосфорилированных 5′-тупых концов может увеличивать аффинность связывания, но не является абсолютным требованием для связывания РНК-лигандов с RIG-I. Интересно, что некоторые РНК-лиганды могут подавлять активность RIG-I. Цзян и др. описали VSV-индуцированную IFN-зависимую активацию транскрипции днРНК lnc-Lsm3b на поздних стадиях вирусной инфекции. Этот РНК-лиганд содержит несколько внутренних структур «стебель-петля», которые связываются с несколькими молекулами RIG-I и, следовательно, конкурируют с РНК VSV, подавляя индуцированный RIG-I ответ IFN (Jiang et al., 2018).

В отличие от RIG-I, MDA5 внутренне взаимодействует с относительно длинными молекулами двухцепочечной РНК (> 2000 нуклеотидов) независимо от структуры свободных 5′-концов или с 5′-концами, связанными с другими РНК-связывающими белками. Возможно, отсутствие специфичности к концевым структурам в MDA5 связано с отсутствием упорядоченной кэпирующей петли, существующей в RIG-I CTD (Yin et al., 2015). Появление коротких цитоплазматических дцРНК со свободными 5′-концами может распознаваться RIG-I, в то время как длинные петли молекул РНК, обогащенные дц-структурами и потенциально связанные с другими РНК-связывающими белками на 5′-концах, могут распознаваться MDA5 (Bruns и другие., 2014; Шли и Хартманн, 2016).

Посттрансляционные модификации РНК-сенсоров могут подавлять их активность на базальном уровне, но активировать их в ответ на инфекцию или стрессовые стимулы. Такие модификации могут выступать в качестве важного механизма для предотвращения взаимодействия РНК-сенсоров с эндогенными РНК (Lassig and Hopfner, 2017; Xu et al., 2017b; Wu and Chen, 2014 и рис. 3). Эти посттрансляционные модификации (ПТМ) включают фосфорилирование серина/треонина и тирозина, полиубиквитинирование и ацетилирование.На базальном уровне и RIG-I, и MDA5 поддерживаются в неактивном состоянии за счет серин/треонинового фосфорилирования доменов CARD и CTD. Для RIG-I это фосфорилирование осуществляется протеинкиназами PKCα/β и CKII (Gack et al., 2010; Maharaj et al., 2012). Киназы, ответственные за фосфорилирование MDA5, не идентифицированы. Фосфорилирование защищает RIG-I/MDA5 от полиубиквитинирования, связанного с K63, которое необходимо для активации этих сенсоров и их связывания с MAVS (Gack, 2014; Xu et al., 2017б; Ву и Чен, 2014). Кроме того, ацетилирование Lys-909 при CTD RIG-I предотвращает взаимодействие Lys-907 с 5’ppp dsRNA, тем самым подавляя активацию RIG-I (Choi et al., 2016). Следовательно, активация RLR инициируется дефосфорилированием доменов CARD и домена CTD протеинфосфатазой 1 и, по крайней мере, для RIG-I, деацетилированием домена CTD гистоновой деацетилазой 6 (HDAC6; см. рис. 3 и Choi et al., 2016). ; Gack, 2014; Lassig and Hopfner, 2017; Maharaj et al., 2012; Wies et al., 2013). Дальнейшие этапы активации связаны с K63-связанным полиубиквитинированием CTD с помощью убиквитинлигазы E3 Riplet (Oshiumi et al., 2009, 2010), которая индуцирует «открытую» конформацию, позволяющую связываться с РНК, и дальнейшее K63-связанное полиубиквитинирование домена CARD2 с помощью трехчастного мотива. содержащие убиквитинлигазу Е3 TRIM25 (Gack et al., 2007). Последнее приводит к образованию тетрамеров RIG-I, которые взаимодействуют с MAVS через домены CARD. Эти взаимодействия вызывают прионоподобную олигомеризацию молекул MAVS во внешней мембране митохондрий и активацию MAVS-зависимой передачи сигналов вниз по течению (см.2). Такая надежная система PTM, предотвращающая активацию RIG-I/MDA5, служит механизмом контроля, защищающим клетки от ошибочного распознавания собственных РНК RLR. Автоингибиторные конформации, препятствующие активации РНК-сенсоров на базальном уровне, по-видимому, являются общим правилом для различных РНК-сенсоров. NLRP3, PKR и OAS/RNASEL существуют в самоингибирующихся мономерных конформациях, и начальные этапы их активации связаны с разворачиванием и олигомеризацией (см. ниже и рис. 2).

Рис.3. Посттрансляционные модификации RIG-I . Активация RIG-I инициируется дефосфорилированием доменов CARD и домена CTD протеинфосфатазой 1 (PP1α/γ) и деацетилированием домена CTD гистондеацетилазой 6 (HDAC6). Дальнейшие этапы активации связаны с K63-связанным полиубиквитинированием CTD с помощью убиквитинлигазы E3 Riplet, которая индуцирует «открытую» конформацию, позволяющую связываться с РНК, и дальнейшее K63-связанное полиубиквитинирование домена CARD2 с помощью трехчастного мотива, содержащего убиквитинлигазу E3 TRIM25 (Gack et al., 2007). Последнее приводит к образованию тетрамеров RIG-I, которые взаимодействуют с MAVS через домены CARD. Эти взаимодействия индуцируют прионоподобную олигомеризацию молекул MAVS во внешней мембране митохондрий и активацию MAVS-зависимой нисходящей передачи сигналов (см. рис. 2).

Нисходящая передача сигналов от MAVS перекрывается с сигнальными путями, активируемыми РНК-зависимыми TLRs (см. рис. 2), но механически инициируется другими событиями (Vazquez and Horner, 2015). MAVS содержит три взаимодействующих с TRAF мотива (TIM) в своем домене PRR и рядом с доменами TM (см.1) (Лю и др., 2013). Начальная активация MAVS-зависимой передачи сигналов связана с привлечением убиквитинлигаз E3 TRAF2/5 и TRAF6, которые взаимодействуют с MAVS через TIM и инициируют K63-сцепленное полиубиквитинирование привлеченных TRAF (см. Fig. 2 and Paz et al., 2011). Это полиубиквитинирование, связанное с K63, дополнительно рекрутирует NEMO/IKKγ посредством своих убиквитин-связывающих доменов (Liu et al., 2013). В свою очередь, иммобилизованный NEMO приводит к рекрутированию и активации TBK1, IKKα и IKKβ, что в конечном итоге приводит к активации NFkB- и IRF3-зависимых путей (см.2). Подобно передаче сигналов TLR, MAVS-зависимые пути приводят к активации передачи сигналов IFN I типа и индуцированных NFkB провоспалительных цитокинов. В отличие от передачи сигналов TLR, передача сигналов MAVS не задействует путь MAPK/JNK.

Домены рекрутирования каспаз для белковых взаимодействий в клеточной передаче сигналов (обзор)

Int J Mol Med. 2019 март; 43(3): 1119–1127.

Факультет фармации, Колледж фармацевтики, Университет Чун-Анг, Сеул 06974, Республика Корея

Адрес для корреспонденции: Д-р Пак Хён Хо, Факультет фармацевтики, Колледж фармацевтики, Университет Чунг-Анг, 84 Хеуксок Роуд, Тонджак, Сеул 06974, Республика Корея, E-mail: [email protected]

Поступила в редакцию 10 августа 2018 г.; Принято 9 января 2019 г.

Эта статья была процитирована другими статьями в PMC.

Abstract

Домен рекрутирования каспазы (CARD), хорошо известный модуль белкового взаимодействия, принадлежит к суперсемейству доменов смерти (DD), которое включает DD, эффекторные домены смерти и пириновые домены. Суперсемейство DD опосредует белковые взаимодействия, необходимые для апоптоза и сигнальных путей иммунных клеток. Среди этих доменов широко изучался CARD, поскольку он опосредует важные клеточные сигнальные события, связанные с различными заболеваниями человека, включая рак, нейродегенеративные заболевания и иммунные нарушения.Взаимодействия CARD-CARD гомотипа и гетеротипа опосредуют образование больших сигнальных комплексов, включая комплексы, активирующие каспазы, и нижележащие сигнальные комплексы. В настоящем обзоре обобщены и обсуждены результаты структурных исследований различных КАРД и их комплексов. Эти исследования проливают свет на механизмы, которые контролируют сборку и разборку сигнальных комплексов, и обеспечивают лучшее понимание клеточных сигнальных процессов.

Ключевые слова: воспаление, апоптоз, суперсемейство доменов смерти, домен рекрутирования каспаз

1.Введение

Небольшой домен взаимодействия с белком, состоящий примерно из 90 аминокислот, домен рекрутирования каспазы (CARD) функционирует в белок-белковых взаимодействиях при апоптозе, воспалении и врожденной клеточной передаче сигналов (1-3). CARD с доменом смерти (DD), эффекторным доменом смерти (DED) и пириновым доменом (PYD) известен как суперсемейство DD, которое является одним из самых больших семейств модулей взаимодействия белков (4-6). CARD и нарушение CARD-опосредованных белковых взаимодействий считаются терапевтическими мишенями для рака (7).У млекопитающих было идентифицировано около 33 CARD-содержащих белков, кодируемых различными генами, в том числе несколькими членами семейства каспаз, и различными внутриклеточными сигнальными белками, которые функционируют в сигнальных путях апоптоза, некроза, врожденного иммунитета и воспаления (5,8). ). Репрезентативными CARD-содержащими белками в передаче сигналов апоптоза являются фактор активации апоптотической протеазы-1 (Apaf-1) и белок, ассоциированный с серин/треонин-протеинкиназой (RIP), взаимодействующей с рецептором, с DD (RAIDD) (9-11).Они опосредуют активацию каспазы, а CARD Apaf-1 и RAIDDD имеют решающее значение для образования комплексов, активирующих каспазы (12,13). Среди двух различных классов каспаз, инициаторных каспаз (включая каспазы-2, -8, -9 и -10) и эффекторных каспаз (включая каспазы-3, -6 и -7), инициаторные каспазы активируются через близость- опосредованный процесс самоактивации. Близость каспаз-инициаторов индуцируется образованием огромных молекулярных комплексов (14-16). Апоптосома, представляющая собой молекулярный комплекс, необходимый для активации каспазы-9, образована Apaf-1, который содержит CARD (17,18).CARD Apaf-1 взаимодействует с CARD каспазы-9 с образованием апоптосомы (19, 20). Для образования опухолевого белка p53 (p53), индуцированного белка с DD (PIDD)осомой, которая известна как платформа активации каспазы-2, CARD-содержащий RAIDD взаимодействует с CARD-содержащей каспазой-2 через CARD-CARD. взаимодействие (21,22). После апоптоза, вызванного повреждением ДНК, каспаза-2 рекрутируется в PIDD, который является индикатором стресса, содержащим DD, с помощью RAIDD (9, 23). Таким образом, PIDDosome формируется опосредованным суперсемейством DD взаимодействием PIDD, RAIDD и caspase-2 (23,24).Подобно CARD-содержащим белкам, связанным с апоптозом, несколько CARD-содержащих белков функционируют в иммунной системе. К ним относятся ген I, индуцируемый ретиноевой кислотой (RIG-I), RIP2, CARD-содержащий белок 9 (CARD9), член семейства доменов рекрутирования каспазы 11 (CARMA1) и В-клеточная лимфома/лейкемия 10 (BCL10) (25). Для правильного функционирования В- и Т-клеток во время врожденного и адаптивного иммунитета активация ядерного фактора каппа-легкой цепи активированных В-клеток (NF-kB) через Т-клеточный рецептор (TCR) и В-клеточный рецептор (BCR) сигнальные события являются критическими.В ранних случаях TCR и BCR-опосредованной активации NF-kB в иммунных клетках сигналосома CARMA1, которая состоит из CARD-содержащего CARMA1, белка 1 транслокации лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистой оболочкой, и дополнительного CARD-содержащего BCL10, формируется посредством CARD-опосредованных взаимодействий. Каркасный белок CARMA1, член семейства ассоциированных с мембраной гуанилаткиназ, содержит CARD (25,26). BCL10 также содержит CARD на N-конце. Взаимодействие CARD-CARD между CARMA1 и BCL10 критично для сборки сигналосом CARMA1 (27).Дополнительная сигналосома, сигналосома CARD9, представляет собой первичный сигнальный молекулярный комплекс, который играет ключевую роль в иммунных клетках, в частности, в активации NF-kB в миелоидных клетках (28-30). CARD9 представляет собой CARD-содержащий белок. Структура N-конца CARD9 аналогична структуре CARMA1. Для сборки сигналосомы CARD9 адаптерный белок BCL10, который содержит CARD на N-конце, взаимодействует с CARD9 посредством взаимодействия CARD-CARD (30-33). При активации миелоидных клеток рецепторы, связанные с активационным мотивом на основе иммунорецептора и тирозина, включая дектин-1, запускающий рецептор, экспрессируемый на миелоидных клетках, и Fc-рецепторы, которые способны ощущать сигналы опасности, а затем передают сигнал для формирования стабильной сигнальной цепи CARD9. некоторый комплекс, который активирует NF-κB и МАРК (28,30).Белки CARD-only (COP) были идентифицированы как регуляторы врожденного иммунитета и передачи сигналов воспаления (34). Эти белки могут ингибировать сборку рецепторных комплексов, подобных нуклеотид-связывающему домену олигомеризации (NOD), включая инфламмасому и NODosome, которые являются критическими молекулярными комплексами для активации каспазы-1 (35-37). Известно, что COP взаимодействуют либо с CARD каспазы-1, либо с CARD RIP2 посредством взаимодействия CARD-CARD (38,39). Всего в геноме человека было идентифицировано 3 COP, фермент, превращающий псевдоинтерлейкин-1 бета, ингибирующий CARD и CARD18 (ICEBERG) (34).Несколько ингибиторов апоптоза, в том числе репрессор апоптоза с CARD (ARC), также содержат CARD (40,41). ARC может ингибировать сборку индуцирующего гибель сигнального комплекса с последующей активацией каспазы путем связывания с Fas-ассоциированным белком с помощью DD (FADD) DD, Fas DD и каспазы-8 DED с использованием CARD (42-44). Этот белок также ингибирует тетрамеризацию р53 и функцию р53 (45). ARC является молекулярной мишенью для терапевтического вмешательства против рака и гепатоцеллюлярного некроза (46-48).

CARD-содержащие белки и структура CARD.(A) доменная граница репрезентативных CARD-содержащих белков. (B) Выравнивание последовательности селективных CARD. Вторичные структуры CARD показаны над соответствующей последовательностью. (C) Репрезентативная структура CARD, образованная 6 спиральными пучками. Ленточная схема Апаф-1 КАРД. Цепь от N- до C-концов окрашена в синий или красный цвет. Спирали помечены. (D) Атипичная структура CARD, образованная 5 спиральными пучками. Ленточная схема карты ARC CARD. CARD, домен рекрутирования каспазы; DD, домен смерти; PYD, пириновый домен; Apaf-1, фактор активации апоптотической протеазы-1; ARC, репрессор апоптоза с CARD; DARK, убийца, связанный с дрозофилой Apaf-1; NOD1/2, нуклеотидсвязывающий домен олигомеризации, содержащий белок 1/2; CED-3/4, белок клеточной гибели 3/4; RIG-I, индуцируемый ретиноевой кислотой ген I; MDA5, интерферон-индуцированный белок 1, содержащий С-домен хеликазы; ASC, связанный с апоптозом пятнистый белок, содержащий CARD; NALP1, NACHT, богатый лейцином повтор и белок 1, содержащий домены PYD; CARMA1, член 11 семейства доменов рекрутирования каспаз; касп-9, каспаза 9; MAVS, митохондриальный противовирусный сигнальный белок; АЙСБЕРГ, КАРТА18; RIP2, серин/треонин-протеинкиназа 2, взаимодействующая с рецептором; BCL-10, В-клеточная лимфома/лейкемия 10.

Учитывая, что суперсемейство DD, в частности CARD, опосредует важные клеточные сигнальные пути, которые связаны с различными заболеваниями человека, включая рак, нейродегенеративные заболевания и иммунные расстройства, исследования CARD-опосредованных белковых взаимодействий и передачи сигнала имеют большое биологическое значение. значение. Структурные исследования CARD и его гетеро- и гомотипных комплексов проводились в течение предыдущего десятилетия, чтобы понять роль CARD и то, как он опосредует клеточную передачу сигналов.В результате были выяснены структуры нескольких CARD и их комплексов, включая недавно описанную филаментоподобную структуру (49). В настоящем обзоре обобщается и обсуждается текущее понимание структуры и функции CARD в путях апоптоза и иммунных сигнальных путях.

2. Структура CARD

Существует два типа CARD-содержащих белков: каспазы, которые содержат CARD в качестве продомена на N-конце, и каркасные адапторные белки, необходимые для сборки сигнальных комплексов (1,5 ).В настоящее время определены ядерно-магнитный резонанс (ЯМР) и кристаллические структуры 5 и 10 CARD-содержащих белков соответственно, представляющих каждый из этих двух типов. Структуры ЯМР включают ассоциированный с апоптозом пятнистый белок, содержащий CARD (ASC) CARD (50), BCL10 CARD (27), клеточный ингибитор белка апоптоза 1 CARD (51), RAIDD CARD (24) и ICEBERG (39). . Доступны кристаллические структуры для Apaf-1 CARD (52,53), белка CARD, взаимодействующего с BCL10 (BinCARD) (54), CARD8 (55), каспазы-9 (53), митохондриального противовирусного сигнального белка (MAVS) CARD (56). ), нуклеотидсвязывающий домен, семейство богатых лейцином повторов, пириновый домен, содержащий 1 (NLRP1) CARD (57), NOD-содержащий белок 1 (NOD1) CARD (58), RIG-I CARD (59), CARD11 (60) и КАРТА ДУГА (61).Идентичность последовательностей среди CARD составляет 13-25% ().

CARD принимают консервативную складку пучка из 6 спиралей, которая является общей структурной особенностью суперсемейства DD (2,5). Хотя CARD демонстрирует консервативную складку пучка из 6 спиралей, изогнутая или разорванная спираль h2 является уникальной особенностью структуры CARD (8). Примечательно, что недавно выявленная структура ARC CARD показала измененную форму типичной DD-складки (60). ARC CARD содержит складку пучка из 5 спиралей (h2-H5) вместо пучка из 6 спиралей () (42,61), при этом спираль H6 неупорядочена и отсутствует в структуре.Это говорит о том, что H6 в КАРТЕ не нужен для его функции, и даже для функции суперсемейства DD (). Основываясь на программе прогнозирования вторичной структуры, аминокислотная последовательность области H6 в ARC CARD не является типичной спиральной последовательностью, поддерживающей текущую структуру, в которой H6 не существует в ARC CARD и заменена аминокислотной последовательностью. вместо этого петля. Эта нетипичная структура ARC CARD является первым случаем, идентифицированным среди суперсемейства DD.И наоборот, структурное исследование ARC CARD также показало типичные структурные особенности CARD: он содержит короткую спираль h4, а пучок спиралей от h2 до H5 упакован центральным гидрофобным ядром, что делает структуру компактной и стабильной (61). . По сравнению с другими доменами суперсемейства DD, структурная жесткость в результате образования гидрофобного кластера в ядре ARC CARD и более короткий h4 являются общими характеристиками CARD (61). Эти особенности карты ARC CARD могут иметь решающее значение для функций ARC.В будущих исследованиях следует изучить связь между отсутствующим H6 в ARC CARD и способностью ARC приспосабливаться к различным партнерам по связыванию, включая FADD, каспазу-8 и ассоциированный с Bcl-2 белок X.

3. Структурное сравнение с другими CARD

Поиск Dali (62), сервер поиска структурной гомологии, показывает, что репрезентативная ARC CARD в высокой степени гомологична другим CARD. NOD1, BinCARD, NLRP1, Apaf-1, ICEBERG, CARMA1, RIG-I и RAIDD были идентифицированы как структурно гомологичные белки.Явные структурные различия и сходство между ARC CARD и этими другими CARD были обнаружены путем структурного сравнения с использованием парного структурного выравнивания (). КАРТА NOD1 была идентифицирована как КАРТА, которая может быть лучше всего наложена на КАРТУ ARC. Примечательно, что NOD1 CARD также имеет нетипичную структуру, в которой H6 связан с H5 и образует одну вытянутую длинную спираль (H5-H6). Эта нетипичная спираль H6, демонстрирующая динамическую природу H6, является примечательной особенностью карт ARC и NOD1 (10).Относительно более длинная спираль h2 также идентифицирована в ARC CARD. Структурное выравнивание также показало изогнутую спираль h2 во всех CARD, что указывает на то, что изогнутая спираль h2 является общим признаком. Хотя все CARD хорошо наложены друг на друга для h2-H5, наложение всех 9 CARD показало, что длина и ориентация нескольких спиралей различаются среди разных доменов (10).

Структурное сравнение CARD. (A) Структуры всех CARD наложены друг на друга. Попарные структурные сравнения (B) NOD1, (C) BinCARD, (D) NLRP1, (E) Apaf-1, (F) ICEBERG, (G) CARMA1, (H) RIG-1 и (I) RAIDD с ARC.CARD, домен рекрутирования каспазы; NOD1, нуклеотидсвязывающий домен олигомеризации, содержащий белок 1; BinCARD, белок CARD, взаимодействующий с B-клеточной лимфомой/лейкемией 10; NLRP1, нуклеотид-связывающий домен, пириновый домен семейства богатых лейцином повторов, содержащий 1; Apaf1, фактор активации апоптотической протеазы-1; АЙСБЕРГ, КАРТА18; CARMA1, член 11 семейства доменов рекрутирования каспаз; RIG-I, индуцируемый ретиноевой кислотой ген I; RAIDD, взаимодействующий с рецептором серин/треонин-протеинкиназа-ассоциированный белок с DD; ARC, репрессор апоптоза с CARD.

4. Димерные взаимодействия CARD

Гетеродимерная структура комплекса CARD:CARD, указывающая на механизм сборки апоптосомы, необходимой для активации каспазы-9, была обеспечена кристаллической структурой комплекса между Apaf-1 CARD и каспаза-9 CARD (63) (). Эта структура была первой структурой, которая демонстрировала интерфейс взаимодействия белков члена суперсемейства DD. Структура комплекса CARD указывала на взаимное узнавание вогнутой поверхности CARD каспазы-9 и выпуклой поверхности CARD Apaf-1.Первичная сила взаимодействия обусловлена ​​огромным количеством солевых мостиков, образованных между положительно заряженными спиралями h2 и h5 в домене каспазы-9 и отрицательно заряженными спиралями h3 и h4 в домене Apaf-1. Всего 3 положительно заряженных остатка, R13, R52 и R56 в домене каспазы-9 взаимодействуют с 2 отрицательно заряженными остатками, D27 и E40. Эта ионная природа взаимодействия Apaf-1 CARD: Caspase-9 CARD считалась типичным взаимодействием надсемейства DD, пока не была выяснена новая структура комплекса DD: Park et al. (64) продемонстрировали первую структуру высокоолигомерный комплекс DD, который вводит 3 новых типа взаимодействий (типы I, II и III) на 6 уникальных интерфейсах (типы Ia, Ib, IIa, IIb, IIIa и IIIb) (65).Затем на основе этой структуры было установлено, что комплекс CARD каспазы-9/Apaf-1 CARD образован взаимодействием типа I (63). Участие спиралей h2 и h5 в CARD каспазы-9, типичной поверхности типа Ia, и спиралей h3 и h4 в CARD Apaf-1, типичной поверхности типа Ib, подтверждает гипотезу о том, что CARD/Apaf каспазы-9 Комплекс -1 CARD образован взаимодействием типа I. В отличие от DD и DED, для которых было проведено несколько исследований, неясно, могут ли CARD также самоассоциироваться.При полноразмерном структурном исследовании с использованием электронной микроскопии выяснилось, что Apaf-1 CARD образует действительно интересную новую структуру генного комплекса вблизи центра апоптосомы, с полноразмерной каспазой-9 или без нее (66). Однако также были описаны мономерные формы CARD Apaf-1, что указывает на то, что CARD или, по крайней мере, те, которые присутствуют с NOD олигомеризации и в продоменах каспаз, не обладают способностью стабильно самоассоциироваться, и вместо этого в первую очередь участвуют во взаимодействии с другими CARD.Jang et al (61) представили первую гомодимерную структуру CARD в 2015 г. в ходе структурного исследования ARC CARD. До этого структурного исследования предполагалась димеризация ARC посредством CARD (43). Антиапоптотическая функция ARC отменяется CARD-опосредованной димеризацией. Хотя димеризация CARD была предложена в ряде исследований, эта структура ARC CARD была первой структурой, которая продемонстрировала прямое доказательство гомодимерного взаимодействия CARD (4,60,65).Способ взаимодействия гомодимера ARC был почти идентичен способу взаимодействия гетеродимерного комплекса, образованного между CARD каспазы-9 и Apaf-1. Положительно заряженные аминокислотные остатки h2 и h5 одной молекулы ARC CARD образуют взаимодействия заряд-заряд с отрицательно заряженными h3 и h4 другой молекулы CARD (63). Среди 3 различных типов взаимодействий, обнаруженных в гетерокомплексе DD между доменом RAIDD DD и доменом PIDD DD, этот способ взаимодействия классифицируется как взаимодействие типа I (6,64).Всего в асимметричной единице было обнаружено 2 асимметричных димера ARC CARD (). Остатки D13, R56, R59 и R60 одной молекулы ARC CARD образуют массивные солевые мостики и водородные связи с остатками D32, R37, E46 и D49 другой молекулы ARC CARD (). Дополнительная молекулярная основа для гомодимеризации CARD была обнаружена структурными исследованиями интерфейса CARMA1 CARD (60). В частности, в отличие от ARC CARD, 2 CARMA1 CARD в асимметричной единице образуют симметричный димер. Примечательно, что на интерфейсе взаимодействия присутствует ограниченное количество сил взаимодействия.Первичными силами взаимодействия для этого гомодимера CARD были электростатическое взаимодействие между остатком h41 из одной CARMA1 CARD и остатком E27 из другой CARMA1 CARD, а также дисульфидная связь, образованная C28 в каждой молекуле. Спирали h2 в 2 CARD CARMA1 были связаны этой дисульфидной связью (). Это было первое исследование, которое продемонстрировало опосредованную дисульфидными связями гомодимеризацию CARD (60).

Типовые характеристики димерного интерфейса КАРТЫ. (A) Прототип гетеродимерного интерфейса взаимодействия CARD-CARD, который был введен в результате структурного исследования комплекса, образованного CARD каспазы-9 и Apaf-1.(B) Возможные типы взаимодействия, сформированные DDS. (C) Прототип гомодимерного интерфейса взаимодействия CARD-CARD, который был представлен структурным исследованием гомодимерной структуры ARC CARD. Детали интерфейса визуализированы в мельчайших деталях. Остатки интерфейса, которые участвуют в формировании интерфейса, представлены палочками, а образовавшиеся массивные солевые мостики представлены красными пунктирными линиями. CARD, домен рекрутирования каспазы; Apaf-1, фактор активации апоптотической протеазы-1; DDS, суперсемейство доменов смерти; ARC, репрессор апоптоза с CARD.

Необычная гомодимерная структура CARD. Атипичное гомодимерное взаимодействие было введено при структурном исследовании CARMA1 CARD. Детали интерфейса визуализированы в мельчайших деталях. В увеличенном окне показаны остатки, участвующие в контакте. CARD, домен рекрутирования каспазы; CARMA1, член семейства доменов рекрутирования каспаз 11.

5. Сборка CARD, подобная олигомерным филаментам

Заметный механизм олигомеризации в гетерокомплексах CARD был недавно выявлен в результате структурного исследования комплекса RIG-I и MAVS (49,67) .Эта структура была первой, демонстрирующей спиральную сборку CARD, аналогичную ранее решенной структуре комплекса DD. В этом исследовании были продемонстрированы 2 олигомерные формы CARD: гомотетрамер и филаментоподобная структура (67). Тандемные CARD в RIG-I образуют тетрамер в растворе, что приводит к взаимодействию MAVS CARD и образованию филаментов (1). В общей сложности 3 известных типа взаимодействий, а именно Ia:Ib, IIa:IIb и IIIa:IIIb, опосредуют сборку олигомера CARD.Это структурное исследование ясно продемонстрировало, что поверхности одного MAVS CARD взаимодействуют с поверхностями домена CARD2 в тандемном комплексе RIG-I CARDs, используя все типы взаимодействия, которые были идентифицированы для комплекса DD, а именно тип I, тип II, и тип III. Основываясь на структуре тандемных CARD RIG-I и комплекса MAVS CARDs, авторы предложили «модель стопорной шайбы», в которой RIG-I образует тандемный тетрамер CARD, названный «стопорная шайба»; это вызывает образование нити MAVS CARD, которая запускает нисходящую передачу сигналов.Хотя несколько исследований показали, что CARD-содержащие белки могут образовывать филаментоподобные структуры посредством взаимодействий CARD-CARD (27,68), эта структура была первой, демонстрирующей филаментоподобные структуры CARD (66). В результате структурного исследования MAVS CARD было установлено, что 1 CARD взаимодействует с двумя соседними MAVS CARD посредством взаимодействий типа I, II и III. Филаментоподобная структура, образованная MAVS CARD, состоит из одноцепочечной спирали с левым вращением () (49). Электростатические и гидрофобные взаимодействия были идентифицированы в гомодимерных взаимодействиях внутри филамента (49).Аминокислотные остатки R37, D40, R41, A44 и L48 в одной MAVS CARD взаимодействуют с остатками R52, D53, G50 и L48 во второй MAVS CARD, образуя типичное взаимодействие типа III. Аминокислотные остатки R43 и W56 участвуют во взаимодействии типа I. Аминокислотные остатки R37, R41, R65 и R64 в одном MAVS CARD и N21, D23 и E26 во втором MAVS CARD участвуют в формировании взаимодействия типа II. Этот тип спиральной и филаментоподобной структуры был впервые идентифицирован при структурном исследовании комплекса DD, включая PIDDosome (5, 64) ().

Спиральная нитевидная сборка CARD. (A) Спиральная сборка RIG-I CARD и MAVS CARD. Тандемный CARD RIG-I, образующий тетрамер, функционирует как каркас для сборки MAVS. (B) вид сверху и (C) сбоку спиральной сборки MAVS CARD. Структурное исследование карт MAVS CARD выявило филаментоподобную сборку. Левосторонняя спиральная филаментообразная сборка была образована тремя типичными типами взаимодействий суперсемейства DD. (D) Вид сверху и (E) сбоку первой спиральной сборки суперсемейства DD, которая была представлена ​​структурным исследованием гетероолигомерного DD-комплекса RAIDD DD и PIDD DD.CARDs, домен рекрутирования каспазы; RIG-1, индуцируемый ретиноевой кислотой ген I; MAVS, митохондриальный противовирусный сигнальный белок; DD, домен смерти; RAIDD, взаимодействующий с рецептором серин/треонин-протеинкиназа-ассоциированный белок с DD; PIDD, опухолевой белок, индуцированный p53, с DD.

6. Будущие перспективы

У человека идентифицировано около 33 CARD-содержащих белков. Из-за важности их роли в различных сигнальных путях эти CARD-содержащие белки и сам CARD интенсивно изучались.CARD является вторым по величине подсемейством среди суперсемейства DD, которое включает DD, DED и PYD. Взаимодействия CARD-CARD гомотипа и гетеротипа опосредуют образование огромных сигнальных комплексов, включая комплексы, активирующие каспазы, и расположенные ниже по течению сигнальные комплексы, во время клеточного процесса передачи сигналов. Понимание структур и функций CARD-содержащих белков быстро прогрессировало. Основываясь на своей структуре и функциях, CARD-содержащие белки можно разделить на две подгруппы; те, у кого есть про-домен в каспазе, и те, что в нижележащих сигнальных молекулах.Хотя все CARD обладают низкой идентичностью последовательностей, CARD принимают типичные структурные особенности суперсемейства DD с пучком из 6 спиралей. Единственная отличительная черта CARD состоит в том, что спираль h2 имеет тенденцию изгибаться или разбиваться на отдельные спирали h2a и h2b. Дополнительным свойством CARD является образование ядра гидрофобного кластера, соединяющего все 6 спиралей. Недавно в результате структурного исследования ARC CARD была выявлена ​​нетипичная структура CARD (61). Типичные гомотипические взаимодействия между CARD происходят посредством взаимодействий заряд-заряд, что впервые было продемонстрировано при структурном исследовании комплекса caspase-9/Apaf-1 (63).Чтобы понять актуальность механизма CARD-опосредованного комплексообразования и нижестоящих сигнальных путей, важно исследовать механизм олигомеризации CARD-содержащих белков. Димеризация CARD представляет собой один из простых методов олигомеризации, который может включать гетеро- и гомодимеризацию. Например, Apaf-1 и каспаза-9 образуют гетеродимерную структуру через интерфейс типа I. Недавно в результате структурных исследований CARMA1 и ARC CARD было выявлено 2 различных метода гомодимеризации (60,61).В частности, CARMA1 CARD димеризуется через межмолекулярную дисульфидную связь, чего не наблюдалось ни у одного другого члена суперсемейства DD. Этот новый метод олигомеризации требует дополнительного более подробного изучения, чтобы понять роль димеризации, опосредованной дисульфидными связями, во внутриклеточных сигнальных путях. Способ взаимодействия гомодимера ARC подобен способу взаимодействия гетеродимерного комплекса, образованного между CARD каспазы-9 и Apaf-1. В каждом из этих случаев спирали h2 и h5 в одной молекуле CARD взаимодействуют со спиралями h3 и h4 во второй молекуле CARD, главным образом посредством взаимодействий заряд-заряд.

Недавнее структурное исследование комплекса RIG-I и MAVS предполагает, что CARD в RIG-I могут образовывать тетрамер, который создает стадию для MAVS CARD для построения левозакрученной одноцепочечной спиральной нити (67). Было показано, что взаимодействие между первым и вторым CARD в RIG-I стабилизирует тандемный тетрамер CARD (59, 67). Такая структура MAVS CARD и тандемного комплекса RIG-1 CARD указывала на то, что для сборки филамента используются все три типа взаимодействий, а именно тип I, тип II и тип III, а расположение поверхностей типа I, II и III на КАРТЫ аналогичны таковым на комплексе ДД.Кроме того, было показано, что комплементарность поверхности и заряда важна для специфичности связывания при образовании PIDDosome. Таким образом, особенности поверхности CARD, включая кислотные, основные и гидрофобные пятна, в дополнение к форме поверхности, могут быть важны для конкретных взаимодействий CARD-CARD. Структуры гомофиламентов также были продемонстрированы с помощью криоэлектронной микроскопии структурных исследований каспазы-1, ASC и NLRC4 CARD (69,70). Эти исследования продемонстрировали формирование канонической сборки спиральных нитей с использованием типичных взаимодействий типа I, типа II и типа III.

Выяснение механизмов, которые контролируют сборку и разборку сигнальных комплексов, важно для понимания клеточных сигнальных процессов. В настоящем обзоре подчеркивается универсальная роль CARD, ограниченные структуры комплексов CARD и димерная или спиральная сборка CARD. Используют ли др. CARD-содержащие сигнальные комплексы сходные механизмы для сборки комплексов, это важная тема для будущих исследований.

Благодарности

Автор хотел бы поблагодарить Mr.Чан Мин Ким за помощь в изготовлении фигурок.

Финансирование

Настоящее исследование было поддержано Программой фундаментальных научных исследований через Национальный исследовательский фонд Кореи Министерства образования, науки и технологий (№ гранта NRF-2017M3A9D8062960 и NRF-2018R1A2B2003635) и грантом Кореи Проект исследований и разработок в области медицинских технологий, Министерство здравоохранения и социального обеспечения, Республика Корея (грант № HI17C0155).

Доступность данных и материалов

Все данные, полученные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в эту опубликованную статью.

Вклад авторов

HHP задумал и разработал исследование, провел поиск литературы и написал рукопись.

Одобрение этики и согласие на участие

Неприменимо.

Согласие пациента на публикацию

Неприменимо.

Конкурирующие интересы

Автор заявляет об отсутствии конкурирующих интересов в данном исследовании.

Ссылки

2. Hofmann K, Bucher P, Tschopp J. Домен CARD: новый сигнальный мотив апоптоза.Тенденции биохимических наук. 1997; 22: 155–156. doi: 10.1016/S0968-0004(97)01043-8. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]3. Kao WP, Yang CY, Su TW, Wang YT, Lo YC, Lin SC. Разносторонние роли CARD в регуляции апоптоза, воспаления и передачи сигналов NF-κB. Апоптоз. 2015;20:174–195. doi: 10.1007/s10495-014-1062-4. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]4. Bae JY, Park HH. Кристаллическая структура пиринового домена белка NALP3 (PYD) и ее роль в сборке воспалительных заболеваний. Дж. Биол. Хим. 2011; 286:39528–39536.doi: 10.1074/jbc.M111.278812. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]5. Park HH, Lo YC, Lin SC, Wang L, Yang JK, Wu H. Суперсемейство доменов смерти во внутриклеточной передаче сигналов апоптоза и воспаления. Энн Рев Иммунол. 2007; 25: 561–586. doi: 10.1146/annurev.immunol.25.022106.141656. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]6. Парк ХХ. Структурный анализ доменов смерти и их взаимодействия. Апоптоз. 2011;16:209–220. doi: 10.1007/s10495-010-0571-z. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]7.Дамиано Дж.С., Рид Дж.С. Белки CARD как терапевтические мишени при раке. Curr Цели наркотиков. 2004; 5: 367–374. doi: 10.2174/1389450043345470. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]8. Kwon D, Yoon JH, Shin SY, Jang TH, Kim HG, So I, Jeon JH, Park HH. Обширная база данных белок-белковых взаимодействий для надсемейства доменов смерти. Нуклеиновые Кислоты Res. 2012;40:D331–D336. doi: 10.1093/nar/gkr1149. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]9. Дуан Х, Диксит ВМ. RAIDD — это новая молекула адаптера «смерти».Природа. 1997; 385:86–89. doi: 10.1038/385086a0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 11. Ахмад М., Шринивасула С.М., Ван Л., Таланян Р.В., Литвак Г., Фернандес-Алнемри Т., Алнемри Э.С. CRADD, новая молекула апоптотического адаптера человека для каспазы-2, и белок RIP, взаимодействующий с рецептором фактора некроза опухоли FasL. Рак рез. 1997; 57: 615–619. [PubMed] [Google Scholar] 12. Denault JB, Salvesen GS. Каспазы: ключи к зажиганию клеточной смерти. Chem Rev. 2002; 102:4489–4500. doi: 10.1021/cr010183n. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 13.Донепуди М., Груттер М.Г. Структура и зимогенная активация каспаз. Биофиз хим. 2002; 101–102: 145–153. doi: 10.1016/S0301-4622(02)00151-5. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 14. Людвиг-Галезовска А.Х., Фланаган Л., Рем М. Репрессор апоптоза с доменом рекрутирования каспазы, многофункциональный модулятор клеточной гибели. J Cell Mol Med. 2011;15:1044–1053. doi: 10.1111/j.1582-4934.2010.01221.x. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]16. Салвесен Г.С., Диксит В.М. Каспазы: внутриклеточная передача сигналов путем протеолиза.Клетка. 1997; 91: 443–446. doi: 10.1016/S0092-8674(00)80430-4. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 17. Адамс Дж. М., Кори С. Апоптосомы: механизмы активации каспазы. Curr Opin Cell Biol. 2002; 14: 715–720. doi: 10.1016/S0955-0674(02)00381-2. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 18. Поп С., Тиммер Дж., Сперандио С., Салвесен Г.С. Апоптосома активирует каспазу-9 путем димеризации. Мол Ячейка. 2006; 22: 269–275. doi: 10.1016/j.molcel.2006.03.009. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 19. Acehan D, Jiang X, Morgan DG, Heuser JE, Wang X, Akey CW.Трехмерная структура апоптосомы: значение для сборки, связывания прокаспазы-9 и активации. Мол Ячейка. 2002; 9: 423–432. doi: 10.1016/S1097-2765(02)00442-2. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 20. Yu X, Acehan D, Menetret JF, Booth CR, Ludtke SJ, Riedl SJ, Shi Y, Wang X, Akey CW. Структура апоптосомы человека при разрешении 12,8 A дает представление об этой платформе гибели клеток. Структура. 2005; 13: 1725–1735. doi: 10.1016/j.str.2005.09.006. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 22.Manzl C, Krumschnabel G, Bock F, Sohm B, Labi V, Baumgartner F, Logette E, Tschopp J, Villunger A. Активация каспазы-2 в отсутствие образования PIDDosome. Джей Селл Биол. 2009; 185: 291–303. doi: 10.1083/jcb.200811105. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]23. Tinel A, Tschopp J. PIDDosome, белковый комплекс, участвующий в активации каспазы-2 в ответ на генотоксический стресс. Наука. 2004; 304: 843–846. doi: 10.1126/science.1095432. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 24. Чоу Дж., Мацуо Х., Дуан Х., Вагнер Г.Структура решения RAIDD CARD и модель взаимодействия CARD/CARD при наборе каспазы-2 и каспазы-9. Клетка. 1998; 94: 171–180. doi: 10.1016/S0092-8674(00)81417-8. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 25. Gaide O, Martinon F, Micheau O, Bonnet D, Thome M, Tschopp J. Carma1, CARD-содержащий связывающий партнер Bcl10, индуцирует фосфорилирование Bcl10 и активацию NF-kappaB. ФЭБС лат. 2001; 496:121–127. doi: 10.1016/S0014-5793(01)02414-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 26. Бертин Дж., Ван Л., Го И., Якобсон М.Д., Пойет Д.Л., Шринивасула С.М., Мерриам С., ДиСтефано П.С., Алнемри Э.С.CARD11 и CARD14 представляют собой новые члены семейства домена рекрутирования каспазы (CARD)/мембран-ассоциированной гуанилаткиназы (MAGUK), которые взаимодействуют с BCL10 и активируют NF-каппа B. J Biol Chem. 2001; 276:11877–11882. doi: 10.1074/jbc.M010512200. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 27. Qiao Q, Yang C, Zheng C, Fontan L, David L, Yu X, Bracken C, Rosen M, Melnick A, Egelman EH, Wu H. Структурная архитектура сигналосомы CARMA1/Bcl10/MALT1: индуцированная нуклеацией нитевидная сборка. Мол Ячейка. 2013; 51: 766–779.doi: 10.1016/j.molcel.2013.08.032. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]28. Хара Х., Исихара С., Такеучи А., Иманиши Т., Сюэ Л., Моррис С.В., Инуи М., Такай Т., Шибуя А., Сайдзё С. и др. Адаптерный белок CARD9 необходим для активации миелоидных клеток через ITAM-ассоциированные и Toll-подобные рецепторы. Нат Иммунол. 2007; 8: 619–629. дои: 10.1038/ni1466. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 29. Hsu YM, Zhang Y, You Y, Wang D, Li H, Duramad O, Qin XF, Dong C, Lin X. Адаптерный белок CARD9 необходим для врожденного иммунного ответа на внутриклеточные патогены.Нат Иммунол. 2007; 8: 198–205. дои: 10.1038/ni1426. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 30. Hara H, Saito T. CARD9 против CARMA1 во врожденном и адаптивном иммунитете. Тренды Иммунол. 2009; 30: 234–242. doi: 10.1016/j.it.2009.03.002. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 31. Урен А.Г., О’Рурк К., Аравинд Л.А., Писабарро М.Т., Сешагири С., Кунин Э.В., Диксит В.М. Идентификация паракаспаз и метакаспаз: два древних семейства каспазоподобных белков, одно из которых играет ключевую роль в MALT-лимфоме. Мол Ячейка. 2000; 6: 961–967.[PubMed] [Google Scholar] 32. Lucas PC, Yonezumi M, Inohara N, McAllister-Lucas LM, Abazeed ME, Chen FF, Yamaoka S, Seto M, Nunez G. Bcl10 и MALT1, независимые мишени хромосомной транслокации при солодовой лимфоме, сотрудничают в новом NF-каппа B сигнальный путь. Дж. Биол. Хим. 2001; 276:19012–19019. doi: 10.1074/jbc.M009984200. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 33. Thome M. CARMA1, BCL-10 и MALT1 в развитии и активации лимфоцитов. Нат Рев Иммунол. 2004; 4: 348–359. дои: 10.1038/nri1352.[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 35. Мартинон Ф., Бернс К., Чопп Дж. Инфламмасома: молекулярная платформа, запускающая активацию воспалительных каспаз и обработку проИЛ-бета. Мол Ячейка. 2002; 10: 417–426. doi: 10.1016/S1097-2765(02)00599-3. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 37. Franchi L, Eigenbrod T, Munoz-Planillo R, Nunez G. Инфламмасома: платформа активации каспазы-1, которая регулирует иммунные реакции и патогенез заболевания. Нат Иммунол. 2009; 10: 241–247. дои: 10.1038/ni.1703.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]38. Ли С.Х., Стелик С., Рид Дж.С. Cop, белок, содержащий домен рекрутирования каспазы, и ингибитор процессинга активации каспазы-1. Дж. Биол. Хим. 2001; 276:34495–34500. doi: 10.1074/jbc.M101415200. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 39. Хамке Э.В., Шрайвер С.К., Старовасник М.А., Фэйрбратер В.Дж., Диксит В.М. ICEBERG: новый ингибитор генерации интерлейкина-1бета. Клетка. 2000; 103:99–111. doi: 10.1016/S0092-8674(00)00108-2. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]40.Абмайр С., Кроуфорд Р.В., Чемберлен Дж.С. Характеристика ARC, репрессора апоптоза, взаимодействующего с CARD, в нормальных скелетных мышцах и скелетных мышцах с дефицитом дистрофина. Хум Мол Жене. 2004; 13: 213–221. doi: 10.1093/hmg/ddh018. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]41. Koseki T, Inohara N, Chen S, Nunez G. ARC, ингибитор апоптоза, выраженный в скелетных мышцах и сердце, который избирательно взаимодействует с каспазами. Proc Natl Acad Sci USA. 1998; 95: 5156–5160. doi: 10.1073/pnas.95.9.5156. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]42.Ха HJ, Пак HH. Молекулярная основа влияния мутации L31F на функцию CARD в ARC. ФЭБС лат. 2017;591:2919–2928. дои: 10.1002/1873-3468.12783. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]43. Нам Ю.Дж., Мани К., Эштон А.В., Пэн С.Ф., Кришнамурти Б., Хаякава Ю., Ли П., Корсмейер С.Дж., Китсис Р.Н. Ингибирование как внешних, так и внутренних путей смерти посредством негомотипных взаимодействий с гибелью. Мол Ячейка. 2004; 15: 901–912. doi: 10.1016/j.molcel.2004.08.020. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]44.Парк ХХ. Молекулярную основу димеризации инициаторной каспазы выявила кристаллическая структура продомена каспазы-8. Смерть клеток 2018 11 сентября; doi: 10.1038/s41418-018-0200-x. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]45. Foo RS, Nam YJ, Ostreicher MJ, Metzl MD, Whelan RS, Peng CF, Ashton AW, Fu W, Mani K, Chin SF, et al. Регуляция тетрамеризации p53 и ядерного экспорта с помощью ARC. Proc Natl Acad Sci USA. 2007;104:20826–20831. doi: 10.1073/pnas.0710017104. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]46.An J, Mehrhof F, Harms C, Lattig-Tunnemann G, Lee SL, Endres M, Li M, Sellge G, Mandic AD, Trautwein C, Donath S. ARC представляет собой новый терапевтический подход к ацетаминофен-индуцированному гепатоцеллюлярному некрозу. J Гепатол. 2013; 58: 297–305. doi: 10.1016/j.jhep.2012.10.002. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]47. Мерсье И., Вуоло М., Жасмин Д.Ф., Медина К.М., Уильямс М., Мариадасон Д.М., Цянь Х., Сюэ Х., Пестелл Р.Г., Лисанти М.П., ​​Китсис Р.Н. ARC (репрессор апоптоза с доменом рекрутирования каспазы) является новым маркером рака толстой кишки человека.Клеточный цикл. 2008; 7: 1640–1647. doi: 10.4161/cc.7.11.5979. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]48. Mercier I, Vuolo M, Madan R, Xue X, Levalley AJ, Ashton AW, Jasmin JF, Czaja MT, Lin EY, Armstrong RC, et al. ARC, супрессор апоптоза, ограниченный терминально дифференцированными клетками, индуцируется при раке молочной железы человека и придает химио- и радиационную устойчивость. Смерть клеток 2005; 12: 682–686. doi: 10.1038/sj.cdd.4401631. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]49. Xu H, He X, Zheng H, Huang LJ, Hou F, Yu Z, de la Cruz MJ, Borkowski B, Zhang X, Chen ZJ, Jiang QX.Структурная основа прионоподобных филаментов MAVS в противовирусном врожденном иммунитете. Элиф. 2014;3:e01489. doi: 10.7554/eLife.01489. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]50. de Alba E. Структура и междоменная динамика ассоциированного с апоптозом пятнистого белка, содержащего CARD (ASC) J Biol Chem. 2009; 284:32932–32941. doi: 10.1074/jbc.M109.024273. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]51. Лопес Дж., Джон С.В., Тенев Т., Ротуро Г.Дж., Хайндс М.Г., Франкаланчи Ф., Уилсон Р., Бромер М., Санторо М.М., Дэй С.Л., Мейер П.Опосредованное CARD аутоингибирование активности лигазы E3 cIAP1 подавляет пролиферацию и миграцию клеток. Мол Ячейка. 2011;42:569–583. doi: 10.1016/j.molcel.2011.04.008. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]52. Shiozaki EN, Chai J, Shi Y. Олигомеризация и активация каспазы-9, индуцированная CARD apaf-1. Proc Natl Acad Sci USA. 2002; 99: 4197–4202. doi: 10.1073/pnas.072544399. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]53. Чжоу П., Чоу Дж., Олеа Р.С., Юань Дж., Вагнер Г. Структура раствора Apaf-1 CARD и его взаимодействие с каспазой-9 CARD: структурная основа для специфического взаимодействия адаптер/каспаза.Proc Natl Acad Sci USA. 1999;96:11265–11270. doi: 10.1073/pnas.96.20.11265. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]54. Чен К.Э., Ричардс А.А., Карадок-Дэвис Т.Т., Ваджхала П.Р., Робин Г., Луа Л.Х., Хилл Дж.М., Шредер К., Свит М.Дж., Келли С. и др. Структура домена рекрутирования каспазы в BinCARD показывает, что все три цистеина могут быть окислены. Acta Crystallogr D Биол Кристаллогр. 2013; 69: 774–784. doi: 10.1107/S0

4913001558. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]55. Цзинь Т., Хуан М., Смит П., Цзян Дж., Сяо Т.С.Структура домена рекрутирования каспазы CARD8 предполагает его ассоциацию с доменом FIIND и прокаспазы через соседние поверхности. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 2013; 69: 482–487. doi: 10.1107/S1744309113010075. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]56. Поттер Дж. А., Рэндалл Р. Е., Тейлор Г. Л. Кристаллическая структура рекрутингового домена активации каспазы IPS-1/MAVS/VISA/Cardif человека. BMC Struct Biol. 2008;8:11. doi: 10.1186/1472-6807-8-11. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]57.Джин Т., Карри Дж., Смит П., Цзян Дж., Сяо Т.С. Структура домена рекрутирования каспазы NLRP1 указывает на потенциальные механизмы его ассоциации с прокаспазой-1. Белки. 2013;81:1266–1270. doi: 10.1002/прот.24287. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]58. Manon F, Favier A, Nunez G, Simorre JP, Cusack S. Структура раствора NOD1 CARD и мутационный анализ его взаимодействия с CARD нижестоящей киназы RICK. Дж Мол Биол. 2007; 365: 160–174. doi: 10.1016/j.jmb.2006.09.067.[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]59. Феррадж Ф., Датта К., Нистал-Виллан Э., Патель Дж. Р., Санчес-Апарисио М.Т., Де Иоаннес П., Буку А., Асегинолаза Г.Г., Гарсия-Састре А., Аггарвал А.К. Структура и динамика второй CARD человеческого RIG-I обеспечивают механистическое понимание регуляции активации RIG-I. Структура. 2012;20:2048–2061. doi: 10.1016/j.str.2012.09.003. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]60. Jang TH, Пак JH, Пак HH. Новая димеризация домена CARD, опосредованная дисульфидными связями, была обнаружена с помощью кристаллической структуры CARMA1 CARD.ПЛОС Один. 2013;8:e79778. doi: 10.1371/journal.pone.0079778. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]61. Jang TH, Kim SH, Jeong JH, Kim S, Kim YG, Park HH. Кристаллическая структура рекрутирующего домена каспазы (CARD) репрессора апоптоза с CARD (ARC) и его роль в ингибировании апоптоза. Научн. отп. 2015; 5:9847. doi: 10.1038/srep09847. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]62. Холм Л., Сандер С. Дали: сетевой инструмент для сравнения структуры белков. Тенденции биохимических наук.1995; 20: 478–480. doi: 10.1016/S0968-0004(00)89105-7. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]63. Цинь Х., Шринивасула С.М., Ву Г., Фернандес-Алнемри Т., Алнемри Э.С., Ши Ю. Структурная основа рекрутирования прокаспазы-9 фактором, активирующим апоптозную протеазу 1. Природа. 1999; 399: 549–557. дои: 10.1038/21124. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]64. Park HH, Logette E, Rauser S, Cuenin S, Walz T, Tschopp J, Wu H. Механизм сборки домена смерти, выявленный кристаллической структурой олигомерного основного комплекса PIDDosome.Клетка. 2007; 128: 533–546. doi: 10.1016/j.cell.2007.01.019. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]65. Coussens NP, Mowers JC, McDonald C, Nunez G, Ramaswamy S. Кристаллическая структура домена активации и рекрутирования каспазы Nod1. Biochem Biophys Res Commun. 2007; 353:1–5. doi: 10.1016/j.bbrc.2006.11.122. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]67. Peisley A, Wu B, Xu H, Chen ZJ, Hur S. Структурная основа опосредованной убиквитином активации противовирусного сигнала с помощью RIG-I. Природа.2014; 509:110–114. doi: 10.1038/nature13140. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]68. Сигель Р.М., Мартин Д.А., Чжэн Л., Нг С.И., Бертин Дж., Коэн Дж., Ленардо М.Дж. Нити эффектора смерти: новые цитоплазматические структуры, которые задействуют каспазы и запускают апоптоз. Джей Селл Биол. 1998; 141:1243–1253. doi: 10.1083/jcb.141.5.1243. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]69. Li Y, Fu TM, Lu A, Witt K, Ruan J, Shen C, Wu H. Крио-ЭМ-структуры нитей ASC и NLRC4 CARD раскрывают единый механизм зарождения и активации каспазы-1.Proc Natl Acad Sci USA. 2018;115:10845–10852. doi: 10.1073/pnas.1810524115. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]70. Lu A, Li Y, Schmidt FI, Yin Q, Chen S, Fu TM, Tong AB, Ploegh HL, Mao Y, Wu H. Молекулярная основа полимеризации каспазы-1 и ее ингибирование новым механизмом блокировки. Nat Struct Mol Biol. 2016; 23:416–425. doi: 10.1038/nsmb.3199. [Статья бесплатно PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Кристаллическая структура рекрутирующего домена каспазы (CARD) репрессора апоптоза с CARD (ARC) и его роль в ингибировании апоптоза

Кристаллическая структура ARC CARD

ARC ингибирует как внутренний, так и внешний пути апоптоза посредством взаимодействия с различными белками, связанными с апоптозом, включая Fas, FADD и каспазу-8 (рис.1А). Известно, что домен ARC CARD препятствует формированию DISC посредством прямого взаимодействия с Fas DD, FADD DD и DED каспазы-8 (Fig. 1A) 29 .

Кристаллическая структура 2,4 Å домена CARD ARC (ARC CARD) была решена с использованием метода одноволновой аномальной дифракции (SAD) и уточнена до R work 17,0 % и R free 20,0 %. . Структура ARC CARD с высоким разрешением показала, что она состоит из пяти спиралей, от h2 до H5, что не является типичной складкой суперсемейства DD (рис.1Б). Интересно, что шестая спираль (H6) не была обнаружена в типичном месте, что указывает на то, что H6 может быть гибким в домене CARD ARC или вместо этого принимать петлевую структуру. В асимметричном звене было два мономера, цепь А и цепь В (рис. 1С). Модель цепи A была построена от остатка 5 до остатка 87 и остатка 91 до остатка 93, а модель цепи B была построена от остатка 5 до остатка 84. Предполагаемый H6 (от остатка 88 до 93) не мог быть смоделирован из-за плохая карта электронной плотности (рис.1Б). Каждый мономер был почти идентичен и накладывался на RMSD 0,5 Å (дополнительная рис. 1). Хотя сообщалось об экстраординарной форме H6 домена CARD со структурой NOD1 CARD, это первое сообщение, показывающее, что H6 не существует в домене CARD. Аминокислотная последовательность области H6 ARC CARD не является типичной спиральной последовательностью по сравнению с последовательностями других CARD (рис. 1D). Предполагаемая область H6 в ARC CARD (PDPAWDWQH) была предсказана как случайная спиральная петля на основе программы предсказания вторичной структуры, что указывает на то, что H6 не существует в ARC CARD и вместо этого был заменен петлей.Эта атипичная структура домена CARD является первым случаем, наблюдаемым среди надсемейства доменов смерти. Длина h4 была короче, чем у других спиралей, что является общей характеристикой суперсемейства доменов смерти. N- и C-концы ARC CARD находятся на одной стороне молекулы. Пучок спирали от h2 до H5 был плотно упакован центральным гидрофобным ядром, состоящим из I12, V20, L23, L30, L31, L34, L35, L40, L48, V58, L61, L62, L64, V65, L76 и L77 (рис. 1Е). Остатки, спрятанные внутри ядра, образующие гидрофобный кластер ARC CARD, плохо консервативны, но являются наиболее распространенными среди различных CARD, что указывает на то, что ARC CARD может быть одним из наиболее компактных и стабильных белков среди надсемейства доменов смерти (рис.1Д). Высокая компактность и упорядоченность карты ARC CARD проявляется в низком среднем B-факторе, равном 57,9 Å 2 (таблица 1).

Таблица 1 Статистические данные по сбору и уточнению данных

Структурная жесткость центральной части ARC CARD и предположительно неупорядоченная область H6 ARC CARD являются отличительными чертами, которые могут иметь решающее значение для функций ARC, которые опосредованы различными взаимодействующими белками, включая рецептор TNF, FADD, BAD и BAX. ARC CARD является единственным членом суперсемейства доменов смерти, который может взаимодействовать с различными подсемействами внутри суперсемейства, а также с белками семейства Bcl-2.Связь между способностью ARC приспосабливаться к различным партнерам по связыванию и неупорядоченным H6 с жестким ядром ARC CARD должна быть исследована в будущих исследованиях.

Интерфейс димера в ARC CARD

Эксклюзионная хроматография и многоугловое рассеяние света (MALS) показали, что изолированный ARC CARD ведет себя в растворе как димер (рис. 2А). Расчетная молекулярная масса мономера ARC CARD, включая С-концевую His-метку, составила 11,763 Да, а расчетная молекулярная масса из MALS составила 21.901 Да (ошибка подбора 0,9 %), с полидисперсностью 1000 (рис. 2А). Было предположено, что ARC может образовывать гомо-димер через CARD и что CARD-опосредованная димеризация ARC отменяет его антиапоптотический потенциал 29 . Наша кристаллическая структура также поддерживает димерную форму ARC CARD в растворе. Димеризация суперсемейства доменов смерти, включающего CARD, неудивительна, поскольку многие исследования показали, что суперсемейство DD может быть гомодимеризовано в растворе 24,33,34 .Гомодимерная структура ARC CARD дает интересное представление о гомодимерных интерфейсах. Две ARC CARD в асимметричной единице упакованы как асимметричный димер с интерфейсом, состоящим в основном из электростатического взаимодействия (рис. 2В). Общая поверхность димера составляет 916 Å 2 (площадь поверхности мономера 458 Å 2 ), что составляет 9% площади поверхности димера. Основными силами взаимодействия являются солевые мостики и водородные связи, которые образованы D13 (на h2), R56 (на h5), R59 (на h5) и R60 (h5) из цепи А и D32 (на h3), R37 (на h3). на h3), E46 (на h4) и D49 (на h4) из цепочки B (рис.2Б). В периферийной области D13 на h2 и R60 на h5 цепи A образуют солевые мостики с R37 на h3 и E46 на h4 цепи B соответственно. В центральной области интерфейса R56 и R59 на h5 цепи A образуют солевые мостики с D49 на h4 цепи B. R59 цепи A также способствует образованию солевого мостика с D32 на h3 цепи B. Режим взаимодействия гомодимера ARC подобен гетеродимерному комплексу между каспазой-9 CARD и APAF-1 CARD в том, что h2 и h5 одной молекулы CARD взаимодействуют с h3 и h4 другой молекулы CARD, в основном, через заряд- зарядовые взаимодействия 35 .Этот тип взаимодействия относится к взаимодействию типа I среди трех типов взаимодействий, обнаруженных в суперсемействе доменов смерти 14,25 . Хотя сообщалось об уникальной гомодимерной структуре домена CARD, опосредованной дисульфидными связями, включая NOD1 и CARMA1 33,34 , текущая структура ARC CARD была димеризована через интерфейс типа I, что является новым методом для гомо -димерная структура CARD.

Рисунок 2

Димерный интерфейс структуры ARC CARD.

A. Профиль многоуглового светорассеяния (MALS). Красная линия указывает экспериментальную молекулярную массу. B. Крупный план взаимодействующих остатков на границе раздела двух мономеров. Спирали помечены, а остатки, участвующие в контакте, показаны палочками. Соляные мостики показаны пунктирными линиями.

Чтобы проанализировать новую гомодимерную структуру ARC CARD, образованную сильными электростатическими взаимодействиями, мы провели эксклюзионную хроматографию и эксперименты MALS в присутствии соли с высоким содержанием соли (1.5 М NaCl) и низком рН (рН 3), что приводило к протонированию карбоксилатов и нарушению заряженных взаимодействий. Как и ожидалось, ARC CARD стал мономером в условиях с высоким содержанием соли и низким pH (рис. 3A и дополнительные рис. 2A и 2B). Поскольку D49, R56 и R59 идентифицированы как критические остатки для образования этого нового интерфейса, мы также провели исследование мутагенеза для анализа интерфейса. Каждый остаток (D49, R56 и R59) мутировали до противоположных зарядов и использовали для эксклюзионной хроматографии и экспериментов MALS.Как показано на фиг. 3В, пик элюции дикого типа, наблюдаемый при эксклюзионной хроматографии, был перемещен в мономерное место в результате мутации. Молекулярные массы, определенные с помощью MALS, и ожидаемая стехиометрия при различных условиях представлены на рис. 3С. Необработанные данные для MALS также показаны на дополнительном рисунке 2. Эксклюзионная хроматография и эксперимент MALS показали, что димерный ARC CARD стал мономером за счет мутаций интерфейсного остатка D49R, R56E и R59E и двойных мутантов (рис.3B и 3C и дополнительный рис. 2). Изменения олигомеризации в ответ на мутации подтверждали с помощью нативного ПААГ. Сдвиг полосы вниз из-за мутаций указывает на то, что димерный ARC CARD стал мономерным в растворе в ответ на мутации (рис. 3D). Генерация полосы со сдвигом вверх при мутации D49R была неожиданным исключением, которое, как мы полагаем, произошло в ответ на изменения заряда, вызванные мутагенезом. Поскольку сдвинутые или новые полосы на нативном ПААГ являются хорошими индикаторами разрушения или образования белкового комплекса, полоса, генерируемая D49R, все еще может быть мономерной полосой.Другая возможность заключается в том, что D49R образует димер во время концентрирования. При высокой концентрации слабо разрушенный мутант D49R в растворе становился димером. Поскольку двойной мутант, D49R, R59E, генерировал мономерную полосу (Fig. 3D), D49R может быть недостаточно для нарушения заряженных взаимодействий. Чтобы подтвердить, что нарушение димера мутациями не было результатом неожиданных структурных изменений, вызванных мутагенезом, а скорее результатом специфических мутаций, которые могут нарушить димерную границу раздела, мы оценили круговой дихроичный (CD) спектр в дальнем УФ (дополнительный рис.С3). Спектры КД демонстрируют типичные α-спиральные белки с двумя ярко выраженными минимумами при 208 и 222 нм и максимумами при 195 нм, что сходно со спектром дикого типа и хорошо соответствует молекулярной структуре других членов суперсемейства DD 90–117. 36 . Эти результаты подтвердили, что нарушение димеризации ARC CARD вызвано специфическим мутагенезом, как и ожидалось, а не неожиданными структурными изменениями, образующимися в результате мутагенеза.

Рисунок 3

Анализ интерфейса, образованного гомодимером ARC CARD.

A. Профиль эксклюзионной хроматографии для условий с высоким содержанием солей и низким pH. B. Профиль эксклюзионной хроматографии различных мутаций. C. Высокое содержание солей, низкий рН и влияние мутаций на образование димеров. Показаны измеренная молекулярная масса и ожидаемая стехиометрия. D. Родная страница. Wt указывает на дикий тип.

Взятые вместе, ARC CARD образует гомодимер в растворе, как и ожидалось, что было показано в предыдущем эксперименте in vivo 29 , и эта димеризация опосредована взаимодействием типа I с высокозаряженными взаимодействиями, обнаруженными в других взаимодействиях надсемейства доменов смерти и взаимодействия гетеродимерных доменов CARD.Поскольку эта гомодимеризация ARC CARD вызвала потерю ингибирующей активности ARC, возможно, что ARC CARD использует этот гомодимерный интерфейс для взаимодействия с другими белками. Выявление интерфейса взаимодействия белков, обнаруженного в нашем текущем исследовании, необходимо для определения функции ARC.

Сравнение с другими структурами CARD

Поиск структурной гомологии с DALI 37 показал, что ARC CARD очень похож на другие CARD. Восемь лучших матчей с Z-оценкой 13.с 8 по 7,7 были NOD1, BinCARD, NLRP1, APAF-1, ICEBERG, CARMA1, RIG1 и RAIDD (таблица 2). Наложение всех девяти CARD показало, что структуры всех CARD хорошо накладываются от h2 до H5, за исключением H6, который даже не был обнаружен в структуре ARC CARD (рис. 4А). H6 карты NOD1 подключен к H5 и не перекручен. H6 большинства CARD плотно упакован в центральном пучке, в то время как H6 CARD NLRP1 расположен далеко от центрального пучка (рис. 4А).

Таблица 2 Поиск структурного сходства с использованием DALI Рисунок 4

Наложение ARC CARD на его структурные гомологи.

A. ARC CARD (зеленый цвет) и восемь структурных гомологов накладываются друг на друга. Б-И. Попарное структурное сравнение. ARC CARD зеленый, а каждая копия синего цвета для NOD1 (B), красного для BinCARD (C), голубого для NLRP1 (D), пурпурного для APAF-1 (E), голубого для ICEBERG (F), фиолетового для CARMA1 ( G), серый для RIG1 (H) и черный для RAIDD (I).

Парное структурное выравнивание между ARC CARD и этими другими CARD показало явные структурные различия и сходства (рис. 4B-G). CARD, лучше всего наложенная на ARC CARD, была NOD1.Обладание атипичным H6 было интересной особенностью ARC CARD и NOD1 CARD (рис. 4B), в то время как h2 ARC CARD был длиннее, чем у других CARD. Судя по остаткам фрагментов ARC CARD, расположение предполагаемого H6 аналогично местоположению H6 NLRP1 (рис. 4D). Заметные различия в H6 указывают на динамическую природу H6 среди различных CARD. Изогнутый h2, обнаруженный во всех структурах CARD, включая текущую ARC CARD, также является интересной особенностью, которая была обнаружена только в структуре CARD.

ARC CARD имеет такие же общие характеристики электростатической поверхности, как и другие карты. Например, подобно заряженной природе большинства других CARD, поверхность ARC CARD также состоит из смеси положительно и отрицательно заряженных элементов. Заряженные кластеры расположены на границе раздела гомодимерного комплекса. Поскольку CARD являются модулями взаимодействия белков, особенности их поверхности определяют способ их взаимодействия с партнерами. Основываясь на анализе электростатической поверхности ARC CARD, можно было бы использовать это заряженное взаимодействие для образования гомо- или гетеродимерных комплексов.

Консервативная поверхность ARC CARD: потенциальное место взаимодействия с Fas DD и FADD DD для ингибирования сборки DISC -димерные комплексы консервативны на Fas (DD), FADD (DED) и каспазе-8 (первый DED), которые являются известными партнерами по связыванию ARC (фиг. 5А). К ним относятся D32, R37, D49, R56, R59 и R60 (рис. 2В и 5А). D32 консервативен как в Fas DD, так и в FADD DD, в то время как D49 консервативен в FADD DD и каспазе-8 DED1, а R60 консервативен в Fas DD и каспазе-8 DED1.R37 и R59 консервативны только в FADD DD, в то время как R56 консервативен только в каспазе-8 DED1. D13 и E46, которые являются критическими остатками для образования гомодимерного комплекса ARC CARD, вообще не консервативны (фиг. 5А).

Рисунок 5

Модель молекулярной основы ингибирования образования DISC с помощью ARC CARD.

A. Выравнивание последовательностей ARC CARD с его партнерами по связыванию, Fas DD, FADD DD и каспазой-8 DED. Остатки, критические для гомодимерного взаимодействия ARC CARD, были синими для одной стороны поверхности и красными для другой стороны.Консервативные остатки на Fas DD, FADD DD и каспазе-8 DED также показаны красным или синим цветом. B. Верхняя панель показывает схематическую диаграмму трех типов взаимодействий в комплексах надсемейства доменов смерти. DDS: суперсемейство доменов смерти. Нижняя панель показывает структуру комплекса каспазы-9 CARD (Casp-9)/APAF-1, репрезентативного взаимодействия CARD:CARD, образованного взаимодействием типа I. C. Модель взаимодействия между ARC CARD и Fas DD. Остатки, которые могут участвовать во взаимодействии, показаны палочками.D. Модель взаимодействия ARC CARD и FADD DD. Остатки, которые могут участвовать во взаимодействии, показаны палочками.

Три типа взаимодействий (типы I, II и III) на шести уникальных интерфейсах (типы Ia, Ib, IIa, IIb, IIIa и IIIb) были идентифицированы во взаимодействиях с суперсемейством доменов смерти (рис. 5B) 14 ,38 . Типичное гетеродимерное взаимодействие с доменом CARD было идентифицировано по кристаллической структуре каспазы-9 CARD и комплекса APAF-1 CARD, и взаимодействие было сформировано взаимодействиями типа I 35 .Поверхность типа Ia в основном образована остатками на спиралях h2 и h5 и взаимодействует с поверхностью типа Ib, которая в основном образована остатками на спиралях h3 и h4 (рис. 5Б).

На основе выравнивания последовательностей, ранее решенной структуры комплекса CARD и расположения консервативных остатков, критических для образования гомодимерного комплекса ARC CARD, мы разработали предварительную ингибирующую модель ARC CARD путем взаимодействия с Fas DD или FADD DD. Поскольку D13, R56, R59 и R60, которые являются критическими остатками для образования одной стороны гомодимерного интерфейса ARC CARD, не являются относительно консервативными в Fas DD и FADD DD, эту сторону ARC CARD использовали в качестве ориентировочное место взаимодействия.Затем Fas DD или FADD DD накладывались на ARC CARD, расположенную с другой стороны, чтобы получить взаимодействие Типа I. Модель комплекса ARC:Fas показала, что R56, R59 и R60 из ARC CARD образуют массивное заряженное взаимодействие с D261 и E256 из Fas DD (рис. 5C). D13 ARC CARD также может быть вовлечен во взаимодействие, образуя солевой мостик с K301 Fas DD. В случае комплексной модели ARC:FADD D123 и D127 из h4 FADD DD могли участвовать во взаимодействии с базовым пятном (образованным R56, R59 и R60) ARC CARD (рис.5Д). Интерфейсы модельных структур были структурно и энергетически выгодными в соответствии с программой анализа интерфейса PISA 39 .

Первая гомодимерная структура CARD ARC и последующие исследования позволяют предположить, что ARC-опосредованный молекулярный ингибирующий механизм сборки DISC, который является критическим сигнальным молекулярным комплексом во внешнем сигнальном пути апоптоза. Поскольку недавно сообщалось о мультимерном комплексе доменов CARD RIG-1 и MAVS, которые используют все три типа взаимодействий, которые были обнаружены для сборки подсемейства доменов смерти, тот факт, что ARC CARD образует более высокий олигомерный комплекс с Fas DD или FADD DD во время процесса торможения нельзя игнорировать.В этом случае в сборке ингибиторного комплекса могла участвовать обширная поверхность ARC CARD с остатками, распространяющимися по всем пяти спиралям его структуры. Необходимы дальнейшие усилия для решения сложной структуры, чтобы получить более четкое представление о молекулярной основе ингибирования ARC. Однако сообщалось, что гомодимеризация ARC CARD вызывала потерю ингибирующей активности ARC, что указывает на то, что предложенная нами модель комплексов с Fas DD и FADD является точной.Выявление интерфейса взаимодействия белков, обнаруженного в текущем исследовании, может иметь решающее значение для взаимодействия с другими партнерами по связыванию для правильной ингибирующей функции ARC во время апоптоза и некроптоза.

ARC заметно экспрессируется в сердечных и скелетных мышечных клетках и предотвращает апоптозную гибель этих постмитотических мышечных клеток. Вовлечение ARC в кардиомиопатию в условиях стресса наблюдали на мышиной модели 40 , что указывает на то, что ARC может быть тесно связан с сердечными заболеваниями у людей.В исследовании на мышах 41 также сообщалось об ингибирующей функции ARC гибели нейронов, что указывает на то, что ARC может иметь решающее значение для нейродегенеративных заболеваний у людей. Высокая экспрессия ARC часто наблюдается в злокачественных опухолях, что указывает на то, что она может иметь важное значение для развития и прогрессирования опухоли. В этом аспекте ARC может быть важной молекулой, которая может контролировать апоптозную и некротическую гибель клеток; соответственно, неспособность контролировать функцию ARC приводит к летальному исходу у людей.Следовательно, ARC может быть хорошей мишенью для терапевтического вмешательства, и структура ARC CARD, представленная в этом исследовании, может стать первым шагом к пониманию взаимодействий белков, опосредованных ARC CARD, и его ингибирующей способности. Небольшие молекулы, которые могут контролировать активность ARC путем нацеливания на гомо- и гетероолигомерный интерфейс, могут быть хорошими регуляторами апоптотической и некротической гибели клеток и, следовательно, потенциальными кандидатами в лекарственные средства.

Методы адаптации домена глубокого обучения для обнаружения мошенничества с кредитными картами

‘) переменная голова = документ.getElementsByTagName(«голова»)[0] var script = document.createElement(«сценарий») script.type = «текст/javascript» script.src = «https://buy.springer.com/assets/js/buybox-bundle-52d08dec1e.js» script.id = «ecommerce-scripts-» ​​+ метка времени head.appendChild (скрипт) var buybox = document.querySelector(«[data-id=id_»+ метка времени +»]»).parentNode ;[].slice.call(buybox.querySelectorAll(«.вариант-покупки»)).forEach(initCollapsibles) функция initCollapsibles(подписка, индекс) { var toggle = подписка.querySelector(«.цена-варианта-покупки») подписка.classList.remove(«расширенный») var form = подписка.querySelector(«.форма-варианта-покупки») если (форма) { вар formAction = form.getAttribute(«действие») документ.querySelector(«#ecommerce-scripts-» ​​+ timestamp).addEventListener(«load», bindModal(form, formAction, timestamp, index), false) } var priceInfo = подписка.querySelector(«.Информация о цене») var PurchaseOption = toggle.parentElement если (переключить && форма && priceInfo) { toggle.setAttribute(«роль», «кнопка») toggle.setAttribute(«tabindex», «0») переключать.addEventListener(«щелчок», функция (событие) { var expand = toggle.getAttribute(«aria-expanded») === «true» || ложный toggle.setAttribute(«aria-expanded», !expanded) form.hidden = расширенный если (! расширено) { покупкаOption.classList.add(«расширенный») } еще { покупкаOption.classList.удалить («расширить») } priceInfo.hidden = расширенный }, ЛОЖЬ) } } функция bindModal (форма, formAction, метка времени, индекс) { var weHasBrowserSupport = window.fetch && Array.from функция возврата () { var Buybox = EcommScripts ? EcommScripts.Buybox : ноль var Modal = EcommScripts ? EcommScripts.Модальный: ноль if (weHasBrowserSupport && Buybox && Modal) { var modalID = «ecomm-modal_» + метка времени + «_» + индекс var modal = новый модальный (modalID) modal.domEl.addEventListener («закрыть», закрыть) функция закрыть () { form.querySelector(«кнопка[тип=отправить]»).фокус() } вар корзинаURL = «/корзина» var cartModalURL = «/cart?messageOnly=1» форма.установить атрибут ( «действие», formAction.replace(cartURL, cartModalURL) ) var formSubmit = Buybox.interceptFormSubmit( Buybox.fetchFormAction(окно.fetch), Buybox.triggerModalAfterAddToCartSuccess(модальный), функция () { форма.removeEventListener («отправить», formSubmit, false) форма.setAttribute( «действие», formAction.replace(cartModalURL, cartURL) ) форма.отправить() } ) form.addEventListener («отправить», formSubmit, ложь) документ.body.appendChild(modal.domEl) } } } функция initKeyControls() { document.addEventListener («нажатие клавиши», функция (событие) { if (document.activeElement.classList.contains(«цена-варианта-покупки») && (event.code === «Пробел» || event.code === «Enter»)) { если (document.activeElement) { мероприятие.предотвратить по умолчанию () документ.activeElement.click() } } }, ЛОЖЬ) } функция InitialStateOpen() { вар buyboxWidth = buybox.offsetWidth ;[].slice.call(buybox.querySelectorAll(«.опция покупки»)).forEach(функция (опция, индекс) { var toggle = option.querySelector(«.цена-варианта-покупки») вар форма = вариант.querySelector(«.форма-варианта-покупки») var priceInfo = option.querySelector(«.Информация о цене») если (buyboxWidth > 480) { переключить.щелчок() } еще { если (индекс === 0) { переключить.щелчок() } еще { toggle.setAttribute («ария-расширенная», «ложь») форма.скрытый = «скрытый» priceInfo.hidden = «скрытый» } } }) } начальное состояниеОткрыть() если (window.buyboxInitialized) вернуть window.buyboxInitialized = истина initKeyControls() })()

Выявление ментальных моделей пользователей для улучшения информационной архитектуры

Частью упрощения использования сайта является организация информации таким образом, чтобы люди находили то, что ищут .Слишком часто контент структурируется на основе того, что имеет смысл для компании, а не для пользователей. (Это была проблема юзабилити № 1 в нашем недавнем исследовании 43 веб-сайтов.) Одним из основных способов определения схемы организации, которая лучше всего соответствует ментальной модели пользователя, является сортировка карточек.

Определение: Сортировка карточек — это метод исследования UX, в котором участники исследования группируют отдельные ярлыки, написанные на карточках для заметок, в соответствии с критериями, которые имеют для них смысл. Этот метод раскрывает, как структурированы предметные знания целевой аудитории, и служит для создания информационной архитектуры, соответствующей ожиданиям пользователей.

Давайте представим, что вы разрабатываете сайт по аренде автомобилей. Ваша компания предлагает около 60 моделей автомобилей, из которых клиенты могут выбирать. Как бы вы распределили эти автомобили по категориям, чтобы люди могли быстро найти идеальный автомобиль для аренды? Ваша компания может использовать такие технические термины, как семейный автомобиль , представительский автомобиль и полный размер люкс автомобиль . Но ваши пользователи могут не иметь представления о разнице между некоторыми из этих категорий.Здесь может помочь сортировка карточек: попросите пользователей организовать транспортные средства в группы, которые имеют смысл , , а затем посмотреть, какие закономерности появятся.

Hertz.com: в недавнем пользовательском тестировании на веб-сайтах электронной коммерции участники видели раскрывающийся список типов прокатных автомобилей , но они не были уверены, что означают такие категории, как Dream Cars или Prestige Collection n. К счастью, на сайте были фотографии и краткое описание каждой категории, но сравнение разных типов автомобилей все равно требовало изрядных усилий.Сортировка карт может показать, какие автомобили пользователи ожидают найти на сайте проката автомобилей.

Проведение карточной сортировки

Обычно процесс работает следующим образом:

  1. Выберите набор тем. В наборе должно быть 40–80 предметов, представляющих основной контент на сайте. Запишите каждую тему на отдельной каталожной карточке.
    Совет: Избегайте тем, содержащих одни и те же слова; участники будут стремиться сгруппировать эти карточки вместе.
  2. Пользователь объединяет темы в группы. Перемешайте карты и отдайте их участнику. Попросите пользователя посмотреть на карты по одной и сложить карты, которые связаны друг с другом, в стопки. Одни кучки могут быть большими, другие маленькими. Если участник не уверен в карточке или не знает, что она означает, можно оставить ее в стороне. Лучше иметь набор «неизвестных» или «неуверенных» карточек, чем хаотично группировать карточки.
    ​Примечания:
    • Не задано заданное количество стопок. Некоторые пользователи могут создавать много маленьких стопок, у других может получиться несколько больших.Все зависит от их индивидуальных ментальных моделей.
    • Пользователи должны знать, что в процессе работы они могут менять свое мнение: они могут перемещать карту из одной стопки в другую, объединять две стопки, разбивать стопку на несколько новых стопок и т. д. Сортировка карт — это восходящий процесс, поэтому следует ожидать фальстартов.
  3. Пользователь дает имена группам. После того, как участник сгруппирует все карточки, дайте ей пустые карточки и попросите написать название для каждой созданной ею группы.Этот шаг выявит ментальную модель тематического пространства пользователя. Вы можете получить несколько идей для категорий навигации, но не ждите, что участники создадут эффективные ярлыки.
    Совет: Важно выполнить этот шаг именования после создания всех групп, чтобы пользователь не замыкался на категориях во время работы; она должна быть свободна переставить свои группы в любой момент.
  4. Опросить пользователя. (Этот шаг необязателен, но настоятельно рекомендуется.) Попросите пользователей объяснить причину созданных ими групп. Дополнительные вопросы могут включать:
    • Были ли какие-либо предметы особенно легко или трудно размещать?
    • Были ли какие-либо предметы принадлежащими к двум или более группам?
    • Что вы думаете о несортированных вещах (если таковые имеются)?
    Вы также можете попросить пользователя подумать вслух, пока он выполняет исходную сортировку. Это дает подробную информацию, но также требует времени для анализа. Например, вы можете услышать, как пользователь говорит: «Я мог бы положить карточку помидоров в стопку овощей.Но подождите, они на самом деле фрукт, они там не очень подходят. Я думаю, что «Фрукты» лучше подходят». Такое утверждение позволит вам заключить, что пользователь считает овощи достойным дополнением к помидорам, хотя фрукты были даже лучше. Эта информация может подтолкнуть вас к перекрестным ссылкам с овощей на фрукты или, возможно, даже к назначению элемента овощам, если есть другие причины склоняться в этом направлении.
  5. При необходимости запросите у пользователя более удобные размеры групп. Вы не должны навязывать свои пожелания или предубеждения участнику во время первоначальной сортировки (шаги 1–3), но как только будет определена предпочтительная группа пользователя и после первоначального разбора, вы определенно можете попросить участника разбить большие группы на более мелкие подгруппы. Или наоборот: группировать небольшие группы в более крупные категории.
  6. Повторить с 15–20 пользователями. Вам понадобится достаточное количество пользователей, чтобы обнаружить закономерности в ментальных моделях пользователей. Мы рекомендуем 15 участников для карточной сортировки: чем больше, тем меньше доходность для каждого дополнительного пользователя; с меньшим количеством у вас не будет достаточно данных, чтобы выявить перекрывающиеся шаблоны в схемах организации.
  7. Проанализируйте данные. Когда у вас есть все данные, найдите общие группы, названия категорий или темы, а также элементы, которые часто объединялись в пары. Если вы видите, что некоторые элементы часто остаются в стороне, определите, связано ли это с тем, что метки карточек не были четкими, или содержание казалось не связанным с остальными темами. Объедините шаблоны, которые вы видите, с вашими качественными выводами из отчета, и вы сможете лучше понять, какая система организации будет наиболее успешной для ваших пользователей.(Есть еще много вопросов об анализе результатов сортировки карточек, но это тема для другой статьи.)

Варианты сортировки карточек

Различия в сортировке карточек связаны с тем, могут ли пользователи создавать свои собственные названия категорий, модерирует ли сеанс ведущий и проводится ли исследование с помощью бумаги или цифрового инструмента. Каждый из них имеет свои преимущества и недостатки, о которых мы кратко расскажем ниже.

Сортировка с открытой карточкой и сортировка с закрытой карточкой

  • Открытая сортировка карт — это наиболее распространенный тип сортировки карт, описанный выше.Как правило, когда практикующие специалисты используют термин сортировка карт , подразумевается, что это будет открытая сортировка карт. В открытой карточной сортировке пользователи могут присваивать любые имена группам, которые они создали с помощью карточек в стопке.
  • Закрытая сортировка карточек — это разновидность сортировки, в которой пользователям предоставляется заранее определенный набор названий категорий, и их просят организовать отдельные карточки в эти заранее определенные категории. Сортировка закрытых карточек не показывает, как пользователи осмысливают набор тем.Вместо этого он используется для оценки того, насколько хорошо существующая структура категорий поддерживает контент с точки зрения пользователя. Критика сортировки с закрытыми карточками заключается в том, что она проверяет способность пользователей помещать контент в «правильную» корзину — для пользователей это больше похоже на решение головоломки, чем на естественное сопоставление контента с категориями. Этот метод не отражает того, как пользователи естественным образом просматривают контент, то есть сначала сканируют категории и делают выбор на основе информационного запаха. Вместо сортировки с закрытыми карточками мы рекомендуем древовидное тестирование (также известное как обратная сортировка карточек) как способ оценки категорий навигации.

Модерируемая и немодерируемая сортировка карточек

  • Модерируемая сортировка карточек включает этап 4 описанного выше процесса: подведение итогов (и/или размышления вслух во время фактической сортировки). Этот шаг — очень ценная возможность получить качественное представление об обосновании пользователей для их групп. Вы можете задавать вопросы, исследовать для дальнейшего понимания и спрашивать о конкретных карточках, если это необходимо. Если это возможно для вашего графика и бюджета, мы рекомендуем модерировать типы ваших карточек, чтобы получить эту информацию.
  • Немодерируемая сортировка карточек предполагает, что пользователи самостоятельно организуют содержимое в группы, обычно с помощью онлайн-инструмента, без взаимодействия с фасилитатором. Как правило, это быстрее и дешевле, чем модерируемая сортировка карточек, по той простой причине, что исследователь не должен разговаривать с каждым пользователем. Немодерируемая сортировка карточек может быть полезна в качестве дополнения к сеансам модерируемой сортировки карточек. Например, представьте, что в исследовании участвовали очень разные группы аудитории, и исследовательская группа решила провести карточную сортировку с 60 пользователями: по 20 пользователей для каждой из 3 разных групп аудитории.В этом случае запуск 60 модерируемых сеансов сортировки карточек может оказаться непомерно дорогим. Вместо этого команда может решить провести небольшое исследование 5–10 модерируемых сеансов для каждой группы аудитории с последующей сортировкой немодерируемых карточек для оставшихся сеансов.

Сортировка бумажных и цифровых карт

  • Бумажная карточка сортировка — традиционная форма сортировки карточек. Темы пишутся на каталожных карточках, и пользователей просят создать свою группу на большом рабочем пространстве.Самым большим преимуществом сортировки бумажных карточек является то, что участникам исследования не нужно учиться: все, что им нужно сделать, это сложить бумагу стопками на столе. Это простой и гибкий процесс: пользователи могут легко перемещать карты или даже начинать все сначала. Людям также легче манипулировать очень большим количеством карточек на большом столе, чем манипулировать множеством объектов на экране компьютера, который часто не может отображать все в одном представлении. Недостатком сортировки бумажных карточек является то, что исследователям приходится вручную документировать группы каждого участника и вводить их в инструмент для анализа.
  • Цифровая сортировка карточек использует программное обеспечение или веб-инструмент для имитации тематических карточек, которые пользователи затем перетаскивают в группы. Этот метод, как правило, самый простой для исследователей, потому что программное обеспечение может анализировать результаты всех участников и определять, какие элементы чаще всего группировались вместе, какие названия категорий создавали пользователи, а также вероятность того, что два элемента будут объединены в пары. Недостатком является то, что удобство использования инструмента может повлиять на успех сеанса — технологические проблемы могут вызвать разочарование или даже помешать пользователям создавать именно те группы, которые им нужны.

Сортировка карточек — хорошо зарекомендовавший себя метод в области информационной архитектуры. На самом деле, исследование сортировки карточек, проведенное сегодня, будет выглядеть точно так же, как фотография исследования, которое мы провели 23 года назад — по крайней мере, если использовать физические карты, а не программное решение. Есть много способов провести исследование, и приведенные выше варианты ни в коем случае не являются исчерпывающим описанием всех возможных типов карт, но они являются наиболее распространенными. При планировании исследования по сортировке карточек вы должны выбрать подход, который лучше всего подходит для ваших целей и ресурсов.

Заключение

Сортировка карточек — очень полезный метод в информационной архитектуре; он используется, чтобы понять, что пользователи думают о вашем контенте. Это может помочь вам организовать контент так, чтобы он соответствовал ментальным моделям ваших пользователей, а не точке зрения вашей компании. Карточную сортировку можно дополнить другими методами информационной архитектуры для выявления проблем в структуре категорий.

(PDF) Методы адаптации домена глубокого обучения для обнаружения мошенничества с кредитными картами

Методы адаптации домена глубокого обучения 87

4.Carcillo, F., Dal Pozzolo, A., Le Borgne, Y.A., Caelen, O., Mazzer, Y., Bontempi,

G.: SCARFF: масштабируемая платформа для потокового обнаружения мошенничества с кредитными картами с искрой

. Инф. Fusion 41(C), 182–194 (2018)

5. Каруана, Р.: Многозадачное обучение. Мах. Учить. 28(1), 41–75 (1997)

6. Шолле Ф. и др.: Керас (2015). https://keras.io

7. Чопра С., Балакришнан С., Гопалан Р.: DLID: глубокое обучение для адаптации домена путем интерполяции между доменами.В: ICML Workshop on Challenges in

Representation Learning (2013)

8. Ciresan, D.C., Meier, U., Schmidhuber, J.: Перенос обучения латинским и китайским

символам с глубокими нейронными сетями. В: IJCNN, стр. 1–6. IEEE (2012)

9. Дай, В., Ян, К., Сюэ, Г.Р., Ю, Ю.: Ускорение для трансферного обучения. В: Труды

24-й Международной конференции по машинному обучению, ICML 2007, стр.

193–200. АКМ (2007)

10.Даль Поццоло, А., Боракки, Г., Кэлен, О., Алиппи, К., Бонтемпи, Г.: Обнаружение мошенничества с кредитной картой

и адаптация концептуального дрейфа с отложенной контролируемой информацией.

В: Труды Международной объединенной конференции по нейронным сетям, стр. 1–8.

IEEE (2015)

11. Даль Поццоло, А., Боракки, Г., Кэлен, О., Алиппи, К., Бонтемпи, Г.: Обнаружение мошенничества с кредитной картой

: реалистичное моделирование и новое обучение стратегия. IEEE транс.

Нейронная сеть.Учить. Сист. 29(8), 3784–3797 (2018)

12. Даль Поццоло, А., Кэлен, О., Ле Борн, Ю.А., Уотершут, С., Бонтемпи, Г.:

Извлеченные уроки в области обнаружения мошенничества с кредитными картами с точки зрения практикующего.

Эксперт. Сист. заявл. 10(41), 4915–4928 (2014)

13. Daume III, H.: Удивительно простая адаптация предметной области. В: Материалы 45-го ежегодного собрания

Ассоциации компьютерной лингвистики, стр. 256–263.

Ассоциация компьютерной лингвистики, Прага, Чехия, июнь 2007 г.

14.Демсар, Дж.: Статистическое сравнение классификаторов по нескольким наборам данных. Дж. Мах.

Узнать. Рез. 7, 1–30 (2006)

15. Фосетт, Т., Провост, Ф.: Адаптивное обнаружение мошенничества. Данные мин. Знай. Дисков. 1,

291–316 (1997)

16. Ганин Ю., Устинова Э., Аджакан Х., Жермен П., Ларошель Х., Лавиолетт Ф.,

Маршан М. , Лемпицкий В.: Предметно-состязательное обучение нейронных сетей. Дж.

Маха. Учить. Рез. 17(1), 2096–2030 (2016)

17.Гао, Дж., Фан, В., Цзян, Дж., Хань, Дж.: Передача знаний с помощью множественного картирования локальной модели

. В: Труды 14-й Международной конференции ACM SIGKDD-

по обнаружению знаний и интеллектуальному анализу данных, KDD 2008, стр. 283–291. ACM,

New York (2008)

18. Глорот, X., Бордес, А., Бенжио, Ю.: Адаптация предметной области для крупномасштабной классификации настроений

: подход к глубокому обучению. В: Материалы Двадцать восьмой межнациональной конференции по машинному обучению

, ICML (2011)

19.Хасти, Т., Тибширани, Р., Фридман, Дж.: Элементы статистического обучения, 2-е изд.

. Springer, New York (2009)

20. HSN Consultants, Inc.: Отчет Нильсона (консультации проведены 23 октября 2018 г.) (2017 г.).

https://nilsonreport.com/upload/content promo/The Nilson Report Issue 1118.

pdf

21. Юрговский Дж., Гранитцер М., Циглер К., Калабретто С., Портье, PE, He, L.,

Caelen, O.: Классификация последовательности для обнаружения мошенничества с кредитными картами.Эксперт. Сист.

Заявл. 100, 234–245 (2018)

22. Лебишо, Б., Браун, Ф., Кэлен, О., Саэренс, М.: Графическая полуконтролируемая система обнаружения мошенничества с кредитными картами,

, стр. 721–733. Springer, Cham (2017)

Рефолдинг, структура раствора, рН-зависимое поведение и белок-белковые взаимодействия

Abstract

RIP2, одна из киназ RIP, взаимодействует с рецептором нейротрофина p75, регулируя выживаемость нейронов, и с белками NOD1 и NOD2, вызывая врожденный иммунный ответ против грамотрицательных и грамположительных бактерий через свой домен рекрутирования каспазы ( КАРТА).Это делает RIP2 перспективной мишенью для новых методов лечения, направленных на модулирование воспалительных заболеваний и нейрогенеза/нейродегенерации. В нескольких исследованиях сообщается о проблемах со стабильностью RIP2 CARD человека и ее продукции в бактериях-хозяевах, что является необходимым условием для структурного исследования с помощью ЯМР-спектроскопии в растворе. В настоящей работе мы сообщаем о протоколах производства и рефолдинга с высоким выходом и определяем структуру крысиной RIP2 CARD. Структура обнаруживает важные отличия от ранее опубликованной конформации гомологичного белка человека.Используя растворный ЯМР, мы охарактеризовали внутримолекулярную подвижность и рН-зависимое поведение RIP2 CARD и обнаружили склонность белка образовывать олигомеры высокого порядка при физиологическом рН, будучи мономерным в кислых условиях. Олигомеризацию белка можно объяснить, исходя из электростатических свойств его поверхности. Анализ структуры и последовательностей гомологичных белков выявляет остатки, значимые для необычной укладки доменов RIP2 CARD разных видов.Протоколы высокопроизводительного производства/рефолдинга белка и предлагаемое объяснение олигомеризации белка дают возможность разработать стабилизированные варианты RIP2 CARD, которые можно использовать для изучения структурных деталей взаимодействия RIP2/NOD1/NOD2 и для получения рационального лекарственного препарата. дизайн.

Образец цитирования: Гончарук С.А., Артемьева Л.Е., Табакмахер В.М., Арсеньев А.С., Минеев К.С. (2018) Домен CARD киназы RIP2 крысы: рефолдинг, структура раствора, рН-зависимое поведение и белок-белковые взаимодействия.ПЛОС ОДИН 13(10): е0206244. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0206244

Редактор: Michael Massiah, Университет Джорджа Вашингтона, США

Поступила в редакцию: 27 июня 2018 г.; Принято: 9 октября 2018 г .; Опубликовано: 23 октября 2018 г.

Copyright: © 2018 Goncharuk et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все данные ЯМР доступны в базах данных BMRB (http://www.bmrb.wisc.edu/) и PDB (https://www.wwpdb.org/) (номер доступа 34294 и 6GWM). , соответственно). Все другие соответствующие данные находятся в документе и в файлах вспомогательной информации.

Финансирование: Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда, грант № 14-14-00573. Эксперименты частично проводились на оборудовании, предоставленном базовым комплексом ИБХ (ЦКП ИБХ, при поддержке Минобрнауки России, грант RFMEFI62117X0018).Спонсор не участвовал в разработке дизайна исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Семейство киназ RIP включает белки, которые принимают участие в передаче сигналов рецепторов смерти и врожденном иммунитете. Киназы RIP связывают различных членов семейства TNFR и рецепторы NOD, активируя сигнальные каскады NFκB и MAP [1,2].RIP2 (RICK, RIPK2), одна из киназ RIP, взаимодействует с рецептором нейротрофина р75 [3], регулирующим выживаемость нейронов, и с белками NOD1 и NOD2, вызывая врожденный иммунный ответ против грамотрицательных и грамположительных бактерий [4]. ]. Это делает RIP2 перспективной мишенью для новых методов лечения, направленных на модулирование воспалительных заболеваний и нейрогенеза/нейродегенерации [5].

RIP2 имеет типичную двухдоменную структуру, N-концевая часть белка обладает каталитической киназной активностью, а С-концевая часть представляет собой домен рекрутирования каспаз (CARD), относящийся к суперсемейству доменов смерти [6].Киназная активность не требуется для передачи сигналов NFκB, но необходима для стабилизации белка и активации MAP-киназного пути [7,8]. CARD, в свою очередь, необходимы для взаимодействия RIP2 с его партнерскими рецепторами, как NOD, так и p75 [3,9,10]. Два домена связаны друг с другом предположительно неструктурированным сегментом примерно из 140 аминокислот, так называемым промежуточным доменом. Полноразмерный белок RIP2 находится в мономерно-димерном равновесии в растворе [11].

Структурные данные относительно RIP2 до недавнего времени были очень ограниченными.Первая структура киназного домена [12] и ЯМР-структуры RIP2 CARD человека в апо-состоянии и в комплексе с доменом гибели p75NTR были опубликованы в 2015 г. [13]. Интерфейсы белок-белковых взаимодействий, осуществляемых с помощью RIP2 CARD, также были исследованы с помощью мутагенеза для NOD1 [14], NOD2 [15] и p75NTR [16], однако структура комплекса NOD1 или NOD2 с RIP2 CARD получена не была. В нескольких исследованиях сообщается о проблемах со стабильностью RIP2 CARD человека и ее продукции в бактериях-хозяевах, что является необходимым условием для структурного исследования с помощью ЯМР-спектроскопии в растворе [13,15].Фрид и др. [15] не смогли получить растворимый домен мышиного RIP2 CARD для структурного исследования и должны были коэкспрессировать его с доменом NOD2 для анализа методом pull-down. Несмотря на то, что Лин и соавт. [13] удалось получить бактериальную продукцию RIP2 CARD человека и даже решить ее структуру, авторы столкнулись с проблемами растворимости; производственный протокол описан кратко и нечетко, поэтому не может быть воспроизведен. В настоящей работе мы сосредоточимся на CARD крысиной киназы RIP2, высоко гомологичной человеческому белку.Наша цель состоит в том, чтобы сначала установить протокол производства белка, а затем тщательно охарактеризовать его структуру и стабильность, чтобы получить объект, применимый для изучения функционально важных белок-белковых взаимодействий.

Материалы и методы

Экспрессия и очистка белков

Были протестированы четыре различных конструкции экспрессии для домена RIP2 CARD (RIP2CARD). Было сконструировано несколько вариантов вектора pGEMEX-1 с желаемой N-концевой меткой (His-метка, тиоредоксин, SUMO и GST), клонированной в сайты рестрикции NdeI/BamHI.Для удаления N-концевой метки во все конструкции был включен сайт расщепления тромбином. Ген RIP2CARD был собран с использованием химически синтезированных олигонуклеотидов, расщеплен эндонуклеазами BamHI и HindIII и лигирован во все варианты вектора.

Векторы экспрессии трансформировали в штамм E. coli BL21(DE3)pLysS и наносили штрихами на чашки с агаром LB. Для каждого варианта несколько колоний (около 1 колонии на 10 мл среды) собирали с чашек на следующий вечер, высевали в среду М9 в присутствии ампициллина (100 мкг/мл) и культивировали при 28°С и 250 об/мин в течение ночи до культура достигла OD600 ~0.6. Экспрессию белка индуцировали с помощью IPTG. Для определения наилучших условий культивирования были протестированы три различные концентрации IPTG (0, 0,1 и 1 мМ) и две температуры (37°C и 13°C). Клетки инкубировали в течение ночи, собирали центрифугированием при 5000 g в течение 7 минут и хранили при -20°С. Для оценки растворимости белка клеточный осадок ресуспендировали в буфере (20 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 100 мМ NaCl, 100 мкМ PMSF, 1 мМ ЭДТА, 0,5% Triton X-100) и лизировали ультразвуком на льду. Клеточный дебрис и нерастворимые белки удаляли центрифугированием при 14000 g в течение 20 минут.

Для подготовки белка к процедуре рефолдинга использовали His-меченый вариант. Экспрессию белка индуцировали 0,1 мМ IPTG и продолжали культивирование при 37°С. Клетки собирали центрифугированием при 5000 g в течение 7 минут и хранили при -80°C. Осадок клеток ресуспендировали в лизирующем буфере (50 мМ трис-HCl, pH 8,0, 500 мМ NaCl, 10 мМ β-меркаптоэтанол (β-Me), 100 мкМ PMSF), лизировали ультразвуком на льду и центрифугировали при 14000 g в течение 1 час. Осадок ресуспендировали в буфере, содержащем 50 мМ Tris-HCl, pH 8.0, 500 мМ NaCl, 10 мМ β-Me, 10 мМ имидазола и 8 М мочевины, инкубировали 1 час и удаляли клеточный дебрис и нерастворимые белки центрифугированием при 14000 g в течение 1 часа с последующей фильтрацией через мембрану с Поры 0,22 мкм. Растворимую фракцию связывали со смолой Ni-sepharose HP (GE, США), промывали тем же буфером, содержащим 30 мМ имидазол, и элюировали буфером, содержащим 500 мМ имидазол. Все буферы, использованные во время очистки, содержали 10 мМ β-Me.

Складывание

Концентрация белка после IMAC обычно составляла около 2 мг/мл, в противном случае он концентрировался до этого значения.Все процедуры диализа проводили в диализных пробирках с отсечением веса 14 кДа. Объем буфера брали в 400-кратном избытке над объемом пробы. Продолжительность составляла 18–24 ч при 4°С или КТ при интенсивном перемешивании магнитной мешалкой. Прямой диализ при рН 7,5–8,5 проводили с использованием буфера А, содержащего: 50 мМ Трис (доведенный до желаемого рН с помощью HCl), 50 мМ NaCl, 1 мМ NaN3 и 5 мМ β-меркаптоэтанол (β-Me). Для диализа при рН 6 использовали буфер, содержащий 20 мМ NaPi, 50 мМ NaCl, 1 мМ NaN3 и 5 мМ β-Me.Для процедур диализа при рН 4,5–5 использовали буфер, содержащий 10 мМ NaOAc, 1 мМ NaN3 и 0,5 мМ трис(2-карбоксиэтил)фосфин (TCEP). Ступенчатый диализ проводили в буферах, содержащих редукционную концентрацию мочевины (8М -> 4М -> 2М -> без мочевины) при рН 8 и рН 5.

Для оценки влияния небольшого разведения перед диализом образец белка разводили в 11 раз буфером А с рН 7,5 и инкубировали в течение ночи. Для исследования действия аргинина образец белка разбавляли в 6 раз буфером А с 0.5 М аргинина и инкубировали в течение ночи. Затем проводили стандартный прямой диализ.

В экспериментах по разбавлению белок добавляли в буфер (10 мМ NaOAc, 1 мМ NaN3, 0,5 мМ TCEP с 50 мМ NaCl или без него) по каплям со скоростью 1 мл/ч с помощью перистальтического насоса при 4°C и pH 4–4,5.

Окончательную рефолдинг проводили при 4°C путем 130-кратного разбавления в буфере, содержащем 10 мМ NaOAc, pH 4,2, 0,5 мМ TCEP и 1 мМ NaN3. После осторожного перемешивания при 4 ° C в течение ночи образец белка концентрировали до ~ 10 мг / мл с использованием дисков для ультрафильтрации Amicon с MWCO 10 кДа (концентрация образца на основе давления).Качество рефолдинга контролировали с помощью спектров КД и ЯМР.

ЯМР-спектроскопия

Если не указано иное, все спектры ЯМР записаны на образцах RIP2CARD с концентрацией 300 мкМ, рН 4,2, 1 мМ TCEP и 30°C на спектрометре Avance III 800 МГц (Bruker Biospin, Германия), оснащенном тройным резонансным криогенным зондом. Назначение химического сдвига выполняли вручную с использованием следующих экспериментов: HNCO, HN(CA)CO, HNCA, HN(CO)CA, HNCACB, CBCA(CO)NH, H(CCCO)NH, (H)CC(CO)NH, H(C)CH-TOCSY, 4D HCCH-TOCSY, 3D-1H, 15N-NOESY-HSQC.Ароматические боковые цепи были определены с использованием спектров (H)CCH-COSY и (Hb)Cb(CgCC)H [17,18]. По возможности использовались версии экспериментов BEST-TROSY с задержкой рециркуляции 0,45 с [19]. Все спектры были записаны с неравномерной дискретизацией в непрямых измерениях и обработаны с использованием подхода сжатого зондирования в программе qMDD [20]. 3 J HNHA были измерены из J-количественного эксперимента HNHA [21], связи 3 J CCo и 3 J NCo были измерены из спин-эхо разностных спектров HSQC в постоянном времени [21]. 22,23].Структуру белка рассчитывали на основе ограничений по расстоянию, полученных из 3D-спектров 1H,15N-NOESY-HSQC и 1H,13C-NOESY-HSQC, полученных при времени смешивания 80 мс, и диэдральных ограничений (𝝋, 𝜒 1 ), полученных из анализ J-муфт. Расчет был выполнен в программе CYANA 3.97 [24] с использованием автоматического присвоения NOE с последующим ручным присвоением оставшихся кросс-пиков. Для изучения подвижности скелета были измерены кросс-коррелированные скорости релаксации амидных групп, как сообщалось [25], и преобразованы во времена корреляции вращательной диффузии.Структуры анализировали в программе MOLMOL [26] и системе молекулярной графики PyMOL, версия 2.0 Schrödinger, LLC. Полученные химические сдвиги и 20 лучших структур депонированы в базы данных BMRB и PDB под регистрационными кодами 34294 и 6GWM соответственно. Для определения pKa ионогенных групп следили за химическими сдвигами Asp Cβ, Glu Cγ и Cα С-концевого остатка, варьируя рН в диапазоне 3,3–5,1 в отсутствие соли. Затем полученную зависимость аппроксимировали наиболее простой моделью: δ c = ( δ a + δ b 10 ( pKa−pH 909011 ) B 10 ( pka-ph ) ), где δ C — текущий химический сдвиг, а δ A и δ B — химические сдвиги ядер в протонированное и депротонированное состояния соответственно.Анализ электростатических свойств белка был выполнен с использованием подхода Protein Surface Topography [27,28], реализованного в собственном программном обеспечении IMPULSE. Домены NOD1 и RIP2 CARD были пространственно выровнены, трехмерное распределение электростатического потенциала на молекулярной поверхности NOD1 CARD и RIP2 CARD было рассчитано с использованием набора параметров AMBER99SB-ILDN [29], а затем преобразовано в карты двумерной сферической проекции.

Результаты

Экспрессия белка

Производство белка в растворимой форме, безусловно, является наиболее предпочтительной стратегией, поскольку разработка эффективной процедуры рефолдинга часто требует много времени и ресурсов, но успех не гарантирован.Поэтому сначала был проведен скрининг нескольких экспрессионных конструкций для получения RIP2CARD. Были протестированы следующие N-концевые метки: тиоредоксин, SUMO, GST и His-метка. Кроме того, мы изучили влияние положения His-метки на N- или C-конце RIP2CARD, но существенных изменений не наблюдалось. Для оценки растворимости использовали неденатурирующий детергент Тритон Х-100. Это облегчает лизис клеток и позволяет более четко интерпретировать путь накопления белка (в виде телец включения или нет).Таким образом, мы исключаем небольшие агрегаты RIP2CARD или соосаждение из-за гидрофобных взаимодействий, т.е. с мембраной (мембраносвязанные белки).

Для сравнения уровней экспрессии и растворимости белка для всех гибридных конструкций и условий культивирования был проведен анализ SDS-PAGE. Прежде всего, сравнивали общий выход белка (S1 Fig, Table 1). Наблюдали высокий уровень экспрессии для всех конструкций и условий культивирования. Примечательно, что уровни экспрессии для тиоредоксин- и His-меченых конструкций, культивируемых при 13°С и 37°С, были примерно одинаковыми, тогда как для SUMO и особенно для GST-конструкций были достигнуты значительно более низкие выходы при выращивании клеток при 13°С.Несмотря на то, что абсолютный выход His-меченой конструкции был меньше, целевой белок (RIP2CARD) составляет большую часть этого гибрида, в то время как во всех других слияниях RIP2CARD составляет менее половины. Таким образом, с точки зрения выхода целевого белка можно сделать вывод, что тиоредоксин- и His-меченые гибриды являются лучшими конструкциями для культивирования при любой температуре.

Помимо общего количества белка, большое значение имеет также количество растворимой фракции. Оказалось, что большая часть целевого белка нерастворима при 37°С для всех конструкций, а накопление растворимой формы наблюдается при низкой температуре (13°С).Наиболее значительные изменения обнаружены для конструкций тиоредоксина и СУМО. Около одной трети с половиной целевого белка, соответственно, были растворимы, в то время как значительное количество растворимой конструкции, меченной His, не продуцировалось. Температурную зависимость можно объяснить гидрофобными взаимодействиями и наличием партнера по слиянию. При низкой температуре гидрофобные взаимодействия ослабевают, что позволяет белку формировать правильные внутримолекулярные контакты и принимать нативную укладку.Партнер по слиянию, такой как тиоредоксин, может скрывать гидрофобные участки на поверхности RIP2CARD, что препятствует образованию олигомеров.

Таким образом, мы показали, что с партнером по слиянию можно получить растворимую форму RIP2CARD, но не более 15 мг целевого белка (RIP2CARD) на литр среды, при этом общий выход может достигать 30–40 мг на литр. Кроме того, даже эти уменьшенные количества растворимых химерных белков были нестабильны и осаждались после первой стадии очистки с помощью IMAC.В связи с этим мы решили разработать процедуру рефолдинга белков из телец включения.

Протокол перепрошивки для RIP2CARD из тел включения

Процедура рефолдинга, по-видимому, является одним из основных узких мест в получении нативно структурированного и активного рекомбинантного белка. В случае RIP2CARD повторная укладка направлена ​​на устранение сильных растворителей из предыдущего этапа производственного протокола. Для рефолдинга очищенного RIP2CARD мы использовали два наиболее распространенных и эффективных подхода: диализ и разбавление.Теоретическая изоэлектрическая точка белка RIP2CARD составляет 8,8, поэтому мы проводили процесс рефолдинга при рН ниже значения pI. Мы протестировали несколько протоколов для указанного диапазона pH. Наши первые попытки включали прямой диализ при «нативном» рН (7,5–8,5). В этих условиях наблюдалась интенсивная агрегация белков. Концентрация RIP2CARD после диализа была ниже 0,5 мг/мл и не могла быть увеличена никакими методами концентрирования. Чтобы сделать рефолдинг еще более постепенным, мы попробовали поэтапный подход к диализу, уменьшая количество мочевины в диализном буфере каждые 12–18 часов (6 М, 4 М, 2 М и без мочевины).На последних двух ступенях смены буфера (2 М и без мочевины) была обнаружена агрегация белка. Поскольку на сворачивание белка могут влиять белок-белковые взаимодействия, вызванные высокой концентрацией, мы применили несколько подходов, чтобы избежать агрегации: добавление аргинина и небольшое разведение перед диализом. Известно, что аргинин подавляет агрегацию белка и улучшает выход рефолдинга [30]. К сожалению, все перечисленные приемы не привели к получению свернутого белка в достаточном количестве.RIP2CARD выпадал в осадок, и его концентрация в растворе не превышала 0,5 мг/мл. Кроме того, мы попытались диализовать образец при двух разных температурах (4°С и КТ), но существенных изменений не наблюдалось.

Таким образом, мы предположили, что рефолдинг RIP2CARD при нейтральном pH невозможен, поэтому исследовали рефолдинг в кислых условиях. Белок содержит полигистидиновую метку и несколько кислотных остатков, поэтому снижение рН позволяет существенно изменить общий заряд молекулы и предотвратить выпадение осадка за счет усиленного электростатического отталкивания.В связи с этим мы выполнили первые несколько попыток диализа при pH 6,0 (ниже pKa His), 5,0 (близко к pKa Glu) и 4,5 (близко к pKa Asp). Все наши попытки рефолдинга RIP2CARD при pH 5 и 6 не увенчались успехом, однако при диализе при pH 4,5 мы достигли концентрации RIP2CARD, достаточной для ЯМР-исследования. КД-спектроскопия подтвердила нативную вторичную структуру белка. После процесса диализа образец сохранил 2 мг/мл RIP2CARD, однако концентрирование привело к агрегации белка выше 4 мг/мл.Значительно лучшие результаты были получены при капельном разведении при рН 4,5 и 4,0, последние условия позволили достичь концентрации свернутого RIP2CARD до 10 мг/мл. Таким образом, наши данные ясно показывают, что наиболее важным параметром для фолдинга RIP2CARD является рН, и, наконец, мы обнаружили, что лучшими условиями рефолдинга являются разбавления (до 15 мкг/мл) в бессолевом буфере (10 мМ NaOAc, рН 4,2). , 0,5 мМ TCEP и 1 мМ NaN3). Все попытки рефолдинга сведены в табл. 2. С учетом всего вышесказанного можно сделать вывод, что наиболее простым и эффективным способом получения RIP2CARD является его экспрессия в виде телец включения с последующей простой рефолдингом.

Структура и мобильность RIP2CARD

Образец повторно уложенного 13 C/ 15 N-меченого RIP2CARD при pH 4,2 использовали для определения структуры белка в растворе. Качество спектров ЯМР было превосходным (рис. 1В), что позволило получить 95% возможных значений химического сдвига. Только некоторые остатки N-концевой полигистидиновой метки не были присвоены. Исходные данные для расчета конструкции включали 3064 кросс-пика NOE и 123 J-связи, преобразованные в ограничения двугранного угла.С помощью автоматического назначения NOE, реализованного в пакете CYANA, пики NOE были преобразованы в 1807 ограничений расстояния. Согласно анализу параметров ЯМР-релаксации (рис. 1Б), белок переворачивается со временем корреляции 5,9 нс, что соответствует мономерному состоянию домена, а стабильная часть RIP2CARD включает 91 остаток, G433-L524. Поэтому мы удалили ограничения для гибких N- и C-концевых областей белка и закончили с 1678 ограничениями расстояния (301 дальнего действия) и 126 ограничениями двугранного угла, что соответствует 19.8 ограничений на остаток и должны обеспечивать общее высокое качество структуры ЯМР.

Рис. 1.

A 1 H, 15 Спектр N-HSQC 300 мкМ RIP2CARD, полученный при pH 4,5, 30°C. Боковые цепи NH 2 групп Asn и Gln обозначены толстыми красными линиями, а изогнутые пики групп Hε/Nε Arg отмечены звездочками. Отнесение показано на спектре, пики от полигистидиновой метки (MHHHHHHGSGSGLVPRGS) имеют номера 1–18. B —Эффективное время корреляции вращения векторов RIP2CARD N-H, измеренное на основе кросс-коррелированных скоростей релаксации.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0206244.g001

Полученная структура демонстрирует почти типичную складку белка из семейства доменов смерти (рис. 2). Белковая цепь образует пять α-спиралей: изогнутая первая спираль I434-S441 (h2a) и R443-Q449 (h2b), E452-R465 (h3), K470-S477 (h4), R482-Q496 (h5) и E498-N511. (Н5).В отличие от многих других CARD или доменов смерти [31], содержащих дополнительную шестую спираль, последние 13 остатков RIP2CARD не обнаруживают наличия каких-либо элементов регулярной вторичной структуры, кроме двух последовательных β-витков I типа (G513-L516 , M514-Q517), но область стабильна, согласно релаксационному анализу 15N. Пептидная связь Q517-P518 находится в цис-конфигурации, как показывает анализ химического сдвига и сильный контакт NOE между соответствующими атомами Hα. Структура С-концевой части домена необычна и может рассматриваться как уникальная особенность RIP2 CARD, поскольку подобная укладка наблюдается только для высокогомологичного белка RIP2 человека [13].Конформация стабилизирована 52 водородными связями между основной цепью и по крайней мере двумя водородными связями между боковой цепью и основной цепью. Структура четко определена и характеризуется СКО 0,43 А для области с регулярной структурой (I434-Q517) и 0,73 А для полного домена. Полная статистика входных данных и полученной структуры представлена ​​в таблице S1. Детальный анализ полученной структуры показывает, что ядро ​​белка сильно гидрофобно, тогда как поверхность в основном гидрофильна и содержит много заряженных остатков, которые могут вступать в несколько солевых мостиков.Гидрофобные цепи экспонированы с одной стороны белка и располагаются в основном в неструктурированной С-концевой области.

Рис. 2. Структура карты RIP2CARD.

A — 20 лучших структур стабильного ядра RIP2CARD (432–524) наложены на атомы скелета. B — структура RIP2CARD в ленточном представлении. C— 180-градусное стереоизображение структуры RIP2CARD, показанное с неструктурированным С-концевым хвостом (голубой, 525–539). Тяжелые атомы некоторых боковых цепей показаны красными (отрицательно заряженными), синими (положительно заряженными) и оранжевыми (гидрофобными) палочками. D — контактная поверхность стабильной сердцевины RIP2CARD окрашена в соответствии с ее гидрофобностью. Зеленый цвет соответствует полярным боковым цепям, а желтый – гидрофобным. Используют шкалу гидрофобности Уайта и Уимли [32].

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0206244.g002

pH-зависимое поведение RIP2CARD

Как мы уже упоминали, RIP2CARD рефолдируется только при кислом рН, а структура определяется при рН 4.2, что далеко от физиологических значений. С другой стороны, белок богат заряженными боковыми цепями, наша конструкция содержит 16 положительно заряженных и 15 отрицательно заряженных остатков (включая N- и C-концы), а также 6 гистидинов в экспрессионной метке, что делает pH важным фактором. Фактор, который может повлиять на поведение белка. Кроме того, все функционально важные взаимодействия, осуществляемые доменом, необходимо изучать при нейтральном рН. По этой причине мы провели эксперименты по рН-титрованию, чтобы установить соответствие установленной структуры и получить условия, близкие к физиологическим.

Это исследование показывает довольно своеобразное рН-зависимое поведение домена. Во-первых, при рН ниже 3,7 белок частично разворачивается — в области случайных клубков появляется набор новых узких и интенсивных сигналов (рис. S2). При рН выше 4,3 качество спектров начинает резко снижаться и сигналы исчезают, что сопровождается изменением физических свойств раствора — он становится очень вязким и гелеобразным. При рН выше 5,0 сохраняется только 40–50 мкМ мономерного растворимого белка.При pH выше 6,0 белок выпадает в осадок, и в растворе сохраняется только 10–20 мкМ RIP2CARD (рис. 3C). Это осаждение является обратимым, белок может повторно растворяться при рН 3,5, обеспечивая такое же качество спектров ЯМР и картину сигнала в HSQC, что указывает на правильную укладку домена CARD. Причем качество спектров зависит от ионной силы раствора и концентрации белка. В то время как в присутствии 50 мМ NaCl в растворе при рН 5 сохраняется только 20–40 мкМ белка.0–6,0, в бессолевых и разбавленных образцах можно наблюдать до 100 мкМ белка при рН 5,5. Концентрированный бессолевой образец также работает намного хуже, чем разбавленный, при рН выше 5,0. Чтобы понять причину такого поведения, мы измерили pKa всех боковых цепей Glu и Asp, большинство из которых оказалось в диапазоне 3,6–4,0, и рассчитали профиль заряда белка (рис. 3C и 3D). При рН 4,2 уже заряжено 70% анионных боковых цепей, а выше 5,0 общий заряд белка определяется исключительно состоянием гистидинов в полигистидиновой метке.Структура RIP2CARD не изменяется при нейтральном pH, согласно спектрам ЯМР (S3 Fig). Таким образом, осаждение RIP2CARD обусловлено изменением суммарного заряда белка. При низком pH суммарный заряд составляет +21, а электростатическое отталкивание предотвращает олигомеризацию белка. Однако при рН выше 4,2 суммарный заряд снижается до +10 и далее до +7 при рН выше 5,0. Этого недостаточно для отталкивания белков, и они начинают образовывать множественные контакты и олигомеры высокого порядка, что выражается в гелеобразном поведении раствора.Когда His-метка становится нейтральной и заряд еще больше снижается, белок выпадает в осадок, поскольку образуются олигомеры очень высокого порядка. Эта гипотеза согласуется с выраженным влиянием ионной силы на осаждение. Таким образом, мы делаем вывод, что способность образовывать олигомеры высокого порядка является неотъемлемым свойством CARD-домена RIP2 крысы.

Рис. 3. Поведение RIP2CARD в зависимости от pH.

A— Наложение области спектров 13C-CT-HSQC RIP2CARD, содержащей кросс-пики от боковых цепей Arg и Lys, записанных при pH 3.3 (синий), 3,7 (красный) и 4,4 (пурпурный). Отнесение сигналов указано, звездочками обозначены свернутые кросс-пики от фрагментов CαH. B— структура RIP2CARD с выделенными заряженными боковыми цепями, участвующими в солевых мостиках. C — концентрация мономерного RIP2CARD (относительная интенсивность перекрестного пика боковой цепи W438 в HSQC) представлена ​​как функция pH окружающей среды для образца 300 мкМ без соли (синие кружки), образца 100 мкМ без соли (пурпурные кружки) и Образец 100 мкМ с 50 мМ NaCl (синие кружки).Сплошные и пунктирные темно-синие линии обозначают суммарный заряд и заряд полигистидиновой метки, рассчитанный на основе измеренных величин pKa. D— измеряли рКа боковых цепей Glu, Asp и С-концевого остатка RIP2CARD. Красные полосы обозначают боковые цепи, которые участвуют в солевых мостиках.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0206244.g003

Титрование pH также позволило обнаружить солевые мостики, стабилизирующие складку домена. Из всех положительно заряженных остатков только боковые цепи R443, R487, R502 и K485 чувствительны к изменению рН, и эти остатки, вероятно, участвуют в ионных взаимодействиях (рис. 3А).По структуре R443 близок к D491 (3–6 А между концевыми гетероатомами), К487 — к Е644 (4–7 А), R502 — как к Е498 (3–7 А), так и к Е499 (4–7 А). А) и К485 — к Е452 (3-6А) (рис. 3Б). Таким образом, обнаружено пять ионных контактов. Что касается релевантности полученной структуры, то почти все боковые цепи заряжены уже при рН 4,2, а общий вид спектров HSQC не меняется при титровании до рН 6 (S3 рис.). Поскольку коровый домен CARD не содержит гистидинов, мы делаем вывод, что ионогенное состояние белка при рН 4.2 близок к физиологическому и, таким образом, имеет нативную структуру.

Обсуждение

Сравнение структур RIP2 CARD крысы и человека

Как только структура RIP2CARD будет определена, было бы интересно сравнить ее с другими известными структурами CARD, чтобы найти детерминанты как укладки, так и активности белка. Во-первых, мы сравнили полученную структуру с недавно опубликованной конформацией RIP2 CARD человека (PDB ID 2N7Z, [13]) (рис. 4А).Белки человека и крысы в ​​высокой степени гомологичны только с четырьмя заменами, три из которых являются синонимами. Две структуры оказались практически идентичными, при этом среднеквадратичное отклонение магистрали равно 1,3 А. Это низкое значение, но оно превышает среднеквадратичное отклонение в наборе расчетных структур. С другой стороны, мы обнаружили одно существенное отличие: в то время как в нашей структуре пептидная связь Q517-P518 находилась в конфигурации цис , что полностью подтверждается экспериментальными данными, этого не наблюдается в CARD человека.Это различие приводит к значительному отклонению конформации С-концевой области между двумя структурами (рис. 4В). Мы утверждаем, что разница является результатом ошибки в структуре 2N7Z. -цис- или -транс--конфигурацию пептидной связи X-Pro легко установить по различию химических сдвигов ядер Cβ и Cγ остатка Pro [33]. Мы наблюдаем разницу в 10,1 м.д. (4,1–4,7 м.д. для остальных 4 остатков транс Pro RIP2CARD), что соответствует 100% вероятности конфигурации цис .Точно так же химические сдвиги, депонированные с записью PDB 2N7Z, сообщают о разнице Cβ-Cγ P86 (гомологичной P518 в RIP2CARD) до 10 ppm, что определенно соответствует состоянию цис-. Таким образом, связь Q85-P86 в 2N7Z также должна находиться в состоянии -цис-, но это не так. Другими словами, структура 2N7Z ошибочна в области С-концевого хвоста, так как авторы не смогли распознать -цис--конфигурацию пептидной связи Q85-P86 и она считалась в состоянии -транс- по умолчанию.

Рис. 4. Сравнение структур доменов RIP2 CARD человека (бледно-зеленый, розовый, пурпурный) и крысы (желтый, красный, синий), о которых сообщается здесь и в работе Лин и др. [13].

A,B,C — наложение структур в ленточном представлении. B демонстрирует другую конформацию пептидной связи P518. C показывает различия в положениях заряженных остатков в h2. D— структура RIP2CARD с указанными и назначенными остатками, которые важны для правильной упаковки С-концевых остатков.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0206244.g004

Кроме того, в области излома h2 наблюдаются небольшие отличия. В 2N7Z остаток, соответствующий R443 в RIP2CARD, направлен немного наружу. Он разрушает солевой мостик с D491, который не образуется в указанной структуре, а его наличие подтверждается нашим анализом рН-титрования (рис. 4С). Эти незначительные отклонения, скорее всего, являются результатом разного подхода к расчету конструкции, использованного в настоящей работе и в работе Лина и др.Модель 2N7Z основана исключительно на данных NOE, в то время как мы полагаемся на 123 дополнительных J-соединения, которые обеспечивают более точную локальную конформацию как основной цепи, так и боковых цепей. Таким образом, структура 2N7Z содержит существенную ошибку и меньше определяется экспериментальными данными, поэтому данную структуру необходимо использовать для моделирования гомологии, докинга и анализа белок-белковых взаимодействий.

Гомологичные домены CARD

Помимо человеческой RIP2 CARD, мы обнаружили несколько очень похожих структур других CARD, включая NOD1 CARD (идентификатор PDB: 4E9M, RMSD: 1.4A), ARC (белок цитоскелета, связанный с активностью, 4UZ0, 1,8A), ингибитор генерации IL-1β Iceberg (1GDN, 2,1 A), NLRP1 (3KAT, 1,9 A) и APAF1 (5WVC, 2,1 A). Несмотря на различные функции, эти белки обнаружили удивительную идентичность своей CARD-конформации (положение и длина спиралей h2-H5). Чтобы найти мотивы последовательности, отвечающие за складку CARD, мы провели простой биоинформационный анализ. Мы выровняли последовательности нескольких CARD белков RIP2 разных видов и выровняли перечисленные CARD с разной функцией, но схожей укладкой, на основе трехмерных структур (рис. 5).Оказалось, что большинство консервативных остатков в этом наборе данных являются гидрофобными и образуют ядро ​​доменов CARD. Однако во всех доменах CARD обнаружены два заряженных остатка — аргинин, соответствующий R443, и аспартат, соответствующий D460. Первоначально мы предположили, что R443 необходим для стабилизации перегиба в спирали h2 за счет солевого мостика с D491, однако в ARC1, NLRP1 и APAF1 такого взаимодействия не наблюдается, а перегиб h2 сохраняется. По-видимому, эти остатки имеют функциональное значение.Основная функция КАРТ — участие во взаимодействиях КАРТА-КАРТА или КАРТА-ДД. Известно, что эти взаимодействия имеют ионную природу: поверхности большинства КАРД обнаруживают выраженную асимметрию электростатических свойств — наблюдаются протяженные положительно и отрицательно заряженные области (б-грань и а-грань) [34]. В случае RIP2CARD b-грань образована остатками R443 и R487, которые также сохраняются в большинстве доменов CARD. А-грань обеспечивается D460 и кластером анионных боковых цепей E471-E474, эти остатки, как было показано, важны для взаимодействий RIP2 CARD с доменами NOD1 и NOD2 CARD [15].Таким образом, общая укладка домена CARD определяется распределением полярных/гидрофобных свойств аминокислотных остатков, а не заряженных остатков, отвечающих за функцию домена.

Рис. 5. Гомологи RIP2CARD.

Вверху аминокислотные последовательности гомологичных белкам RIP2 RIPK2 крысы выровнены с последовательностью RIP2CARD. Внизу домены CARD белков с другими функциями выровнены на основе гомологии 3D-структуры, по данным сервера PDBefold, указаны идентификаторы PDB.Консервативные остатки выделены в зависимости от их физических свойств (желтый — гидрофобный, синий — положительно заряженный, красный — отрицательно заряженный, зеленый — полярный или нейтральный). Линиями показаны солевые мостики, наблюдаемые в структуре RIP2CARD. Красные, пурпурные, синие и голубые кружки обозначают остатки, которые оказались важными для взаимодействий RIP2-p75 человека [13], NOD2/RIP2, RIP2/NOD1/NOD2 и исключительно RIP2/NOD1 [15]. Коричневым кружком обозначены остатки, важные для уникальной упаковки С-концевых остатков RIP2CARD.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0206244.g005

Глядя на последовательности доменов RIP2 CARD, мы обнаружили, что они очень консервативны. CARD RIP2 имеет уникальную укладку — вместо шестой спирали, как и в большинстве других доменов CARD, он содержит неструктурированный, но стабильный С-концевой участок, плотно упакованный относительно спиралей h2 и H5. Конформация хвоста поддерживается стэкингом между ароматическими кольцами W438 и Y519, π-катионными взаимодействиями последнего с K509 и гидрофобными контактами L516, I434 и V522.Как видно, W438, L516 и фрагмент 518-P[Y,F]P высококонсервативны в большинстве доменов RIP2 CARD, что позволяет предположить, что организация С-концевой области функционально важна и сохраняется у всех видов, экспрессирующих белок RIP2. . Однако есть несколько белков, обнаруженных у амфибий, рептилий и рыб, которые обозначены как RIP2, но обнаруживают низкую гомологию с белком млекопитающих и не имеют этих важных остатков. Более того, геном этих видов обычно содержит другой белок, аннотируемый как RIP2 и демонстрирующий все характерные черты CARD-домена млекопитающих.Это позволяет заключить, что эти отдаленные киназы RIP2 гомологичны белкам RIP2, но имеют другую структуру домена CARD и, по-видимому, других партнеров по функциям/взаимодействию. Таким образом, мотив, содержащий W на N-конце и L-X-P-[Y,F]-P на С-конце, характерен для CARD-доменов киназ RIP2, ответственных за их уникальную структуру. Что касается заряженных остатков, то можно заметить, что все остатки, ответственные за взаимодействие с NOD1 и NOD2, консервативны во всех доменах RIP2 CARD, а остатки, необходимые для связывания p75 [13], консервативны в основном в белках млекопитающих. .

Олигомеризация доменов CARD

Как мы уже говорили, CARD-домен RIP2 обладает внутренней склонностью к гомоолигомеризации при нейтральном pH. Наши данные позволяют провести численную оценку константы димеризации. Предполагая равновесие мономер-олигомер, в избытке олигомерного белка константа димеризации не должна превышать концентрацию мономера в растворе, которая ниже 10 мкМ при нейтральном рН. По-видимому, это свойство актуально и для RIP2 человека.В работе Lin et al. [13] это прямо не указано, но структура CARD-домена RIP2 человека была исследована в отсутствие буфера и неуказанного pH, в отличие от других белков в работе, которые изучались при явно указанном нейтральном pH. и в 30–50 мМ солевых буферах. Кроме того, в другой работе [15] сообщается о невозможности получения растворимого образца CARD-домена RIP2 человека и неправильной структуре белка после процедуры рефолдинга, однако протокол рефолдинга и используемые значения pH не приводятся.Эта склонность к олигомеризации может быть ограничена присутствием киназы и промежуточных доменов, поскольку известно, что полноразмерный белок RIP2 образует гомодимеры [11].

Можно предположить несколько причин олигомеризации RIP2CARD: дисульфидное сшивание, электростатические и гидрофобные взаимодействия. Дисульфидную сшивку можно было бы исключить: С454 находится в восстановленном состоянии, согласно химическому сдвигу Сβ ЯМР (25 м.д.) [35], и осаждение носит обратимый характер, что невозможно в случае образования ковалентной связи.Гидрофобные взаимодействия не согласуются со свойствами поверхности RIP2CARD — она сильно полярна. Таким образом, электростатические взаимодействия, вероятно, вызывают олигомеризацию RIP2, что хорошо согласуется с выраженным влиянием концентрации соли на растворимость RIP2CARD. Анализ поверхностного заряда RIP2CARD может помочь понять тенденцию домена к олигомеризации. Мы использовали подход Protein Surface Topography [27,28] для сравнения распределения электростатического потенциала на поверхности доменов NOD1 и RIP2 CARD (рис. 6).Карты показывают, что два домена существенно различаются. NOD1 CARD обеспечивает выраженную отрицательно заряженную (a-face) поверхность и менее выраженный положительно заряженный участок (b-face), причем последний принимает участие во взаимодействии NOD1/RIP2. Напротив, поверхность RIP2CARD довольно неоднородна. Можно наблюдать по крайней мере три сильно положительно заряженных поверхности RIP2CARD вместе с заметной а-гранью, которая включает два пересекающихся интерфейса для домена гибели p75 и NOD1/NOD2 CARD. Помимо вытянутой а-грани, у исследуемого белка могут быть обнаружены несколько отрицательно заряженных пятен.Возможно, такие электростатические параметры позволяют RIP2CARD образовывать множественные белок-белковые контакты в различной ориентации. Это отражается в чрезвычайно высокой вязкости растворов RIP2CARD при pH выше 5,5.

Рис. 6. Электростатические параметры RIP2CARD и NOD1 CARD.

Показаны карты распределения электростатического потенциала на поверхности Ван-дер-Ваальса доменов NOD1 CARD (вверху) и RIP2 CARD. Две молекулы были выровнены на основе их структур.Красные области соответствуют отрицательному заряду, а синие — положительному. Области поверхности белков, участвующие или, возможно, участвующие в различных типах белок-белковых взаимодействий, обозначены пунктирными эллипсами.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0206244.g006

Заключение

В настоящей работе мы сообщаем о экспрессии с высоким выходом, протоколе рефолдинга и разрешаем структуру домена RIP2 CARD крысы, участвующего в различных сигнальных событиях в клетке.Полученная структура обнаруживает несколько важных отличий от ранее опубликованной конформации гомологичного белка человека. Используя растворный ЯМР, мы охарактеризовали внутримолекулярную подвижность и рН-зависимое поведение RIP2 CARD и обнаружили склонность белка образовывать олигомеры высокого порядка при физиологическом рН, будучи мономерным в кислой среде. Олигомеризацию белка можно объяснить, исходя из электростатических свойств его поверхности. Анализ полученной структуры и последовательностей гомологичных белков выявляет остатки, значимые для необычной укладки доменов RIP2 CARD разных видов.Разработка высокопроизводительного протокола рефолдинга вместе с продукционной системой на основе клеток E. coli и выявленными причинами олигомеризации белков дает возможность конструировать стабилизированные варианты доменов RIP2 CARD, которые можно использовать для изучения структурных деталей Взаимодействие RIP2/NOD1/NOD2 и рациональный дизайн лекарств.

Вспомогательная информация

S1 Рис. Экспрессия белка слитых конструкций RIP2CARD.

Целоклеточные лизаты и растворимые белковые фракции (после центрифугирования при 14000 g) анализировали с использованием 12% геля SDS-PAGE.Клетки выращивали при 28°C до тех пор, пока культура не достигала OD600 ~0,6, и экспрессию белков индуцировали с помощью IPTG (0, 0,1 и 1 мМ), затем культивирование продолжали в течение ночи при 37°C и 13°C. Для оценки растворимости белка клеточный осадок ресуспендировали в буфере (20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 100 мМ NaCl, 100 мМ ФМСФ, 1 мМ ЭДТА, 0,5% Тритон Х-100), лизировали ультразвуком на льду и центрифугировали при 14000 г за 20 минут. На каждой дорожке анализировали по 20 мкл культуры. Интересующие белки указаны стрелками.AD: анализ конструкций тиоредоксина, SUMO, GST и His-метки RIP2CARD соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0206244.s001

(TIF)

S2 Рис.

1 H, 15 Спектры N-HSQC 300 мкМ RIP2CARD, полученные при 30°C, pH 3,3, 4,0 и 5,1.

Спектры записаны одинаково и построены с одинаковыми параметрами контура. Часть пиков, которые появляются из-за частичного pH-индуцированного разворачивания RIP2CARD, указаны на левой панели.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0206244.s002

(TIF)

S3 Рис. Структура RIP2CARD одинакова при pH 4,2 и 6,0.

Фрагменты спектров RIP2CARD 1 H, 15 N-HSQC (A) и 1 H, 13 C-HSQC (B), записанных при pH 4,2 (красный) и 6,0 (синий). При изменении положения некоторых амидных кросс-пиков за счет депротонирования боковых цепей Asp и Glu сохраняется картина кросс-пиков метильных групп, что подтверждает идентичность доменной структуры при умеренно кислом и нейтральном рН.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0206244.s003

(TIF)

Каталожные номера

  1. 1. Хамфрис Ф., Ян С., Ван Б., Мойна П.Н. Киназы RIP: ключевые факторы, влияющие на гибель клеток и врожденный иммунитет. Смерть клеток 2015; 22: 225–236. пмид:25146926
  2. 2. Маккарти Дж.В., Ни Дж., Диксит В.М. RIP2 представляет собой новую киназу, активирующую NF-kappaB и вызывающую гибель клеток. Дж. Биол. Хим. 1998; 273: 16968–16975. пмид:9642260
  3. 3.Хурсигара Г., Бертин Дж., Яно Х., Моффетт Х., ДиСтефано П.С., Чао М.В. Функция выживания для домена гибели рецептора p75, опосредованная белком, взаимодействующим с рецептором домена рекрутирования каспазы 2. J Neurosci. 2001; 21: 5854–5863. пмид:11487608
  4. 4. Пак Дж. Х., Ким Ю. Г., Макдональд С., Каннеганти Т. Д., Хасегава М., Боди-Малапель М. и др. RICK/RIP2 опосредует врожденные иммунные ответы, индуцированные Nod1 и Nod2, но не TLR. Дж Иммунол. 2007; 178: 2380–2386. пмид:17277144
  5. 5.Джун Дж.С., Коминелли Ф., Эбботт Д.В. Активность RIP2 при воспалительных заболеваниях и значение для новых терапевтических средств. Дж. Лейкок Биол. 2013; 94: 927–932. пмид:23794710
  6. 6. Park HH, Lo YC, Lin SC, Wang L, Yang JK, Wu H. Суперсемейство доменов смерти во внутриклеточной сигнализации апоптоза и воспаления. Анну Рев Иммунол. 2007; 25: 561–586. пмид:17201679
  7. 7. Навас Т.А., Болдуин Д.Т., Стюарт Т.А. RIP2 представляет собой Raf1-активируемую митоген-активируемую протеинкиназу.Дж. Биол. Хим. 1999; 274: 33684–33690. пмид:10559258
  8. 8. Nembrini C, Kisielow J, Shamshiev AT, Tortola L, Coyle AJ, Kopf M, et al. Киназная активность Rip2 определяет его стабильность и, следовательно, Nod1- и Nod2-опосредованные иммунные ответы. Дж. Биол. Хим. 2009; 284: 19183–19188. пмид:19473975
  9. 9. Abbott DW, Wilkins A, Asara JM, Cantley LC. Белку болезни Крона, NOD2, требуется RIP2, чтобы вызвать убиквитинилирование нового сайта на NEMO. Карр Биол.2004; 14: 2217–2227. пмид:15620648
  10. 10. Ogura Y, Inohara N, Benito A, Chen FF, Yamaoka S, Nunez G. Nod2, член семейства Nod1/Apaf-1, который ограничен моноцитами и активирует NF-kappaB. Дж. Биол. Хим. 2001; 276: 4812–4818. пмид:11087742
  11. 11. Пеллегрини Э., Синьор Л., Сингх С., Боэри Эрба Э., Кьюсак С. Структуры неактивного и активного состояний киназы RIP2 информируют о механизме активации. ПЛОС Один. 2017;12. пмид:28545134
  12. 12.Каннинг П., Руан К., Шверд Т., Хрдинка М., Маки Дж. Л., Салех Д. и др. Воспалительная передача сигналов с помощью NOD-RIPK2 ингибируется клинически значимыми ингибиторами киназы типа II. Воспалительная передача сигналов с помощью NOD-RIPK2 ингибируется клинически значимыми ингибиторами киназы типа II. хим. биол. 2015;22, 22: 1174, 1174–1184. пмид:26320862
  13. 13. Lin Z, Tann JY, Goh ETH, Kelly C, Lim KB, Gao JF и др. Структурная основа передачи сигналов домена смерти в рецепторе нейротрофина p75. Элиф.2015;4: e11692. пмид:26646181
  14. 14. Манон Ф., Фавье А., Нуньес Г., Симорре Дж. П., Кьюсак С. Структура раствора NOD1 CARD и мутационный анализ ее взаимодействия с CARD нижестоящей киназы RICK. Журнал молекулярной биологии. 2007; 365: 160–174. пмид:17054981
  15. 15. Фрид В., Риттингер К. Тандемные CARD NOD2: внутримолекулярные взаимодействия и распознавание RIP2. ПЛОС ОДИН. 2012;7: e34375. пмид:22470564
  16. 16. Харалампопулос И., Викарио А., Педиадитакис И., Граванис А., Сими А., Ибаньес С.Ф.Генетическое рассечение передачи сигналов нейротрофина через рецептор нейротрофина p75. Cell Rep. 2012; 2: 1563–1570. пмид:23260665
  17. 17. Первушин К., Риек Р., Видер Г., Вютрих К. Оптимизированная для поперечной релаксации спектроскопия (TROSY) для ЯМР-исследований ароматических спиновых систем в 13C-меченых белках. J Am Chem Soc. 1998; 120: 6394–6400.
  18. 18. Лёр Ф., Хензель Р., Рогов В.В., Дётч В. Улучшенные последовательности импульсов для специфичного для последовательности назначения ароматических протонных резонансов в белках.Дж Биомол ЯМР. 2007; 37: 205–224. пмид:17237975
  19. 19. Фавье А., Бручер Б. Восстановление утраченной намагниченности: усиление поляризации в биомолекулярном ЯМР. Дж Биомол ЯМР. 2011; 49: 9–15. пмид:211

  20. 20. Казимерчук К, Орехов ВЮ. Сравнение выпуклого и невыпуклого сжатого зондирования применительно к многомерному ЯМР. Джей Магн Резон. 2012; 223: 1–10. пмид:22960668
  21. 21. Вуистер Г.В., Бакс А. Количественная корреляция J: новый подход к измерению гомоядерной тройной связи J(HNH.альфа.) константы связывания в 15N-обогащенных белках. J Am Chem Soc. 1993; 115: 7772–7777.
  22. 22. Grzesiek S, Vuister GW, Bax A. Простой и чувствительный эксперимент по измерению связей JCC между карбонильными и метильными атомами углерода основной цепи в белках, обогащенных изотопами. Журнал биомолекулярного ЯМР. 1993;3: 487–493. пмид:8400833
  23. 23. Vuister GW, Wang AC, Bax A. Измерение трехсвязных азот-углеродных соединений J в белках, равномерно обогащенных азотом-15 и углеродом-13.Журнал Американского химического общества. 1993; 115: 5334–5335.
  24. 24. Гюнтерт П., Бюхнер Л. Комбинированное автоматизированное назначение NOE и расчет структуры с помощью CYANA. Дж Биомол ЯМР. 2015; 62: 453–471. пмид:25801209
  25. 25. Чилл Дж. Х., Луис Дж. М., Бабер Дж. Л., Бакс А. Измерение релаксации 15N в солюбилизированном детергентом тетрамерном калиевом канале KcsA. Дж Биомол ЯМР. 2006; 36: 123–136. пмид:17013683
  26. 26. Коради Р., Биллетер М., Вютрих К.МОЛМОЛ: программа для отображения и анализа макромолекулярных структур. Дж Мол График. 1996; 14: 51–55, 29–32. пмид:8744573
  27. 27. Коромыслова А.Д., Чугунов А.О., Ефремов РГ. Расшифровка тонких молекулярных деталей структуры и функции белков с помощью метода топографии поверхности белка (PST) . Журнал химической информации и моделирования. 2014; 54: 1189–1199. пмид:24689707
  28. 28. Чугунов А.О., Коромыслова А.Д., Беркут А.А., Пеньер С., Тытгат Ю., Полянский А.А. и др.Модульная организация α-токсинов из яда скорпиона отражает доменную структуру их мишеней, натриевых каналов. Журнал биологической химии. 2013; 288: 19014–19027. пмид:23637230
  29. 29. Линдорф-Ларсен К., Пиана С., Палмо К., Марагакис П., Клепеис Дж.Л., Дрор Р.О. и соавт. Улучшенные торсионные потенциалы боковой цепи для силового поля белка Amber ff99SB. Белки. 2010; 78: 1950–1958 гг. пмид:20408171
  30. 30. Аракава Т., Эдзима Д., Цумото К., Обаяма Н., Танака Ю., Кита Ю. и др.Подавление белковых взаимодействий аргинином: предполагаемый механизм эффектов аргинина. Биофиз хим. 2007; 127: 1–8. пмид:17257734
  31. 31. Парк ХХ. Структурный анализ доменов смерти и их взаимодействия. Апоптоз. 2011; 16: 209–220. пмид:21207148
  32. 32. Wimley WC, белый SH. Экспериментально определенная шкала гидрофобности белков на границе раздела мембран. Nat Struct Biol. 1996;3: 842–848. пмид:8836100
  33. 33. Шуберт М., Лабудде Д., Ошкинат Х., Шмидер П.Программный инструмент для прогнозирования конформаций пептидной связи Xaa-Pro в белках на основе статистики химического сдвига 13C. Дж Биомол ЯМР. 2002; 24: 149–154. пмид:12495031
  34. 34. Махарана Дж., Прадхан С.К., Де С. NOD1CARD может использовать несколько интерфейсов для RIP2-опосредованного взаимодействия CARD-CARD: результаты молекулярно-динамического моделирования. ПЛОС Один. 2017;12. пмид:28114344
  35. 35. Шарма Д., Раджаратнам К. Химические сдвиги ЯМР 13С могут предсказать образование дисульфидной связи.Дж Биомол ЯМР. 2000; 18: 165–171. пмид:11101221
.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.

2022 © Все права защищены.